ALLEGATO
I. INDIVIDUAZIONE E DOSAGGIO DELL'ACIDO BENZOICO, DELL'ACIDO 4-
IDROSSIBENZOICO, DELL'ACIDO SORBICO, DELL'ACIDO SALICILICO E
DELL'ACIDO PROPIONICO NEI COSMETICI
1. Oggetto e campo di applicazione
Il metodo ha per oggetto l'individuazione e il dosaggio
dell'acido benzoico, dell'acido 4-idrossibenzoico, dell'acido
sorbico, dell'acido salicilico e dell'acido propionico nei
cosmetici. Con procedure separate sono descritti
l'individuazione di questi conservanti, il dosaggio
dell'acido propionico e il dosaggio dell'acido
4-idrossibenzoico, dell'acido salicilico, dell'acido sorbico
e dell'acido benzoico.
2. Definizione
I contenuti di: acido benzoico, acido 4-idrossibenzoico,
acido salicilico, acido sorbico e acido propionico
determinati con questo metodo sono espressi come percentuale,
rispetto alla massa degli acidi liberi.
A. INDIVIDUAZIONE
1. Principio
Dopo l'estrazione acido/base dei conservanti, l'estratto e'
analizzato mediante TLC e derivatizzazione su piastra. A
seconda dei risultati ottenuti, l'identificazione e'
confermata mediante HPLC, oppure - nel caso dell'acido
propionico - mediante GC.
2. Reagenti
2.1. Tutti i reagenti devono avere il grado di purezza richiesto
per analisi. Si dovra' impiegare acqua distillata, oppure
acqua di purezza almeno equivalente.
2.2. Acetone.
2.3. Etere dietilico.
2.4. Acetonitrile.
2.5. Toluene.
2.6. n-Esano.
2.7. Paraffina liquida.
2.8. Acido cloridrico, 4M.
2.9. Idrossido di potassio, 4M in acqua.
2.10. Cloruro di calcio, Ca Cl2 2H2 O.
2.11. Carbonato di litio, Li2 CO3.
2.12. 2-Bromo-2'-acetonaftone.
2.13. Acido 4-idrossibenzoico.
2.14. Acido salicilico.
2.15. Acido benzoico.
2.16. Acido sorbico.
2.17. Acido propionico.
2.18. Soluzioni di riferimento.
Preparare soluzioni allo 0,1% (m/v) di ciascuno dei cinque
conservanti (da 2.13 a 2.17) in etere dietilico.
2.19. Reagente di derivatizzazione
Soluzione allo 0,5% (m/v) di 2-bromo-2'-acetonaftone (2.12)
in acetonitrile (2.4) (50 mg/10 ml). Questa soluzione deve
essere preparata ogni settimana e conservata in frigorifero.
2.20. Soluzione di catalizzazione
Soluzione allo 0,3% (m/v) di carbonato di litio (2.11) in
acqua (300 mg/100 ml). Questa soluzione deve essere preparata
al momento.
2.21. Solvente di sviluppo
Toluene (2.5)/Acetone (2.2) (20:0,5, v/v).
2.22. Paraffina (2.7)/n-Esano (2.6) (1:2, v/v).
3. Apparecchiature
Attrezzature per uso normale di laboratorio.
3.1. Bagno ad acqua, in grado di mantenere la temperatura di 60
gradi C.
3.2. Vaschetta di sviluppo.
3.3. Fonte di luce ultravioletta, 254 e 366 nm.
3.4. Lastra per cromatografia su strato sottile, Kieselgel 60,
senza indicatore di fluorescenza, 20 x 20 cm, strato 0,25 mm,
con zona di concentrazione da 2,5 x 20 cm. (Merck 11845, o
equivalente).
3.5. Microsiringa, 10 micro l.
3.6. Microsiringa, 25 micro l.
3.7. Forno, in grado di mantenere temperature fino a 105 gradi C.
3.8. Provette in vetro da 50 ml, con tappo a vite.
3.9. Filtri di carta, diametro 90 mm, Schleicher & Schull,
Weissband n. 5892, o equivalenti.
3.10. Cartine universali per il rilevamento del pH, per valori
dello stesso compresi tra 1 e 11.
3.11. Flaconcini in vetro da 5 ml per campionature.
3.12. Evaporatore rotante (Rotavapor o equivalente).
3.13. Piastra riscaldante.
4. Procedura
4.1. Preparazione del campione
Pesare circa 1 grammo di campione in una provetta di vetro da
50 ml con tappo a vite (3.8). Aggiungere 4 gocce di acido
cloridrico 4M (2.8) e 40 ml di acetone (2.2). Per i prodotti
di elevata basicita' quali i saponi da toilette, aggiungere
20 gocce di acido cloridrico 4M (2.8.). Controllare che il
valore del pH sia prossimo a 2, servendosi dell'apposita
cartina (3.10). Chiudere la provetta e agitare vigorosamente
per un minuto.
Se necessario, per facilitare l'estrazione dei conservanti
nella fase di acetone, riscaldare gradualmente la miscela
fino a 60 gradi C, in modo da fare fondere la fase lipidica.
Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e filtrare su
un filtro di carta (3.9) in una beuta conica. Trasferire 20
ml di filtrato in una beuta conica da 200 ml, aggiungere 20
ml di acqua e mescolare. Regolare il pH della miscela in
prossimita' del valore 10, servendosi di idrossido di
potassio 4M (2.9). Impiegare l'apposita cartina (3.10) per
misurare il pH.
