ALLEGATO
PROVE SIEROLOGICHE PER LA DIAGNOSI
DELLA BRUCELLOSI BOVINA
Le prove sierologiche per la diagnosi della brucellosi dei bovini
sono rappresentate dalle reazioni di siero-agglutinazione rapida con
antigene al rosa bengala e di fissazione del complemento, e sono
utilizzate per il controllo degli allevamenti bovini secondo quanto
disposto nella parte B del presente allegato.
Parte A
Siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa bengala (SAR-Ag:
RB).
La reazione di SAR-Ag: RB deve essere applicata secondo le seguenti
norme tecniche:
1) Il siero di riferimento comunitario e' rappresentato da
secondo siero internazionale standard anti-Brucella abortus (2nd
ISaBS), fornito dal Central Veterinary Laboratory di Weybridge,
Surrey, Inghilterra, contenente 1000 unita' internazionali
agglutinanti per millilitro.
2) Il siero nazionale standard per il controllo della reazione
deve essere calibrato sul 2nd ISaBS di Weybridge, deve essere di
origine bovina e fornito liofilizzato; il siero nazionale standard
deve essere unico per tutte e due le reazioni sierologiche previste
dal presente allegato.
3) Il siero di lavoro, di origine bovina, per il controllo
giornaliero della reazione deve essere calibrato sul siero nazionale
standard.
4) L'antigene al rosa bengala e' unico su tutto il territorio
nazionale e deve essere:
- preparato con il ceppo B. abortus 99 (Waybridge), in fase S,
previa clonazione;
- sospeso in tampone deve avere pH 3,65 (Piu' o Meno) 0,05 e
essere colorato mediante rosa bengala;
- controllato nei confronti di otto sieri liofilizzati
riconosciuti rispettivamente positivi e negativi;
- standardizzato in modo da dare una agglutinazione visibile
alla diluizione 1: 47,5 e non dare agglutinazione alla diluizione 1:
50 del 2nd ISaBS di Weybridge, (GB);
- fornito pronto per l'uso; sull'etichetta di confezionamento
deve riportare la dicitura pronto per l'uso, la data di scadenza e il
numero del controllo ufficiale.
5) La reazione di SAR-Ag: RB deve essere effettuata nel modo
seguente:
- porre una goccia (0,03 ml) di antigene a fianco di una goccia
(0,03 ml) del siero nativo in esame su di una piastra bianca;
- mescolare i due reagenti con una bacchetta di vetro o
plastica, prima in linea retta, poi tracciando dei cerchi del
diametro di 20-30 mm, circa;
- agitare manualmente la piastra con movimenti circolari oppure
servendosi di un agitatore a movimenti rotatori, a velocita' di circa
trenta movimenti al minuto, per almeno quattro minuti;
- leggere la reazione in buone condizioni di illuminazione: in
mancanza di agglutinati la reazione sara' considerata negativa mentre
in presenza di qualsiasi grado di agglutinazione la reazione e'
considerata positiva, salvo quando appare chiara un'eccessiva
essiccazione ai margini della reazione.
6) La siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa bengala
puo' essere allestita con apparecchiature automatiche.
7) La sorveglianza ed il controllo ufficiale del siero nazionale
standard e dell'antigene sono effettuati dall'Istituto superiore di
sanita', su ogni serie prodotta.
Fissazione del complemento (F.d.C.).
La reazione di fissazione del complemento deve essere applicata
secondo le seguenti norme tecniche:
1) Il siero di riferimento comunitario e' il secondo siero
internazionale standard anti-B. abortus (2nd ISaBS) di Weybridge,
contenente 1000 unita' internazionali fissanti il complemento per
millilitro (UIFC/ml).
2) Il siero nazionale standard per il controllo della reazione
deve essere calibrato sul 2nd ISaBS di Weybridge, ed essere quello
adottato SAR-Ag: RB.
3) Il siero di lavoro, di origine bovina, per il controllo
giornaliero della reazione deve essere calibrato sul siero nazionale
standard.
4) Un siero in esame contiene venti o piu' unita' internazionali
fissanti il complemento per millilitro e' considerato positivo.
