ALLEGATO
DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELL'ACIDO LATTICO NEL LATTE
1 - Scopo e campo di applicazione.
Determinazione del tenore in acido lattico, come somma di acido
D-lattico e L-lattico, nel latte crudo, pastorizzato e sterilizzato.
2 - Riferimenti.
D.M. 26/03/1992 - Attuazione della decisione n. 91/180/CE
Allegato I - Metodi di campionamento.
3 - Principio
La determinazione enzimatica dell'acido L-lattico e D-lattico
viene eseguita sul latte, deproteinizzato e diluito opportunamente,
utilizzando gli enzimi L-lattato deidrogenasi, D(-)-lattato
deidrogenasi. In presenza di questi enzimi, gli ioni L-lattato e
D(-)-lattato vengono ossidati a piruvato dal cofattore
nicotinamide-adenin-dinucleotide (NAD) che, a sua volta, si riduce a
NADH.
L-LDH o D-LDH
lattato + NAD < ------ > piruvato + NADH + H (+)
Poiche' l'equilibrio di questa reazione e' quasi completamente
spostato dalla parte del lattato, si sottrae il piruvato per mezzo di
una reazione catalizzata dall'enzima glutammato-piruvato-
transaminasi (GPT) in presenza di L-glutammato.
GPT
piruvato + L-glutammato < -------- > L-alanina + alfa-chetoglutarato
----> vedere allegato a pag. 60 <----
In tal modo, l'equilibrio viene spostato dalla parte del piruvato
e del NADH. La quantita' di NADH formatosi nella reazione,
equivalente a quella di L-lattato e di D-lattato iniziali, viene
dosata per via spettrofotometrica.
4 - Reattivi.
4.1 - Acqua bidistillata.
4.2 - Soluzione diluita di Carrez I.
Sciogliere 3,60 g di ferrocianuro di potassio (K4 par. quadra
Fe(CN)6 par. quadra -3 H2O) in 100 ml di acqua (4.1).
4. - Soluzione diluita di Carrez II.
Sciogliere 7,20 g di solfato di zinco (ZnSO4-7 H2O) in 100 ml di
acqua (4.1)
4.4 - Soluzione di idrossido di potassio 2 N circa.
4.5 - Soluzione Tampone (acido L-glutammico 0,1 M in tampone
glicilglicina 0,6 M a pH10).
Sciogliere in un pallone tarato da 50 ml, 3,96 9 di glicilglicina
e 0,73 g di acido L-giutammico con circa 40 ml di acqua (4.1),
aggiungere 3,8 ml di soluzione di idrossido di sodio 10 M e portare a
volume con acqua (4.1). La soluzione e' stabile per almeno tre mesi
se conservata in frigorifero.
4.6 - Soluzione NAD (nicotinamide 47 mM).
Sciogliere 0,21 g di beta nicotinamide adenina dinucleotide
monoidrato (beta NAD+) in 6 ml di acqua (4,1). La soluzione e
stabile almeno un mese se conservata in frigorifero.
4.7 - Soluzione GPT (enzima glutammato-piruvato transaminasi).
Centrifugare una sospensione commerciale dell'enzima (solitamente
in ammonio solfato 3,2 M e con attivita' di circa 80 U/mg) a 4000 rpm
per 10 minuti, prelevare il surnatante limpido e scartare il residuo.
La soluzione e' stabile almeno un anno se conservata in frigorifero.
4.8 - Soluzione D-LDH (enzima D(-)-lattato deidrogenasi) da
lactobacillus leichmannii.
Soluzione commerciale dell'enzima (solitamente in miscela
glicerolo acqua, da 5 mg/ml e con attivita' specifica di circa 300
U/mg). La soluzione e stabile almeno un anno se conservata in
frigorifero.
4.9 - Soluzione L-LDH (enzima L-lattato deidrogenasi).
Soluzione commerciale dell'enzima (solitamente in miscela
glicerolo-acqua, da 10 mg/ml e con attivita' specifica di circa 550
U/mg). La soluzione e' stabile almeno un anno se conservata in
frigorifero.
4.10 - Soluzione Standard-D-Lattico circa 40 mg/l (calcolata in base
alla esattezza della pesata)
Pesare esattamente 42,6 mg circa di D(-)-lattato di litio anidro
oppure 49,7 mg circa di D-Lattato di sodio (titolo > 99%) e
scioglierli in 100 ml di acqua (4.1) Prelevare 10 ml e diluirli a 100
ml. La soluzione corrisponde a circa 40 mg/l di acido D(-)-lattico.
Se si dispone di soluzioni gia' pronte, diluirle fino a ottenere una
concentrazione finale nota di circa 40 mg/l.
4.11 - Soluzione Standard-L-Lattico circa 40 mg/l (calcolata in base
alla esattezza della pesata).