Aggiungere 1 g di cloruro di calcio (2.10) ed agitare
vigorosamente. Filtrare sul filtro di carta (3.9) in un
imbuto di separazione da 250 ml contenente 75 ml di etere
dietilico (2.3) e agitare vigorosamente per un minuto. Dopo
separazione, raccogliere lo strato acquoso in una beuta
conica. Scartare lo strato di etere. Servendosi dell'apposita
cartina (3.10), regolare il pH della soluzione acquosa a
circa 2 mediante acido cloridrico 4M (2.8). Aggiungere poi 10
ml di etere dietilico (2.3), chiudere la beuta e agitare
vigorosamente per un minuto. Dopo separazione, trasferire lo
strato di etere in un evaporatore rotante per film (3.12) e
scartare lo strato acquoso.
Far evaporare l'etere e riprendere il residuo in 1 ml di
etere dietilico (2.3). Trasferire la soluzione ottenuta in un
flaconcino di vetro (3.11).
4.2. Cromatografia su strato sottile
Su ciascuno dei punti di deposito delle soluzioni di
riferimento e dei campioni che saranno sottoposti a
cromatografia, applicare circa 3 micro l di soluzione di
carbonato di litio (2.20) con una microsiringa (3.5) a
distanze uguali sulla linea di partenza nella zona di
concentrazione di una lastra per TLC (3.4) e procedere
all'essicazione mediante corrente di aria fredda.
Trasferire la lastra per TLC su una piastra (3.13),
riscaldata a 40 gradi C, in modo da mantenere le dimensioni
delle macchie quanto piu' limitate possibile. Con una
microsiringa (3.5) applicare 10 micro l di ciascuna delle
soluzioni di riferimento (2.18) e la soluzione campione (4.1)
sulla linea di partenza della piastra, proprio sui punti
esatti in cui e' stata applicata la soluzione di carbonato di
litio.
Applicare infine circa 15 micro l di reagente di
derivatizzazione (2.19) (soluzione di
2-bromo-2'-acetonaftone), anche in questo caso sui punti
esatti in cui sono state poste le soluzioni di
riferimento/campione e la soluzione di carbonato di litio.
Riscaldare la lastra per TLC in un forno (3.7) a 80 gradi C
per 45 minuti, A raffreddamento avvenuto, sviluppare la
lastra in una vaschetta (3.2) dopo averla equilibrata per 15
minuti (senza impiegare rivestimenti in carta da filtro),
servendosi di solvente per sviluppo 2.21 (toluene/acetone),
fino a quando il fronte del solvente ha raggiunto la distanza
di 15 cm (circa 80 minuti).
Asciugare la lastra in una corrente di aria fredda ed
esaminare le macchie ottenute servendosi di una lampada UV
(3.3). Per migliorare le condizioni di fluorescenza delle
macchie meno evidenziate la lastra per TLC puo' essere
immersa in una soluzione di paraffina/n- esano (2.22).
5. Individuazione
Calcolare il valore Rf per ciascuna macchia.
Paragonare il Rf e il comportamento sotto irraggiamento UV
ottenuto per il campione con quello ricavato dalle soluzioni
di riferimento.
Formulare una conclusione preliminare riguardo alla presenza
e all'identita' dei conservanti rilevati. Eseguire l'HPLC
descritta al capitolo B, oppure, quando si e' accertata la
presenza di acido propionico, effettuare la GC descritta nel
capitolo C. Paragonare i tempi di ritenzione ottenuti con
quelli delle soluzioni di riferimento.
Combinare i risultati desunti dalla TLC e dalla HPLC o dalla
GC e basare l'individuazione finale dei conservanti presenti
nel campione sui risultati cosi' ottenuti.
B. DOSAGGIO DELL'ACIDO BENZOICO, DELL'ACIDO 4-IDROSSIBENZOICO,
DELL'ACIDO SORBICO E DELL'ACIDO SALICILICO
1. Principio
Ad avvenuta acidificazione, il campione viene estratto con
una miscela di etanolo ed acqua. Dopo filtraggio, si dosano i
conservanti mediante cromatografia in fase liquida ad alta
risoluzione.
2. Reagenti
2.1. Tutti i reagenti devono essere della purezza richiesta per
analisi e adatti all'HPLC, se del caso. Si dovra' impiegare
acqua distillata, o acqua di purezza almeno equivalente.
2.2. Etanolo anidro.
2.3. Acido 4-idrossibenzoico.
2.4. Acido salicilico.
2.5. Acido benzoico.
2.6. Acido sorbico.
2.7. Acetato di sodio (CH3 COONa.3H2 O).
2.8. Acido acetico, d20 4 = 1,05 g/ml.
2.9. Acetonitrile.
2.10. Acido solforico, 2M.
2.11. Idrossido di potassio in soluzione acquosa, 0,2M.
2.12. Acido 2-metossibenzoico.
2.13. Miscela etanolo/acqua.
Mescolare 9 volumi di etanolo (2.2) e 1 volume d'acqua (2.1).
2.14. Soluzione standard interno
Preparare una soluzione contenente circa 1 g di acido 2-
metossibenzoico (2.12) in 500 ml di miscela metanolo/acqua
(2.13).
2.15. Fase mobile per HPLC
2.15.1. Soluzione tampone: sciogliere 6,35 g di acetato di sodio
(2.7) e 20,0 ml di acido acetico (2.8) in 1 litro d'acqua e
mescolare.
2.15.2. Preparare la fase mobile mescolando 9 volumi della soluzione
tampone di acetato (2.15.1) e 1 volume di acetonitrile (2.9).