5) L'antigene e' "unico" su tutto il territorio nazionale e deve
essere:
- preparato con il ceppo B. abortus 99 (Weybridge), in fase S,
previa clonazione;
- sospeso in soluzione fisiologica salina (0,85 NaCl) e fenolato
allo 0,5%;
- standardizzato rispetto al secondo siero internazionale
standard anti-B. abortus di Weybridge (2nd ISaBS);
- fornito concentrato; sull'etichetta di confezionamento deve
riportare la diluizione d'uso, la data di scadenza ed il numero di
controllo ufficiale.
6) La reazione di F.d.C. deve essere effettuata secondo il
seguente schema unificato:
a) inattivare i sieri bovini, nativi o prediluiti, a 58 °C per
trenta minuti;
b) diluire per raddoppio i sieri inattivati;
c) distribuire l'antigene alla diluizione d'uso;
d) distribuire due unita' di complemento;
e) agitare e porre in incubazione a 37 °C per trenta minuti;
f) aggiungere il sistema emolitico contenente due unita' di
emolisina ed una concentrazione del 2% di globuli rossi lavati, pari
a 5,4 x 10fB0128 cellule per millilitro;
g) allestire i seguenti controlli di reazione:
- controllo del potere anticomplementare dei sieri;
- controllo dell'antigene;
- controllo del sistema emolitico;
- controllo delle unita' di complemento utilizzate;
- controllo percentuali di emolisi per la lettura finale;
- controllo del siero nazionale standard e/o del siero di
lavoro positivo;
- controllo del siero negativo;
i) agitare e porre in incubazione a 37 °C per trenta minuti;
l) verificare la qualita' dei controlli;
m) leggere il titolo dei sieri in esame rappresentato dalla
piu' alta diluizione che ha determinato il 50% di emolisi o di
fissazione, e trasformare il titolo in unita' internazionali fissanti
il complemento.
7) La reazione puo' essere allestita con apparecchiature
automatiche purche' resti sensibile ed esatta.
8) La sorveglianza ed il controllo ufficiale del siero nazionale
standard e dell'antigene "unico" sono effettuati dall'Istituto
superiore di sanita', su ogni serie prodotta.
Parte B
APPLICAZIONI PRATICHE
Fissazione del complemento (F.d.C.).
Dotata di ottima sensibilita' e specificita', e' da considerare il
saggio di base e di riferimento e come tale puo' trovare applicazione
in tutti i casi in cui, nel presente regolamento, si fa menzione ad
"esame(i) sierologico(i) ufficiale(i)". In particolare, il suo
impiego si impone per il riconoscimento di "allevamento indenne da
brucellosi" (art. 16, comma A, lettere b) e c) e per il
riaccreditamento degli allevamenti indenni sospetti di reinfezione
(art. 16, comma C, punto 1, lettere a) e b).
Per le bovine vaccinate con Buck 19 e di eta' inferiore a 18 mesi
e' tollerato un titolo di positivita', a questa prova, fino a 30
UIFC/ml.
Sieroagglutinazione rapida con antigene al rosa bengala (SAR-Ag: RB).
Per la sua elevata sensibilita', puo' trovare impiego in ogni
situazione prevista dal presente regolamento, ad esclusione dei casi
specifici piu' sopra indicati nei quali deve preferirsi il ricorso al
F.d.C. Tutti i sieri positivi alla SAR-Ag: RB devono essere saggiati
con la F.d.C. per la conferma.
Criteri interpretativi.
Poiche' ai fini del risanamento dalla brucellosi bovina, F.d.C. e
SAR-Ag: RB rappresentano i test di scelta per la identificazione
degli animali infetti, in soggetti non sottoposti a vaccinazione sono
da prevedere le seguenti eventualita':
SAR-Ag: RB negativa e F.d.C. negativa = animale indenne;
SAR-Ag: RB positiva e F.d.C. negativa = animale sospetto (*);
SAR-Ag: RB negativa e F.d.C. positiva = animale infetto;
SAR-Ag: RB positiva e F.d.C. positiva = animale infetto.
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(*) Controllo da ripetere.