ALLEGATO II
(previsto dall'art. 2, comma 1)
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI E SPECIFICHE PER I METODI D'ANALISI
IMPIEGATI NEL CONTROLLO UFFICIALE DEI LIVELLI DI DIOSSINE (PCDD/PCDF)
E NELLA DETERMINAZIONE DI PCB DIOSSINA-SIMILI IN TALUNI MANGIMI
1. Finalita' e campo d'applicazione
Queste specifiche si applicano all'analisi di materie prime e
mangimi volta a determinare la presenza di diossine
[policlorodibenzodiossine (PCDD) policlorodibenzofurani (PCDF)] e
difenili policlorurati diossina-simili (PCB).
Il controllo della presenza di diossine nei mangimi puo' essere
effettuato mediante una strategia che preveda un metodo di screening
per selezionare i campioni con livelli di diossine e di PCB
diossina-simili superiori al livello massimo consentito o inferiori
di un valore al di sotto del 30-40 %. Occorre poi
determinare/confermare la concentrazione di diossine nei campioni con
livelli significativi tramite un metodo di conferma.
I metodi di screening sono impiegati per rilevare la presenza di
diossine e PCB diossinasimili ai livelli massimi consentiti. Essi
sono dotati di una grande capacita' di trattamento di campioni, il
che consente di' passare al vaglio un'elevata quantita' di campioni
per ricercare quelli che potrebbero rivelarsi positivi. Questi metodi
sono specialmente concepiti in modo da evitare i falsi risultati
negativi.
I metodi di conferma forniscono informazioni complete o
complementari che consentono di individuare e quantificare in maniera
inequivocabile le diossine e i PCB diossina-simili al livello massimo
consentito.
2. Contesto
Poiche' i campioni ambientali e biologici (inclusi i campioni di
materie prime/mangimi) generalmente contengono miscele complesse di
diversi congeneri di diossine, per agevolare la valutazione dei
rischi e' stato elaborato il concetto di "fattori di tossicita'
equivalente" (TEF). I TEF consentono di esprimere concentrazioni di
miscele di PCDD e PCDF sostituiti alle posizioni 2,3,7,8 e, di
recente, alcune forme di PCB non orto e orto clorosostituiti aventi
proprieta' simili a quelle delle diossine in equivalenti tossici (TE)
di 2,3,7,8-TCDD (cfr. nota 1 dell'allegato I).
Le concentrazioni delle singole sostanze in un dato campione
vengono dapprima moltiplicate per il corrispondente TEF e poi sommate
per ottenere la concentrazione totale dei composti diossina-simili
espressa in TE.
Per il calcolo del "limite superiore", si suppone che il
contributo al TE di ogni congenere non quantificato sia uguale alla
soglia di determinazione.
Per il calcolo del "limite inferiore", si suppone che il
contributo al TE di ogni congenere non quantificato sia uguale a
zero.
Per il calcolo del "valore intermedio", si suppone che il
contributo al TE di ogni congenere non quantificato sia uguale alla
meta' della soglia di quantificazione.
3. Requisiti da applicare nella preparazione dei campioni per la
garanzia della qualita'.
Si applicano le disposizioni generali sulla preparazione dei
campioni destinati all'analisi indicate nell'allegato, punto 1, del
decreto ministeriale in data 28 maggio 1982, pubblicato nel
supplemento ordinario n. 6 alla Gazzetta Ufficiale n. 265 del 25
settembre 1982.
Occorre inoltre che siano rispettate le seguenti prescrizioni:
- i campioni devono essere conservati e trasportati in appositi
contenitori di vetro, alluminio, polipropilene o polietilene, dopo
avere rimosso ogni traccia di polvere di carta dal contenitore. Gli
strumenti in vetro devono essere risciacquati con solventi
previamente sottoposti a un controllo volto a determinare la
presenza di diossine;
- occorre fare un'analisi in bianco, ovvero effettuare l'intera
procedura analitica senza il campione;
- il peso del campione utilizzato per l'estrazione deve essere tale
da rispondere ai requisiti relativi alla sensibilita' del metodo.
4. Requisiti applicabili ai laboratori
- I laboratori devono dimostrare la validita' del metodo
nell'intervallo di tolleranza del livello considerato, ad esempio,
0,5x, 1x e 2x il livello considerato, con un coefficiente di
variazione accettabile per analisi ripetute. Per ulteriori
informazioni sui criteri di validita', si veda il punto 5.