2.16. Soluzione madre di conservanti
Pesare con accuratezza circa 0,05 g di acido
4-idrossibenzonico (2.3), 0,2 g di acido salicilico (2.4),
0,2 g di acido benzoico (2.5) e 0,05 g di acido sorbico (2.6)
in una provetta graduata da 50 ml e diluire a volume con la
miscela etanolo/acqua (2.13). Porre la soluzione in
frigorifero. La soluzione e' stabile per una settimana.
2.17. Soluzione standard di conservanti
Prelevare dalla soluzione madre (2.16) rispettivamente: 8,00,
4,00, 2,00, 1,00 e 0,50 ml di liquido e trasferirli in
provette graduate da 20 ml. Aggiungere 10,00 ml di soluzione
di standard interno (2.14) e 0,5 ml di acido solforico 2M
(2.10). Completare a volume con la miscela etanolo/acqua
(2.13). Queste soluzioni devono essere preparate al momento.
3. Apparecchiature
Apparecchiature per uso normale di laboratorio, se non
altrimenti specificato, e:
3.1. Bagno ad acqua, regolato a 60 gradi C.
3.2. Cromatografo in fase liquida ad alta risoluzione, con
rilevatore UV a lunghezza d'onda variabile e sistema di
iniezione da 10 micro l.
3.3. Colonna per analisi
Acciaio inossidabile, lunghezza 12,5-25 cm, diametro interno
4,6 mm, riempita di Nucleosil 5 C18 o equivalente.
3.4.
Filtro di carta, diametro 90 mm, Schleicher & Schull,
Weissband n. 5892, o equivalenti.
3.5. Provette in vetro da 50 ml, con tappo a vite.
3.6. Flaconcini di vetro da 5 ml.
3.7. Granuli ebullioscopici di carborundum, dimensioni 2-4 mm o
equivalenti.
4. Procedimento
4.1. Preparazione dei campioni
4.1.1. Preparazione dei campioni senza aggiunta di soluzione di
standard interno
Pesare 1 g del campione in una provetta di vetro da 50 ml con
tappo a vite (3.5). Pipettare 1,00 ml di acido solforico 2.M
(2.10) e 40,0 ml di miscela etanolo/acqua (2.13) nella
provetta. Aggiungere circa 1 g di granuli ebullioscopici
(3.7), tappare la provetta e agitare vigorosamente per almeno
un minuto, fino a quando si ottiene una sospensione omogenea.
Per facilitare l'estrazione dei conservanti nella fase
etanolica, porre la provetta per 5 minuti esatti in un bagno
(3.1) di acqua a 60 gradi C.
Raffreddare immediatamente la provetta sotto acqua corrente
fredda e poi lasciare riposare l'estratto a 5 gradi C per
un'ora.
Filtrare l'estratto con un filtro di carta (3.4). Trasferire
circa 2 ml di estratto in un flaconcino (3.6). Far riposare
l'estratto a 5 gradi C ed eseguire il dosaggio mediante HPLC,
entro 24 ore dalla preparazione del medesimo.
4.1.2. Preparazione del campione con aggiunta di soluzione standard
di riferimento interno
Pesare fino alla terza cifra decimale 1 g piu' e meno 0,1 g
(a) del campione in una provetta di vetro da 50 ml con tappo
a vite (3.5). Pipettare 1,00 ml di acido solforico 2M (2.10)
e 30,0 ml di miscela etanolo/acqua (2.13). Aggiungere circa 1
g di granuli ebullioscopici (3.7) e 10,00 ml di soluzione
standard di riferimento interno (2.14). Tappare la provetta
e agitare vigorosamente per almeno un minuto, fino ad
ottenere una sospensione omogenea. Per facilitare
l'estrazione dei conservanti nella fase etanolica porre la
provetta per 5 minuti esatti in bagno d'acqua (3.1) mantenuta
a 60 gradi C.
Raffreddare immediatamente la provetta sotto acqua corrente
fredda e far riposare l'estratto a 5 gradi C per un'ora.
Filtrare l'estratto su un filtro di carta (3.4). Trasferire
circa 2 ml del filtrato cosi' estratto in un flaconcino
(3.6). Far riposare l'estratto a 5 gradi C ed eseguire il
dosaggio mediante HPLC entro 24 ore dalla preparazione.
4.2. Cromatografia in fase liquida ad alta risoluzione
Fase mobile: soluzione tampone acetato/acetonitrile (2.15).
Regolare il flusso della fase mobile attraverso la colonna a
2,0 ml/minuto piu' e meno 0,5 ml/minuto.
Regolare la lunghezza d'onda del rilevatore a 240 nm.
4.2.1. Taratura
Iniettare 10 micro l di ciascuna delle soluzioni standard di
conservanti (2.17) nel cromatografo in fase liquida (3.2):
Per ciascuna soluzione, determinare i rapporti fra le altezze
del picco dei conservanti sotto indagine e l'altezza del
picco della soluzione standard di riferimento interno
ottenuti dai cromatogrammi. Tracciare, per ciascun
conservante, un grafico che esprima il rapporto tra la
concentrazione di ciascuna soluzione standard ed il rapporto
delle aree misurate
Assicurarsi che si sia ottenuta una risposta lineare per le soluzioni
standard nella procedura di taratura.
4.2.2. Dosaggio
Inietta 10 micro l dell'estratto dal campione (4.1.1) nel
cromatografo in fase liquida (3.2) e registrare il
cromatogramma. Iniettare 10 micro l di soluzione standard di
conservante (2.17) e registrare il cromatogramma. Paragonare
i cromatogrammi ottenuti. Se nel cromatogramma dell'estratto
del campione (4.1.1) non si notano picchi aventi
approssimativamente lo stesso tempo di ritenzione dell'acido
2-metossibenzoico (standard di riferimento interno
raccomandato), iniettare 10 micro l di estratto di campione
preparato con addizione di soluzione standard di riferimento
interno (4.1.2) nel cromatografo in fase liquida e registrare
il cromatogramma.
