ALLEGATO 2
UTILIZZO DI TECNICHE ISTOPATOLOGICHE, IMMUNOISTOCHIMICHE E MOLECOLARI
PER L'EVIDENZIAZIONZE DI LESIONI E DI MICOBATTERI TUBERCOLARI SU
MATERIALE FRESCO E TESSUTI FISSATI DI ANIMALI INFETTI MACELLATI O
MORTI; DA EFFETTUARSI OVE RICHIESTO.
A. Esame anatomo-isto-patologico.
Il medico veterinario deve eseguire una accurata e meticolosa
necroscopia del bovino o bufalino abbattuto dopo la reazione
tubercolinica positiva.
La sua attenzione deve essere volta in particolare agli organi di
entrata del micobatterio e cioe' polmone, intestino e fegato e
soprattutto sui relativi linfonodi regionali. Su di essi devono
essere eseguiti piu' tagli paralleli al fine di evidenziare
l'eventuale presenza di tubercoli miliari o submiliari che altrimenti
potrebbero sfuggire all'esaminatore.
Una volta riscontrata la o le lesioni sospetta/e una parte di esse
deve essere fissata in formalina tamponata al 10% per gli esami
istopatologici al fine di accertare la diagnosi o, eventualmente, di
eseguire una diagnosi differenziale da lesioni simili, da parte del
laboratorio autorizzato. Il laboratorio dovra' eseguire sulla sezione
istopatologica la ricerca dei micobatteri mediante colorazione di
Ziehl-Neelsen.
B. Tecniche immunoistochimiche.
Mediante l'utilizzo di anticorpi policlonali e monoclonali e'
possibile evidenziare la presenza di antigeni di micobatteri
tubercolari in sezioni di tessuto opportunamente fissate in formalina
tamponata al 10% e incluse in paraffina; il prelievo va eseguito
subito dopo la macellazione dell'animale, su tessuti con lesioni
possibilmente non calcificate.
La tecnica consiste in una colorazione immunoistochimica del tipo
immunoperossidasi indiretta, in cui l'anticorpo policlonale (diretto
contro antigeni comuni ai vari tipi di micobatteri) o monoclonale
(diretto contro antigeni specifici dei vari micobatteri) si lega ai
rispettivi antigeni presenti nel tessuto. I tessuti infetti
presentano pertanto una positivita' finemente granulare nel
citoplasma delle cellule giganti, dei macrofagi e nelle aree
necrotiche.
Il metodo immunoistochimico presenta numerosi vantaggi. Infatti
consente innanzitutto di diagnosticare un'infezione tubercolare molto
piu' rapidamente rispetto all'isolamento. In secondo luogo presenta
una maggiore specificita' e sensibilita' rispetto ai metodi di
colorazione istochimica quali la Ziehl-Neelsen, in quanto rileva
antigeni di micobatteri, frammenti di microrganismi morti o
micobatteri con pareti "difettive" (a differenza della colorazione
Ziehl-Neelsen che evidenzia solo micobatteri intatti) e con un
notevole vantaggio sull'isolamento, che richiede comunque
microrganismi vivi.
C. Tecniche di patologia molecolare.
C1. Ibridazione in situ.
Il metodo dell'ibridazione in situ si basa sull'osservazione che
una catena singola di un frammento di DNA o RNA contenente una
sequenza complementare si lega al DNA o RNA cellulare se esistono
appropriate condizioni di temperatura, forza ionica e pH. Se poi il
frammento di DNA o RNA viene preventivamente marcato con sostanze che
segnalino l'avvenuta reazione (marcanti radioattivi oppure biotina e
sistema ABC) avremo la possibilita' di una localizzazione morfologica
precisa.
Tale tecnica effettuata su materiale fissato in formalina ed
incluso in paraffina e' in grado di abbinare l'elevata specificita'
dell'evidenziazione della presenza di DNA o RNA di micobatteri alla
localizzazione nella reazione in cellule specifiche.
C2. Reazione a catena della polimerasi (PCR).
Questa tecnica e' una metodica di amplificazione di un segmento di
DNA. Essa si basa sull'osservazione che per la sintesi di una nuova
catena nucleotidica, una sequenza di DNA complementare, chiamato
"primer", deve legarsi agli estremi 3' e 5' terminali del segmento di
DNA da amplificare (DNA stampo). In questo modo la sintesi della
nuova doppia catena di DNA avverra' ad opera di una DNA-polimerasi
termostabile, attraverso l'addizione di nucleotidi complementari alla
catena-stampo, nella regione di DNA posta tra i due "primers". Dal
momento che la nuova catena di DNA complementare e' in grado di
legare i "primers", in ogni ciclo replicativo la quantita' di DNA
sintetizzato doppia rispetto al ciclo precedente, con conseguente
incremento logaritmico della sequenza di DNA da studiare. I vantaggi
di questa tecnica sono rappresentati dalla purezza del DNA prodotto,
dalla elevatissima specificita', dalla rapidita' con cui possono
essere ottenuti risultati altamente attendibili e dalla possibilita'
di amplificare sequenze piccolissime di DNA (fino a 1 ng).