- Il limite di quantificazione per un metodo di conferma non deve
essere superiore a un quinto del livello massimo consentito, per
garantire coefficienti di' variazione accettabili nell'intervallo
di cui al punto precedente;
- Si devono costantemente effettuare controlli in bianco ed
esperimenti o analisi dei campioni di controllo con l'aggiunta di
indicatori (di preferenza, se disponibile, materiale di riferimento
certificato), quali misure interne di garanzia della qualita'.
- La riuscita partecipazione a studi condotti in collaborazione con
altri laboratori che valutano la competenza del laboratorio e' il
modo migliore per dimostrarne la perizia nell'ambito di analisi
specifiche. Tuttavia, il buon esito della partecipazione a studi
condotti con altri laboratori, ad esempio, su campioni di terreno o
di acque residue, non dimostra necessariamente che il laboratorio
sia altrettanto competente a trattare campioni di prodotti
alimentari o mangimi, caratterizzati da livelli di contaminazione
minori. E' pertanto requisito imprescindibile la partecipazione
regolare a studi condotti in collaborazione con altri laboratori
sulla determinazione di diossina e di PCB diossina-simili nelle
corrispondenti matrici di prodotti alimentari/mangimi.
5. Requisiti applicabili alle procedure d'analisi per le diossine e i
PCB diossina-simili
Requisiti di base di validita' delle procedure d'analisi:
- Elevata sensibilita' e limiti di rilevabilita' bassi. Per quanto
concerne le PCDD e i PCDF, le quantita' rilevabili devono essere
dell'ordine del picogrammo di TE (10-12 g), data l'estrema
tossicita' di alcuni di questi composti. E noto che i PCB si
presentano in quantita' piu' elevate rispetto alle PCDD e ai PCDF.
Per quanto concerne la maggior parte dei congeneri di PCB, una
sensibilita' dell'ordine del nanogrammo (10-9 g) e' sufficiente.
Tuttavia, per la determinazione dei congeneri piu' tossici di PCB
diossina-simili (in particolare i congeneri non orto sostituiti) si
deve ottenere la stessa sensibilita' delle PCDD e dei PCDF.
- Alta selettivita' (specificita). Occorre distinguere le PCDD, i
PCDF e i PCB diossina-simili da una moltitudine di altri composti
che, estratti simultaneamente dal campione e suscettibili
d'interferire, sono presenti in concentrazioni di molto superiori a
quelle degli analiti da rilevare. Per quanto concerne i metodi di
gascromatografia/spettrometria di massa (GC/MS), e' necessario
distinguere tra vari congeneri, in particolare tra quelli tossici
(ad esempio, i diciassette PCDD e PCDF sostituiti alle posizioni
2,3,7,8 e i PCB diossinasimili) e altri congeneri. Mediante biotest
dovrebbe essere possibile determinare selettivamente i valori di
TE, quale somma di PCDD, PCDF e PCB diossina-simili.
- Estrema accuratezza (esattezza e precisione). La determinazione
deve fornire una stima valida ed affidabile della concentrazione
reale presente in un campione. E' necessario porre estrema cura
(accuratezza della misurazione: grado di concordanza tra il
risultato di una misurazione e il valore reale o assegnato del
misurando) per evitare che i risultati dell'analisi di un campione
siano respinti a causa della scarsa affidabilita' della stima dei
TE. L'accuratezza e' la risultante di esattezza (differenza tra il
valore medio misurato per un analita in un materiale certificato,
espressa in percentuale ditale valore) e precisione (la precisione
viene generalmente calcolata sotto forma di scarto-tipo; essa
include la ripetibilita' e la riproducibilita' e indica il grado di
concordanza tra i risultati ottenuti applicando ripetutamente la
procedura sperimentale in determinate condizioni).
I metodi di screening possono comprendere biotest e metodi GC/MS,
mentre i metodi di conferma sono costituiti dalla gascromatografia ad
alta risoluzione e dalla spettrometria di massa ad alta risoluzione
(HRGC/HRMS). Si devono osservare i seguenti criteri per il valore
totale in TE:
+=============================+===================+======================+
| |Metodi di screening| Metodi dI conferma |
+-----------------------------+-------------------+----------------------+
|Percentuale di falsi negativi| < 1 % | |
+-----------------------------+-------------------+----------------------+
|Esettezza | |-20%a+20% |
+-----------------------------+-------------------+----------------------+
|CV (coefficiente di |<30 % |<15 % |
|variazione) | | |
+-----------------------------+-------------------+----------------------+
6. Requisiti specifici applicabili ai metodi GC/MS a fini di
screening o di conferma
- Quale primo passo dell'analisi per convalidarne la procedura, da
effettuare, ad esempio, prima dell'estrazione, occorre aggiungere
standard interni di PCDD/F clorosostituiti alle posizioni 2,3,7,8 e
marcati con 13C (e standard interni di PCB diossina-simile marcati
con 13C, se si devono determinare PCB diossina-simili). Va aggiunto
almeno un congenere per ciascun gruppo omologo di PCDD/F da tetra a
octaclorati (e almeno un congenere per ciascun gruppo omologo di
PCB diossina-simile, se si devono determinare PCB diossinasimili)
(in alternativa, e' possibile aggiungere almeno un congenere per
ciascuna funzione di registrazione di ioni selezionati tramite
spettrografia di massa utilizzata per il controllo di PCDD/F e PCB
diossina-simile). Si consiglia vivamente, soprattutto per i metodi
di conferma, di utilizzare l'insieme dei diciassette standard
interni di PCDD/F clorosostituiti alle posizioni 2,3,7,8 marcati
con 13C, nonche' la totalita' dei dodici standard interni di PCB
diossina-simile marcati con 13C (nel caso si debbano determinare
PCB diossina-simili).