Se si osserva un picco di interferenza nell'estratto dal
campione (4.1.1) nel cromatogramma, avente lo stesso tempo di
ritenzione dell'acido 2-metossibenzoico, si dovra' scegliere
un'altra soluzione standard di riferimento interno piu'
adatta. (Se si rileva l'assenza dal cromatogramma di uno dei
conservanti sotto indagine, sara' possibile impiegare tale
conservante come standard interno).
Assicurarsi che i cromatogrammi ottenuti per una soluzione
standard e per la soluzione campione soddisfino le seguenti
esigenze:
- la separazione dei picchi della coppia meno ben separata
deve essere pari ad almeno 0,90. (Per la definizione di
separazione dei picchi, vedi figura 1).
----> Vedere Figura 1 a pag. 53 della G.U. <----
Figura 1: Separazione dei picchi
Se non si ottiene la separazione richiesta, impiegare una
colonna piu' adatta, oppure mettere a punto la composizione
della fase mobile fino a soddisfare questa esigenza.
- Il fattore di asimmetria di picco As di tutti i picchi
ottenuti deve variare tra 0,9 e 1,5 (per la definizione di
fattore di asimmetria di picco, vedi figura 2). Per
registrare il cromatogramma al fine di determinare il
fattore di asimmetria, si raccomanda una velocita' della
carta pari ad almeno 2 cm/minuto.
----> Vedere Figura 2 a pag. 53 della G.U. <----
Figura 2: Fattore di asimmetria di picco
- Dovra' essere ottenuta una linea di base stabile.
5. Calcolo
Servirsi dei rapporti fra le altezze dei picchi dei
conservanti in esame e l'altezza del picco per l'acido
2-metossibenzoico (standard interno) e del grafico di
taratura per calcolare la concentrazione dei conservanti
acidi nella soluzione campione. Calcolare il contenuto di
acido benzoico, acido 4-idrossibenzoico, acido sorbico e
acido salicilico nel campione, come percentuale rispetto alla
massa (X(di i)), in base alla formula seguente:
100 - 20 - b b
x; % (m/m) = ------------------------- = ---------
10(elevato alla sesta)a 500 - a
dove
a = massa (g) impiegata per il test (4.1.2).
b = concentrazione (micro g/ml) del conservante nell'estratto
del campione (4.1.2) ottenuto dal grafico di taratura.
6. Ripetibilita' (1)
Per un contenuto di acido 4-idrossibenzoico dello 0,40%, la
differenza fra i risultati di due dosaggi in parallelo
eseguiti sullo stesso campione non deve superare un valore
assoluto pari a 0,035%.
Per un contenuto di acido benzoico dello 0,50%, la differenza
fra i risultati di due dosaggi eseguiti in parallelo sullo
stesso campione non deve superare un valore assoluto pari a
0,050%.
Per un contenuto di acido salicilico dello 0,50%, la
differenza fra i risultati di due dosaggi eseguiti in
parallelo sullo stesso campione non deve superare un valore
assoluto pari a 0,045%.
Per un contenuto di acido sorbico dello 0,60%, la differenza
fra i risultati di due dosaggi eseguiti in parallelo sullo
stesso campione non deve superare un valore assoluto pari a
0,035%.
(1) ISO 5725.
7. Osservazioni
7.1. I risultati di un ruggedness test eseguito in rapporto al
metodo sopra descritto, hanno consentito di stabilire che il
quantitativo di acido solforico aggiunto per estrarre gli
acidi dal campione ha una importanza critica e che i limiti
per il quantitativo di campione preso in esame devono essere
mantenuti entro i valori prescritti.
7.2. Se lo si desidera, si potra' impiegare una opportuna
precolonna.
C. DOSAGGIO DELL'ACIDO PROPIONICO
1. Oggetto e campo di applicazione
Il metodo ha per oggetto il dosaggio dell'acido propionico,
con una concentrazione massima del 2% (m/m) nei cosmetici.
2. Definizione
La concentrazione dell'acido propionico, misurata con questo
metodo, e' espressa come percentuale rispetto alla massa (%
m/m) del prodotto.
3. Principio
Dopo l'estrazione dell'acido propionico dal prodotto, si
procede al dosaggio mediante gascromatografia, con l'impiego
di acido 2- metilpropionico come standard di riferimento
interno.
4. Reagenti
Tutti i reagenti devono avere il grado di purezza richiesto
per analisi. Si dovra' impiegare acqua distillata, oppure
acqua di purezza almeno equivalente.
4.1. Etanolo 96% (v/v).
4.2. Acido propionico.
4.3. Acido 2-metilpropionico.
4.4. Acido ortofosforico, 10% (m/v).
4.5. Soluzione di acido propionico.
Pesare circa 1,00 g (p) di acido propionico in una provetta
graduata da 50 ml e diluire a volume con etanolo (4.1).
4.6. Soluzione standard di riferimento interno
Pesare accuratamente 1,00 g (e) di acido 2-metilpropionico in
una provetta graduata e diluire a volume con etanolo (4.1).
5. Apparecchiature
5.1. Attrezzature per impiego normale di laboratorio, e:
5.2. Gascromatografo con rilevatore di ionizzazione di fiamma.
5.3. Provetta (20 x 150 mm) con tappo a vite.
5.4. Bagno ad acqua a 60 gradi C.
5.5. Siringa in vetro da 10 ml con filtro a membrana (diametro dei
pori: 0,45 micro m).