Quest'ultima caratteristica puo' essere utilizzata per tipizzare i
diversi micobatteri patogeni e non presenti in un determinato
campione sulla base di minime differenze specie-specifiche della
sequenza nucleotidica del DNA.
Per l'effettuazione della reazione deve essere disponibile, almeno
nelle fasi iniziali dello studio, materiale fresco o congelato
(-20(gradi) C/-80(gradi) C) entro un'ora dalla morte dell'animale.
TECNICHE DI ISOLAMENTO E DI IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI
1. Raccolta e trasporto dei campioni.
La diagnosi definitiva di tubercolosi, o di altre micobatteriosi,
richiede che i micobatteri siano isolati dal materiale inviato al
laboratorio per la coltura.
L'efficacia diagnostica non dipende solo dai metodi usati per la
coltura dei micobatteri ma anche dal modo con cui i campioni sono
stati raccolti e trasportati.
1.1. Raccolta.
Tessuti, linfonodi, organi: pezzi di tessuto sospetti di contenere
micobatteri vengono raccolti asetticamente e messi in contenitori
sterili senza conservanti o fissativi.
1.2. Trasporto.
Il campione da esaminare deve arrivare il prima possibile e nelle
condizioni migliori al laboratorio.
Per i tessuti, qualora l'invio al laboratorio non sia immediato,
sara' necessario conservare il materiale a 4 (Piu' o Meno) 2 (gradi)
C un massimo di quattro giorni.
Diversamente il campione va congelato.
2. Tecniche di colorazione.
La presenza dei micobatteri nei materiali clinici puo' essere
dimostrata con l'esame microscopico di strisci colorati utilizzando
la tecnica di Ziehl-Neelsen.
3. Operazioni preliminari alla semina: metodi di decontaminazione.
Il materiale clinico sospetto di contenere micobatteri, e' spesso
contaminato anche da altre specie microbiche. Pertanto prima di
procedere alla semina, i campioni dovranno essere decontaminati con
tecniche a diverso grado di lesivita' per micobatteri, rispettando
strettamente i tempi di contatto con i rispettivi decontaminanti.
Le tecniche sotto descritte possono essere impiegate in
alternativa.
3.1. Idrossido di sodio 4%.
- Trattare l'omogeneato con ugual volume di NaOH al 4%
- Mantenere in termostato a 37 (gradi) C per 30'
- Neutralizzare il sedimento con acido solforico al 10% goccia a
goccia utilizzando il rosso fenolo come indicatore di pH
- Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000
g
- Eliminare il surnatante
- Risospendere il sedimento con 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e
inoculare i terreni di coltura con 1 ml; destinare l'altro
millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione
degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova
biologica.
3.2. Sodiododecilsolfato di sodio (Laurilsolfato di sodio) (SDS)
3,16% + NaOH 1%
- Trattare l'omogenato con ugual volume di decontaminante (SDS
3,16% + NaOH 1%)
- Mantenere a temperatura ambiente in agitazione per 40'
- Aggiungere acido fosforico 1,43% e Porpora di bromocresolo
0,006% fino a viraggio dell'indicatore al giallo arancio
- Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi ) C o per 20' a 2.000
g
- Eliminare il surnatante
- Risospendere il sedimento in 10 ml di soluzione fisiologica
sterile
- Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000
g
- Risospendere il sedimento in 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e
inoculare con 1 ml i terreni di coltura; destinare l'altro
millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione
degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova
biologica.
3.3. Esadecilpiridiniocloruro (HPC) (Cetilpiridiniocloruro CCP) 1,5%
- Trattare l'omogenato con ugual volume di HPC 1,5%
- Mantenere a temperatura ambiente in agitazione per 30'
- Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000
g
- Risospendere il sedimento in 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e
inoculare con 1 ml i terreni di coltura; destinare l'altro
millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione
degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova
biologica.
4. Semina e terreni di isolamento.
La semina viene effettuata in ragione di 0,2 ml del preparato
utilizzando i seguenti terreni colturali solidi preparati a becco di
clarino a diversa selettivita':
- 2 provette di Lowenstein-Jensen
- 1 provetta di Lowenstein-Jensen senza glicerina con 0,5% di
piruvato di sodio o una provetta ai Stonebrink
5. Incubazione delle colture.
I terreni inoculati vanno posti in termostato a 37 (gradi) C e una
delle due provette di Lowenstein-Jensen a 43 (gradi) C.