Vanno inoltre determinati i fattori di risposta relativa per quei
congeneri ai quali non e' stato aggiunto alcun analogo marcato con
13C, utilizzando soluzioni di taratura adeguate.
- Per i mangimi d'origine vegetale e per i mangimi d'origine animale
con un contenuto di grasso inferiore al 10 %, l'aggiunta di
standard interni prima dell'estrazione e' obbligatoria. Per i
mangimi d'origine animale con un contenuto di grasso superiore al
10 %, gli standard interni possono essere aggiunti o prima
dell'estrazione o dopo l'estrazione del grasso. Occorre convalidare
adeguatamente l'efficacia dell'estrazione, a seconda della fase in
cui sono stati introdotti gli standard interni e del modo in cui i
risultati sono riportati sulla base di un prodotto o del grasso. -
Prima dell'analisi GC/MS, occorre aggiungere 1 o 2 standard di
recupero (surrogato).
- E' necessario effettuare il controllo del recupero. Per i metodi di
conferma, i recuperi dei singoli standard interni devono essere
compresi tra il 60 % e il 120 %. Recuperi inferiori o superiori per
singoli congeneri, in particolare alcune dibenzodiossine e alcuni
dibenzofurani epta e octaclorati, sono accettabili, purche' il loro
contributo al valore TE non superi il 10 % del valore totale TE
(tenendo conto unicamente di PCDD/F). Per quanto concerne i metodi
di screening, i recuperi devono essere compresi tra il 30 % e il
140 %.
- E' opportuno separare le diossine dai composti clorurati
interferenti, quali i PCB e gli eteri clorurati di difenile,
ricorrendo ad adeguate tecniche cromatografiche (di preferenza
tramite una colonna di florisil, d'allumina e/o di carbone).
- La separazione gascromatografica degli isomeri deve essere adeguata
(overlapping <25 % tra 1,2,3,4,7,8-HxCDD e 1,2,3,6,7 8-HxCDD).
- Per la determinazione, si consiglia di fare riferimento al metodo
"EPA Method 1613, Revision B: Tetra- through Octachlorinated
Dioxins and Furans by Isotope Dilution HRGCHRMS", o ad un altro
metodo con criteri di rendimento equivalenti.
- La differenza tra il livello massimo e il livello minimo non deve
essere superiore al 20 % per i mangimi con una contaminazione da
diossina pari o superiore il livello massimo. Per i mangimi che
presentano livelli di contaminazione di molto inferiori al livello
massimo, la differenza puo' essere dell'ordine del 25-40 %.
7. Metodi d'analisi di screening
7.1. Introduzione
Il metodo di screening consente di applicare vari approcci
analitici: un approccio puramente di screening e un approccio
quantitativo.
Approccio di screening
La risposta dei campioni e' confrontata con quella di un campione
di riferimento al livello considerato. I campioni la cui risposta e'
inferiore a quella del campione di riferimento sono considerati
negativi, mentre quelli con risposta superiore sono ritenuti
positivi. Requisiti:
- In ogni serie di prove si devono includere un campione di
riferimento e uno in bianco, estratti e analizzati allo stesso
tempo e alle medesime condizioni. Il campione di riferimento deve
presentare una risposta nettamente superiore a quella del bianco. -
Si devono includere campioni di riferimento supplementari con
concentrazione pari a 0,5x e 2x il livello considerato, per
dimostrare l'efficacia del test nell'intervallo considerato per il
controllo del livello considerato.
- Qualora si analizzino altre matrici, occorre dimostrare la
validita' dei campioni di riferimento, utilizzando di preferenza
campioni il cui livello di TE, stabilito tramite HRGC/HRMS, sia
equivalente a quello del campione di riferimento o di un bianco
arricchito.