6. Procedimento
6.1. Preparazione del campione
6.1.1. Preparazione del campione senza standard interno
Pesare circa 1 g di campione in una provetta (5.3).
Aggiungere 0,5 ml di acido fosforico (4.4) e 9,5 ml di
etanolo (4.1).
Tappare la provetta e agitare vigorosamente. Se necessario,
porre la provetta in bagno d'acqua a 60 gradi C (5.4) per 5
minuti, in modo da sciogliere completamente la fase lipidica.
Raffreddare rapidamente sotto acqua corrente. Filtrare parte
della soluzione su un filtro a membrana (5.5).
Sottoporre a cromatografia il filtrato, nello stesso giorno.
6.1.2. Preparazione del campione con standard interno
Pesare alla terza cifra decimale 1 g piu' e meno 0,1 g (a) di
campione in una provetta (5.3). Aggiungere 0,5 ml di acido
fosforico (4.4), 0,50 ml di soluzione standard di riferimento
interno (4.6) e 9 ml di etanolo (4.1).
Tappare la provetta e agitare vigorosamente. Se necessario,
porre la provetta in bagno d'acqua a 60 gradi C (5.4) per 5
minuti, in modo da sciogliere adeguatamente la fase lipidica.
Raffreddare rapidamente sotto acqua corrente. Filtrare parte
della soluzione su un filtro a membrana (5.5).
Sottoporre a cromatografia il filtrato, nello stesso giorno.
6.2. Condizioni per la gascromatografia
Si raccomandano le seguenti condizioni operative:
Colonna
Tipo acciaio inossidabile
Lunghezza 2 m
Diametro 1/8"
Riempimento 10% SPTM1000 (o equivalenti) + 1% H3PO4 su
WAW 100-200 mesh
Temperatura
Iniettore 200 gradi C
Colonna 120 gradi C
Rilevatore 200 gradi C
Gas vettore: Azoto
flusso: 25 ml/min.
6.3. Cromatografia
6.3.1. Taratura
In una serie di provette graduate da 20 ml, pipettare 0,25 -
0,50 - 1,00 - 2,00 e 4,00 ml di soluzione di acido propionico
(4.5). Pipettare 1,0 ml di soluzione standard di riferimento
interno (4.6) in ciascuna provetta. Diluire a volume con
etanolo (4.1) e mescolare. Le soluzioni preparate in questo
modo contengono e mg/ml di acido 2- metilpropionico come
standard interno (cioe', 1 mg/ml se e = 1000) e p/4, p/2, p,
2p, 4p mg/ml di acido propionico (cioe': 0,25 - 0,50 - 1,00 -
2,00 - 4,0 mg/ml se p = 1000).
Iniettare 1 micro l di ciascuna di queste soluzioni e
ottenere la curva di taratura tracciando il rapporto delle
masse dell'acido propionico e dell'acido 2-metilpropionico
sull'asse delle ascisse e il rapporto delle aree di picco
corrispondenti sull'asse delle ordinate.
Eseguire 3 iniezioni di ciascuna soluzione e calcolare la
media dei rapporti delle aree di picco.
6.3.2 Dosaggio
Iniettare 1 micro l di filtrato del campione 6.1.1.
Paragonare il cromatogramma con quello di una delle soluzioni
standard (6.3.1). Se un picco evidenzia approssimativamente
lo stesso tempo di ritenzione dell'acido 2-metilpropionico,
cambiare lo standard interno. Se non si osservano
interferenze, iniettare 1 micro l del filtrato del campione
6.1.2 e misurare le aree di picco dell'acido propionico e
della soluzione standard di riferimento interno.
Eseguire 3 iniezioni di ciascuna soluzione e calcolare la
media dei rapporti delle aree di picco.
7. Calcolo
7.1. In base alla curva di taratura ottenuta secondo il metodo di
cui al punto 6.3.1, desumere il rapporto della massa (K)
corrispondente al rapporto delle aree dei picchi calcolate
secondo il metodo di cui al punto 6.3.2.
7.2. In base al rapporto delle masse cosi' ottenuto, calcolare il
contenuto di acido propionico del campione (X) come
percentuale rispetto alla massa, servendosi della formula
seguente:
0,5 - 100 - e e
x % (m/m) = K ----------------- = K ---
50 - a a
dove:
K = rapporto calcolato in 7.1
e = massa in grammi dello standard interno pesato secondo il
metodo di cui al punto 4.6
a = massa in grammi del campione pesato secondo il metodo di
cui al punto 6.1.2.
Arrotondare i risultati alla prima cifra decimale.
8. Ripetibilita' (1)
Per un contenuto di acido propionico del 2% (m/m), la
differenza tra i risultati di due dosaggi in parallelo
eseguiti sullo stesso campione non deve superare il valore
assoluto di 0,12%.
(1) ISO 5725.
II. INDIVIDUAZIONE E DOSAGGIO DELL'IDROCHINONE, DELL'IDROCHINONE
MONOMETILETERE, DELL'IDROCHINONE MONOETILETERE E DELL'IDORCHINONE
MONOBENZILETERE NEI COSMETICI
A. INDIVIDUAZIONE
1. Oggetto e campo di applicazione
Questo metodo descrive l'individuazione e il dosaggio
dell'idrochinone, dell'idrochinone monometiletere,
dell'idrochinone monoetiletere e dell'idrochinone
monobenziletere (monobenzone) nei cosmetici destinati a
schiarire la pelle.
2. Principio
L'idrochinone e i suoi eteri sono individuati mediante
cromatografia su strato sottile (TLC).