E' preferibile usare un'atmosfera al 5-10% di CO2.
Le colture vanno esaminate in prima lettura dopo 2-5 giorni ed in
seguito settimanalmente per 6-12 settimane.
6. Inoculazione di animali da esperimento.
Generalmente l'inoculazione in animali viene poco usata, esistendo
numerose tecniche in vitro per l'isolamento e l'identificazione piu'
specifiche.
Alla prova biologica si puo' ricorrere in parallelo all'esame
colturale, nel caso in cui si sospetti la presenza di micobatteri in
scarso numero nel campione o una forte contaminazione di questo.
Puo' essere utilizzata anche a fini identificativi (vedi tabella).
La prova biologica classica si effettua inoculando
contemporaneamente 1 ml di omogenato decontaminato nel muscolo
della coscia di 2 cavie, 1 ml per via intraperitonale in due
conigli e 1 ml per via endovenosa in due polli adulti.
PATOGENICITA' DEI MICOBATTERI
NEGLI ANIMALI DA LABORATORIO
+------------------+-------------+---------------+-------------------+
| | Cavia | Pollo | Coniglio |
+------------------+-------------+---------------+-------------------+
| M. bovis | + | - | + |
+------------------+-------------+---------------+-------------------+
| MAI complex | - | + | + |
+------------------+-------------+---------------+-------------------+
| M. tuberculosis | + | - | - |
+------------------+-------------+---------------+-------------------+
* M. avium-intracellulare complex
7. Identificazione.
Per identificare i micobatteri e' necessario basarsi su diversi
caratteri:
- l'acido resistenza
- tempo, temperatura e aspetto di crescita
- assenza di pigmento nei principali micobatteri di interesse
veterinario
- tests biochimici
7.1. Tab. 2.
IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA
_____________________________________________________________________
| | | | |
Micobatteri | Crescita | Ureasi |Riduzione |Riduzione |Niacina
|__________| | | |
| 37 43 | | tellurito | nitriti |
|gradi gradi | | |
_______________|__________|_________|___________|___________|________
| | | | |
M. bovis | L _ | (+ o -) | (+ o -) | _ | _
MAI complex | L _ | _ | + | _ | _
M. tuberculosis| L _ | (+ o -) | (+ o -) | + | +
Micobatteri | | | | |
rapida crescita| R _ | + | + | (+ o -) | (+ o -)
_______________|__________|_________|___________|___________|________
L = Crescita lenta > 7 gg
R = Crescita rapida < 7 gg
Tutte le prove devono essere eseguite a partire da colture
abbondanti in attiva fase di crescita e vanno sempre accompagnate da
controllo positivo e negativo.
7.2. Ureasi.
- Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 4 ml di brodo contenente
urea (2%), glucosio (0,1%) e rosso fenolo (0,0012%) (colorazione
rosso-arancio) e incubare a 37 (gradi) C per 3 giorni
- La reazione e' positiva per viraggio del colore del terreno
verso il rosso porpora
7.3. Riduzione del tellurito.
- Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 5 ml di brodo Middlebrook
7H9 e incubare a 37 (gradi) C per 7 o piu' giorni, fino a crescita
visibile
- Aggiungere 0,1 ml di una soluzione acquosa di potassio tellurito
allo 0,2% e reincubare per 4 giorni
- La reazione e' positiva quando compare un precipitato nero
7.4. Riduzione dei nitrati.
- Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 1 ml di substrato (Nitrato
di sodio 0,01 M in tampone fosfato 1/45 M pH 7) e incubare per 2 ore
per 37 (gradi) C
- Aggiungere 0,1 ml di una soluzione acquosa di acido sulfanilico
allo 0,8% e acido acetico al 28,5% e 0,1 ml di una soluzione acquosa
di N,N-Dimetil-1-naftilammina allo 0,6% e acido acetico al 28,5%
- La reazione e' positiva per comparsa di colore rosso
- La reazione e' negativa se il colore rosso compare solo dopo
aggiunta di polvere di zinco
7.5. Niacina.
- Aggiungere 1 ml di acqua distillata sterile ad una coltura in
Lowenstein-Jensen, lasciare per 2 ore a temperatura ambiente
affinche' avvenga l'estrazione dal terreno
- Trasferire 0,5 ml dell'estratto in una provetta, aggiungere un
ugual volume di soluzione alcoolica di anilina al 4% e quindi
aggiungere 0,5 ml di bromuro di cianogeno al 10% (da non inalare o
mettere a contatto con la cute ed eliminare solo dopo
alcalinizzazione con NaOH)
- Un immediato sviluppo di colore giallo indica la positivita'
della reazione
Un'alternativa al metodo sopra descritto e' l'utilizzo di strisce
per il test Niacina reperibili in commercio.