Pesare esattamente 42,6 mg circa di L-lattato di litio anidro
oppure 49,7 mg circa di L-Lattato di sodio (titolo > 99%) e
scioglierli in 100 ml di acqua (4.1). Prelevare 10 ml e diluirli a
100 ml. La soluzione corrisponde a circa 40 mg/l di acido L-lattico.
Se si dispone di soluzioni gia' pronte, diluirle fino a ottenere una
concentrazione finale nota di circa 40 mg/l.
5 - Apparecchiatura.
5.1 - Provette graduate da 10 ml con tappo.
5.2 - Pipette con puntali monouso per volumi di 20, 100, 200, 500,
1000 microlitri.
5.3 - Spettrofotometro.
5.4 - Cuvette in quarzo o in plastica monouso con cammino ottico da 1
cm.
5.5 - Bacchette con estremita' appiattite, tali da entrare nelle
cuvette (5.4).
6 - Campionamento
Vedi punto 2.
7 - Procedimento.
7.1 - Preparazione del campione.
7.1.1 - Pesare 5 g di campione in una provetta da 10 ml (5.1).
Aggiungere 0,75 ml di soluzione di Carrez I (4.2) e mescolare.
Aggiungere 0,75 ml di soluzione di Carrez II (4.3), mescolare e
neutralizzare con alcune gocce idrossido di potassio (4.4). Portare a
volume con acqua (4.1).
7.1.2 - Filtrare
7.2 - Determinazione.
7.2.1 - Preparare una serie di cuvette (5.4) e denominarle:
B: cuvetta per la prova del bianco
St: cuvetta per il controllo degli standard D-Lattico (4.10) e
L-Lattico (4.11)
C: cuvetta per la determinazione del campione
7.2.2 - Con pipette (5.2), pipettare in tutte le cuvette,
nell'ordine,:
1,00 ml di soluzione Tampone (4.5);
0,20 mi di soluzione NAD (4.6);
0,02 ml della soluzione GPT (4.7);
7.2.3 - Con pipette (5.2), pipettare in:
cuvetta B: - 1,00 ml di acqua (4,1)
cuvetta St: - 0,50 mi di standard D-Lattico (4.10) e 0,50 mi di
standard L-Lattico (4.11).
cuvetta C: - 1,00 ml di campione filtrato (7.1.2)
Mescolare con le bacchette (5.5) (una per cuvetta) e lasciar
riposare per 5 minuti.
7.2.4 - Determinazione dell'acido D-Lattico.
Misurare le estinzioni delle singole cuvette a 340 mm contro acqua
(4.1). I valori letti sono denominati E1 e, abbinati alle rispettive
cuvette, diventano:
E1B l'estinzione iniziale dei bianco per il D-Lattico
E1St l'estinzione iniziale dello standard D-Lattico
E1C l'estinzione iniziale del campione per il D-Lattico
7.2.5 - Aggiungere nelle cuvette:
0,02 ml di soluzione D-LDH (4.8)
Mescolare e lasciar riposare per 30 minuti.
7.2.6 - Misurare le estinzioni delle singole cuvette a 340 nm contro
acqua (4.1). I valori letti sono denominati E2 e, abbinati alle
rispettive cuvette, diventano:
E2B l'estinzione finale del bianco per il D-Lattico
E2St l'estinzione finale dello standard D-Lattico
E2C l'estinzione finale del campione per il D-lattico
7.2.7 - Determinazione dell'acido L-Lattico.
La determinazione, continua nelle stesse cuvette ancora
contenenti le soluzioni della determinazione dell'acido D-lattico. Le
estinzioni finali relative all'acido D-Lattico (7.2.6) costituiscono
anche le estinzioni iniziali per l'acido L-Lattico.
E2B l'estinzione iniziale del bianco per l'L-Lattico
E2St l'estinzione iniziale dello standard L-Lattico
E2C l'estinzione iniziale del campione per l'L-lattico
7.2.8 - Aggiungere nelle cuvette:
0,02 ml di soluzione L-LDH (4.9)
Mescolare e lasciar riposare per 30 minuti.
7.2.9 - Misurare le estinzioni delle cuvette a 340 nm contro acqua
(4.1). I valori letti sono denominati E3 e, abbinati alle rispettive
cuvette, diventano:
E3B l'estinzione finale del bianco per l'L-Lattico
E3St l'estinzione finale dello standard L-Lattico
E3C l'estinzione finale del campione per l'L-lattico)
8 - Espressione dei risultati.