3. Reagenti
Tutti i reagenti devono essere della purezza richiesta per
analisi
3.1. Etanolo, 96% (v/v).
3.2. Cloroformio.
3.3. Etere dietilico.
3.4. Solvente di sviluppo
Cloroformio/Etere dietilico, 66/33 (v/v).
20
3.5. Ammoniaca, 25% (m/m) (d = 0,91 g/ml).
4
3.6. Acido ascorbico.
3.7. Idrochinone.
3.8. Idrochinone monometiletere.
3.9. Idrochinone monoetiletere.
3.10. Idrochinone monobenziletere (monobenzone).
3.11. Soluzioni di riferimento
Le seguenti soluzioni di riferimento devono essere preparate
al momento e rimangono stabili per un giorno.
3.11.1. Pesare 0,05 g di idrochinone (3.7) in una provetta graduata
da 10 ml. Aggiungere 0,250 g di acido ascorbico (3.6) e 5 ml
di etanolo (3,1). Aggiungere ammoniaca (3.5) fino a ottenere
un pH pari a 10 e completare con etanolo (3.1) fino a
ottenere un volume di 10 ml.
3.11.2. Pesare 0,05 g di idrochinone monometiletere (3.8) in una
provetta graduata da 10 ml. Aggiungere 0,250 g di acido
ascorbico (3.6) e 5 ml di etanolo (3.1). Aggiungere ammoniaca
(3.5) fino a ottenere un pH pari a 10 e completare con
etanolo (3.1) fino ad ottenere un volume di 10 ml.
3.11.3. Pesare 0,05 g di idrochinone monoetiletere (3.9) in una
provetta graduata da 10 ml. Aggiungere 0,250 g di acido
ascorbico (3.6) e 5 ml di etanolo (3.1). Aggiungere ammoniaca
(3.5) fino a ottenere un pH pari a 10 e completare con
etanolo (3.1) fino ad ottenere un volume di 10 ml.
3.11.4. Pesare 0,05 g di idrochinone monobenziletere (3.10) in una
provetta graduata da 10 ml. Aggiungere 0,250 g di acido
ascorbico (3.6) e 5 ml di etanolo (3.1). Aggiungere ammoniaca
(3.5) fino a ottenere un pH pari a 10 e completare con
etanolo (3.1.) fino a ottenere un volume di 10 ml.
3.12. Nitrato d'argento.
3.13. Acido 12-molibdofosforico.
3.14. Ferrocianuro di potassio esaidrato.
3.15. Cloruro ferrico, esaidrato.
3.16. Reagenti spray.
3.16.1. Aggiungere ad una soluzione acquosa al 5% (m/v) di nitrato
d'argento (3.12) ammoniaca (3.5) fino ad ottenere la
solubilizzazione del precipitato
Attenzione: la soluzione ha carattere instabile ed e'
esplosiva, per cui deve essere eliminata dopo l'impiego.
3.16.2. Soluzione al 10% (m/v) di acido 12-molibdofosforico (3.13) in
etanolo (3.1).
3.16.3. Preparare una soluzione acquosa all'1% (***) di **** (3.14) e
al 2% (**) di cloruro ferrico (3.15).
Mescolare parti uguali di entrambe le soluzioni
immediatamente prima dell'impiego.
4. Apparecchiature
Materiale di impiego corrente in laboratorio e:
4.1. Attrezzature correnti per TLC.
4.2. Lastre per TLC pronte all'uso: silicagel GHR/UV264; 20 cm x
20 cm (Machery, Nagel o equivalenti) strato 0,25 mm.
4.3. Bagno ad ultrasuoni.
4.4. Centrifuga.
4.5. Lampada UV, 254 nm.
5. Procedura
5.1. Preparazione del campione
Pesare 3,0 g di campione in una provetta graduata da 10 ml.
Aggiungere 0,250 g di acido ascorbico (3.6) e 5 ml di etanolo
(3.1). Portare la soluzione al pH 10, impiegando ammoniaca
(3.5). Completare con etanolo (3.1) fino ad ottenere un
volume di 10 ml. Tappare la provetta e omogeneizzare in bagno
ad ultrasuoni per 10 minuti. Filtrare su un filtro di carta
o centrifugare a 3000 giri minuto.
5.2. TLC
5.2.1. Riempire di solvente per sviluppo (3.4) una vaschetta per
cromatografia.
5.2.2. Depositare su una lastra (4.2) 2 micro l delle soluzioni di
riferimento (3.11) e 2 micro l della soluzione campione
(5.1). Sviluppare a temperatura ambiente al riparo della
luce fino a quando il solvente migri a 15 cm dal punto di
partenza.
5.2.3. Rimuovere la lastra e asciugare a temperatura ambiente.
5.3. Accertamento
5.3.1. Osservare la lastra sotto luce UV a 254 nm e contrassegnare
la posizione delle macchie.
5.3.2. Spruzzare la lastra con
- reagente al nitrato d'argento (3.16.1), oppure
- reagente 12-molibdofosforico (3.16.2); riscaldare a circa
120 gradi C, oppure
- soluzione di ferrocianuro di potassio e soluzione di
cloruro ferrico (3.16.3).
6. Individuazione
Calcolare il valore Rf per ciascuna macchia.
Paragonare le macchie ottenute per la soluzione campione con
quelle delle soluzioni di riferimento in rapporto a: loro
valori Rf; colore delle macchie sotto irraggiamento UV;
colore delle macchie dopo visualizzazione con il reagente
nebulizzato.