8.1 - Calcolo
La formula generale di calcolo e':
V * PM
C (in mg/l) = ------------------- * DELTA E
epsilon * d * v
dove:
V = volume finale del test (2,24 ml per bianco, campione e
standard D-Lattico, 2,26 per bianco, campione e standard L-Lattico)
v = volume della soluzione analizzata (0,50 ml per gli standard,
1,00 ml per il campione e 1,00 ml per il bianco) PM = peso molecolare
dell'acido lattico (90,1 sia nella forma L che nella forma D)
d = spessore della cuvetta (1 cm)
epsilon = coefficiente di estinzione molare a 340 nm del NADH
pari a 6,3
DELTA ECD = (E2C-E1C) = differenza estinzioni acido D-Lattico
DELTA ECL = (E3C-E2C) = differenza estinzioni acido L-Lattico
DELTA EStD = (E2St-E1St) = differenza estinzioni standard
D-Lattico
DELTA EStL = (E3St- E2St) = differenza estinzioni standard
L-Lattico
DELTA EBD = (E2B-E1B) = differenza estinzioni bianco D-Lattico
DELTA EBL = (E3B-E2B) = differenza estinzioni bianco L-Lattico
8.2 - Verifica della validita' del metodo - Prova di recupero.
Si confronta il valore determinato delle soluzioni standard di
acido D-Lattico e di acido L-Lattico con il valore teorico delle
stesse. Il volume finale dei test di controllo (V) e' pari a 2,24 ml
per l'acido D-Lattico e a 2,26 per l'acido L-Lattico; il volume di
standard usato e' pari a 0,5 ml. Sostituendo nella formula, si
ottiene:
Conc. Standard D-Lattico (mg/l) = 64,07 * (DELTA EStD-DELTA EBD)
Conc. Standard L-Lattico (mg/l) = 64,64 * (DELTA EStL-DELTA EBL)
I valori determinati degli standard devono corrispondere ai
valori dichiarati iniziali con recupero pari almeno al 95%:
8.3 - Tenore di acido D-Lattico in mg/Kg di latte.
Il volume finale del test e' 2,24 ml e il volume di campione e'
pari a 1,00 ml. Sostituendo i valori nella formula e facendo
riferimento ai grammi pesati (G) e diluiti a 10 ml, si ottiene:
Conc. D-Lattico (mg/Kg) = 32,03 * (DELTA ECD DELTA EBD) * 10/G
8.4 - Tenore in acido L-Lattico in mg/Kg di latte.
Il volume finale del test e' 2,26 ml e il volume di campione e'
pari a 1,00 ml. Sostituendo i valori nella formula e facendo
riferimento ai grammi pesati (G) e diluiti a 10 ml, si ottiene:
Conc. L-Lattico (mg/Kg) = 32,32 * (DELTA ECL - DELTA EBL) * 10/G
8.5 - Il tenore finale di acido lattico in mg/Kg di latte (p.p.m.)
e' dato dalla somma delle concentrazioni del D-Lattico e del
L-Lattico.
Per la somma, devono essere prese in considerazione solo le
concentrazioni superiori a 4 mg/Kg di latte.
Determinazione acido lattico
Tabella riassuntiva
| |
| Bianco Standard Campione |
| B St C |
| Aggiungere nelle cuvette ml ml ml |
| |
| Soluzione Tampone (4.5) 1,00 1,00 1,00 |
| Soluzione NAD (4.6) 0,20 0,20 0,20 |
| Soluzione GPT (4.7) 0,02 0,02 0,02 |
| Acqua (4.1) 1,00 - - |
| Standard D-Lattico (4.10) - 0,50 - |
| Standard L-Lattico (4.11,) - 0,50 - |
| Campione filtrato (7.1.2) - - 1,00 |
| Leggere le estinzioni E1B E1St E1C |
| Soluzione D-LDH (48) 0,02 0,02 0,02 |
| Leggere estinzioni E2B E2St E2C |
| Soluzione L-LDH (4.9) 0,02 0,02 0,02 |
| Leggere estinzioni E3B E3St E3C |
|
9 - Osservazioni.
9.1 - La temperatura di lavoro ottimale deve essere compresa fra 20 e
25 gradi C.
9.2 - La quantita' di acido lattico (D o L) non deve essere inferiore
a 2 (m greca)g in cuvetta, corrispondente a 4 mg/kg nel campione
operando come descritto. La quantita di 4 mg/kg pertanto diviene la
quantita' minima determinabile di acido lattico.
9.3 - La quantita' di acido D-Lattico normalmente riscontrabile e
inferiore a 4 mg/kg e pertanto il tenore di acido lattico totale nel
campione in esame sara' dato dalla somma dei due enantiomeri solo
quanto la quantita' di D-Lattico risultera' superiore a 4 mg/kg. In
caso contrario, il tenore di acido lattico sara' dato dalla quantita'
del solo acido L-Lattico.
10 - Precisione del metodo.
10.1 - Su un latte con tenore di acido lattico pari a circa 10 mg/kg,
sono state eseguite 15 determinazioni. Dalle valutazioni statistiche
si e' ricavato:
Coefficiente di variazione (C.V.) = 10%
Intervallo di confidenza (x + o - 2 s) = x + o - 2