Eseguire l'HPLC secondo il metodo descritto nel capitolo
seguente (B) e paragonare i tempi di ritenzione ottenuti per
il (o i) picco (picchi) campione con quelli delle soluzioni
di riferimento. Combinare i risultati della TLC e dell'HPLC
per l'individuazione della presenza dell'idrochinone e/o dei
suoi eteri.
7. Osservazioni
Nelle condizioni descritte, sono stati osservati i seguenti
valori di Rf:
idrochinone: 0,32
idrochinone monometiletere: 0,53
idrochinone monoetiletere: 0,55
idrochinone monobenziletere: 0,58.
B. DOSAGGIO
1. Oggetto e campo di applicazione
Il metodo descrive un procedimento di dosaggio
dell'idrochinone, dell'idrochinone monometiletere,
dell'idrochinone monoetiletere e dell'idrochinone
monobenziletere nei cosmetici destinati ad ammorbidire la
pelle.
2. Principio
Il campione e' estratto con una miscela acqua/metanolo,
previo leggero riscaldamento in modo da fondere gli eventuali
materiali lipidici esistenti. Il dosaggio degli analiti nella
soluzione risultante e' attuata mediante cromatografia in
fase liquida inversa, con rilevamento UV.
3. Reagenti
3.1. Tutti i reagenti devono essere della purezza richiesta per
analisi. Dovra' essere impiegata acqua distillata o acqua di
purezza almeno equivalente.
3.2. Metanolo.
3.3. Idrochinone.
3.4. Idrochinone monometiletere.
3.5. Idrochinone monoetiletere.
3.6. Idrochinone monobenziletere (monobenzone).
3.7. Tetraidrofurano, purezza per l'HPLC.
3.8. Miscela acqua/metanolo 1/1 (v/v). Mescolare un volume di
acqua e un volume di metanolo (3.2).
3.9. Fase mobile: miscela tetraidrofurano/acqua 45/55 (v/v).
Mescolare 45 volumi di tetraidrofurano (3.7) e 55 volumi
d'acqua.
3.10. Soluzione di riferimento
Preparare 0,06 g di idrochinone (3.3), 0,08 g di idrochinone
monometiletere (3.4), 0,10 g di idrochinone monoetiletere
(3.5) e 0,12 g di idrochinone monobenziletere (3.6) in una
provetta da 50 ml. Far sciogliere e completare a volume con
metanolo (3.2). Preparare la soluzione di riferimento
diluendo 10,00 ml di questa soluzione a 50,00 ml con una
miscela acqua/metanolo (3.8). Queste soluzioni devono essere
preparate al momento.
4. Apparecchiature
Materiale di impiego corrente in laboratorio e:
4.1. Bagno ad acqua, con possibilita' di mantenere una temperatura
di 60 gradi C.
4.2. Cromatografo ad alta risoluzione in fase liquida, con
rilevatore UV a lunghezza d'onda variabile e sistema di
iniezione da 10 (mi greca)l.
4.3. Colonna analitica
Colonna cromatografica in acciaio inossidabile, della
lunghezza di 250 mm, con diametro interno di 4,6 mm, riempita
di (fase stazionaria fenilica) Zorbax (fenetilsilano legato
chimicamente su Zorbax SIL, trattata con
trimetilclorosilano), dimensioni delle particelle 6 micro m,
o equivalente ***** impiegare una precolonna, a meno che non
sia riempita della stessa fase stazionaria o equivalente.
4.4. Carta da filtro, diametro 90 mm, Schleicher e Schull,
Weissband n. 5892, o equivalenti.
5. Procedura
5.1. Preparazione del campione
Pesare con accuratezza fino alla terza cifra decimale 1 g
piu' e meno 0,1 g (a) di campione in una beuta graduata da 50
ml. Disperdere il campione in 25 ml di miscela acqua/metanolo
(3.8). Tappare la beuta e agitare vigorosamente fino ad
ottenere una sospensione omogenea. Agitare per almeno un
minuto. Porre la beuta graduata in un bagno ad acqua (4.1)
mantenuto a 60 gradi C per favorire l'estrazione.
Raffreddare la beuta e completare a volume con acqua/metanolo
(3.8), filtrare l'estratto impiegando un filtro di carta
(4.4). Eseguire il dosaggio mediante HPLC entro 24 ore dalla
preparazione dell'estratto.
5.2. Cromatografia al alta risoluzione in fase liquida
5.2.1. Regolare il flusso della fase mobile (3.9) a 1,0 ml/min e
regolare la lunghezza d'onda del rilevatore a 295 nm.
5.2.2. Iniettare 10 micro l della soluzione campione ottenuta
secondo il procedimento descritto al punto 5.1. e realizzarne
il cromatogramma. Misurare le aree dei picchi. Eseguire la
calibrazione come descritto al punto 5.2.3. Paragonare i
cromatogrammi ottenuti per le soluzioni campione e le
soluzioni standard. Impiegare le aree dei picchi e i fattori
di risposta (Rf) calcolati al paragrafo 5.2.3. per calcolare
la concentrazione degli analiti nella soluzione campione.
5.2.3. Calibrazione
Iniettare 10 micro l di soluzione di riferimento (3.10) e
realizzarne il cromatogramma. Iniettare varie volte fino ad
ottenere un'area del picco costante.
Determinare il fattore di Risposta RF(di i)
Pi
RFi = -------
Ci
in cui:
Pi = area di picco per l'idrochinone, l'idrochinone
monometiletere, l'idrochinone monoetiletere o
idrochinone monobenziletere.
Ci = concentrazione (g/50 ml) nella soluzione di riferimento
(3.10) dell'idrochinone, dell'idrochinone
monometiletere, dell'idrochinone monoetiletere e
dell'idrochinone monobenziletere.
Accertarsi che i cromatogrammi ottenuti per una soluzione
standard e per la soluzione campione soddisfino le seguenti
esigenze:
- la separazione dei picchi della coppia meno ben separata
deve essere pari ad almeno 0,90 (per la definizione di
separazione dei picchi, vedi figura 1).
----> Vedere Figura 1 a pag. 60 della G.U. <----
Figura 1: Separazione dei picchi
se non si raggiunge la separazione richiesta, impiegare una
colonna di maggiore efficienza, oppure mettere a punto la
composizione della fase mobile fino a soddisfare tale
esigenza.
- il fattore di asimmetria A, di tutti i picchi ottenuti deve
variare tra 0,9 e 1,5. (Per la definizione di fattore di
asimmetria di picco, vedi figura 2). Per realizzare il
cromatogramma al fine di determinare il fattore di
asimmetria, si raccomanda una velocita' della carta pari ad
almeno 2 cm/minuto.
----> Vedere Figura 2 a pag. 61 della G.U. <----
Figura 2: Fattore di asimmetria di picco
- Si deve ottenere una linea di base stabile.
6. Calcolo
Servirsi delle aree dei picchi relativi agli analiti per
calcolare la/le concentrazione/i dell'/degli analita/i nel
campione. Calcolare la concentrazione dell'analita nel
campione, come percentuale rispetto alla massa (X(di i)), in
base alla formula:
bi - 100
Xi % (m/m) = ----------
RFi - a
in cui:
a = massa del campione in grammi "pesato secondo il
metodo di cui al punto 5.1"
bi = area di picco dell'analita nel campione.
7. Ripetibilita' (1)
7.1. Per un contenuto di idrochinone del 2,0%, la differenza tra i
risultati di due dosaggi eseguiti in parallelo sullo stesso
campione non deve superare il valore assoluto di 0,13%.
7.2. Per un contenuto di idrochinone monometiletere dell'1,0%, la
differenza tra i risultati di due dosaggi eseguiti in
parallelo sullo stesso campione non deve superare il valore
assoluto di 0,1%.
7.3. Per un contenuto di idrochinone monoetiletere dell'1,0%, la
differenza tra i risultati di due dosaggi eseguiti in
parallelo sullo stesso campione non deve superare il valore
assoluto di 0,11%.
7.4. Per un contenuto di idrochinone monobenziletere dell'1,0%, la
differenza tra i risultati di due dosaggi eseguiti in
parallelo sullo stesso campione non deve superare il valore
assoluto di 0,11%.
(1) ISO 5725.
8. Riproducibilita' (1)
8.1. Per un contenuto di idrochinone del 2,0%, la differenza tra i
risultati di due dosaggi eseguiti sullo stesso campione in
condizioni diverse (laboratori diversi, operatori diversi,
apparecchiature e/o tempi diversi) non deve superare il
valore assoluto di 0,37%.
8.2. Per un contenuto di idrochinone monometiletere dell'1,0%, la
differenza tra i risultati di due dosaggi eseguiti sullo
stesso campione in condizioni diverse (laboratori diversi,
operatori diversi, apparecchiature e/o tempi diversi) non
deve superare il valore assoluto di 0,21%.
8.3. Per un contenuto di idrochinone monoetiletere dell'1,0%, la
differenza tra i risultati di due dosaggi eseguiti sullo
stesso campione in condizioni diverse (laboratori diversi,
operatori diversi, apparecchiature e/o tempi diversi) non
deve superare il valore assoluto di 0,19%.
8.4. Per un contenuto di idrochinone monobenziletere dell'1,0%, la
differenza tra i risultati di due dosaggi eseguiti sullo
stesso campione in condizioni diverse (laboratori diversi,
operatori diversi, apparecchiature e/o tempi diversi) non
deve superare il valore assoluto di 0,11%.
(1) ISO 5725.
9. Osservazioni
9.1. Quando si trova un contenuto di idrochinone considerevolmente
superiore al 2% ed e' richiesta una valutazione accurata dei
contenuti, l'estratto del campione (5.1) deve essere diluito
ad una concentrazione simile a quella che si otterrebbe da un
campione contenente il 2% di idrochinone e si deve poi
procedere a ripetere il dosaggio.
(In alcuni strumenti, l'assorbenza puo' essere al di fuori
della gamma lineare del rilevatore in caso di elevate
concentrazioni di idrochinone).
9.2. Interferenze:
Il metodo sopra descritto consente il dosaggio
dell'idrochinone e dei suoi eteri attraverso un sistema
univoco. L'impiego della colonna al fenile garantisce una
ritenzione sufficiente dell'idrochinone, che non puo' invece
essere attuata qualora si impieghi una colonna C18 con la
fase mobile descritta.
Questo metodo e' pero' soggetto a varie interferenze. In tali
casi, il dosaggio deve essere ripetuto impiegando un sistema
diverso fase mobile/fase fissa, specificato nei riferimenti
di cui alle note 1 e 2, cioe':
Colonna: Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 cm, o equivalente
Temperatura: 36 gradi C
Flusso: 1,5 ml/min
Fase mobile: per l'idrochinone: metanolo/acqua 5/95 (V/V)
per l'idrochinone monometiletere:
metanolo/acqua 30/70 (V/V)
per l'idrochinone monobenziletere:
metanolo/acqua 80/20 (V/V) (1).
Colonna: Spherisorb S5-ODS, o equivalenti
Fase mobile: acqua/metanolo (90/10 V/V)
Flusso: 1,5 ml/min
Queste condizioni sono adatte all'idrochinone (2).