- Poiche' nei biotest non si possono utilizzare standard interni, i
test di ripetibilita' sono estremamente importanti per ottenere
informazioni sullo scarto-tipo nell'ambito di una serie di test. Il
coefficiente di variazione deve essere inferiore al 30 %.
- Per quanto concerne i biotest, occorre definire quali sono i
composti-bersaglio, le potenziali interferenze e il valore massimo
tollerato per il bianco.
Approccio quantitativo
L'approccio quantitativo comprende obbligatoriamente una serie di
diluizioni-tipo, un processo di purificazione e di misurazione doppio
o triplo, nonche' analisi in bianco e controlli di recupero. Il
risultato puo' essere espresso in TE, dando per scontato che i
composti responsabili del segnale soddisfano il principio di TE. A
tale fine, si puo' impiegare la TCDD (o una miscela-tipo di
diossine/furani) per elaborare una curva di taratura che consenta di
calcolare il livello di TE nell'estratto e di conseguenza, nel
campione. Tale risultato e' poi corretto con il livello di TE
calcolato per un campione in bianco (per tenere conto di impurezze
derivanti dai solventi e dalle sostanze chimiche utilizzate) e per il
recupero (quest'ultima quantita' e' calcolata a partire dal livello
di TE in un campione di controllo qualita' la cui concentrazione e'
equivalente a quella del livello massimo considerato). E'
fondamentale tenere conto che una parte della perdita apparente del
recupero puo' essere dovuta agli effetti della matrice e/o alle
differenze tra i valori dei TEF nei biotest e i valori dei TEF
ufficiali stabiliti dall'OMS.
7.2. Requisiti per i metodi d'analisi utilizzati per lo screening
- Lo screening puo' essere effettuato tramite metodi d'analisi GC/MS
e biotest. Ai metodi GC/MS si applicano le prescrizioni stabilite
al punto 6. Prescrizioni specifiche sono stabilite al punto 7.3 per
i biotest cellulari, e al punto 7.4 per i biotest realizzati con
kit.
- Si devono fornire informazioni sul numero di risultati falsi
positivi e falsi negativi di un'ampia serie di campioni al di sopra
e al di sotto dei livelli massimi o dei valori delle soglie
d'intervento, raffrontati al contenuto di TE determinato tramite
metodo analitico di conferma. La percentuale reale di falsi
negativi deve essere inferiore all'1 %. Affinche' il metodo di
screening risulti vantaggioso, la percentuale di campioni falsi
positivi deve essere sufficientemente bassa.
- I risultati positivi devono essere sempre convalidati tramite un
metodo analitico di conferma (HRGC/HRMS). I campioni corrispondenti
a una vasta gamma di TE devono inoltre essere confermati tramite
HRGC/HRMS (circa 2-10 % dei campioni negativi). Si devono fornire
dati sulle corrispondenze tra i risultati dei biotest e quelli
della HRGC/HRMS.
7.3. Requisiti specifici per i biotest cellulari
- Quando si effettua un biotest, si deve utilizzare in ogni prova una
serie di concentrazioni di riferimento di TCDD o una miscela di
diossine/furani (curva di risposta con un R2 > 0,95 per una dose
completa). Tuttavia, ai fini dello screening, si puo' utilizzare
nell'analisi dei campioni a bassa concentrazione una curva
dettagliata nei livelli bassi.
- Per i risultati del biotest in un intervallo di tempo costante, e'
opportuno usare una concentrazione di riferimento di TCDD (circa 3x
il limite di determinazione) su un modulo di controllo della
qualita'. In alternativa, si puo' utilizzare la risposta relativa
di un campione di riferimento paragonata a una curva di taratura di
TCDD, dato che la risposta delle cellule puo' dipendere da
molteplici fattori.
- Si raccomanda di compilare e verificare i grafici del controllo
della qualita' (QC) per ogni tipo di materiale di riferimento, per
garantire che il risultato sia conforme alle linee guida indicate.
- L'induzione della diluizione utilizzata per il campione deve
situarsi nella parte lineare della curva di risposta, in
particolare per i calcoli quantitativi. I campioni che non
rientrano nella parte lineare della curva di risposta devono essere
diluiti e nuovamente analizzati. Si consiglia pertanto di
analizzare almeno 3 diluizioni alla volta.
- Lo scarto percentuale-tipo non deve essere superiore al 15 % quando
si effettua una determinazione tripla per ogni diluizione del
campione, ne' superiore al 30 % fra tre esperimenti indipendenti. -
E' possibile scegliere come limite di rilevamento un valore
equivalente a 3 volte lo scarto-tipo della soluzione di solvente in
bianco o della risposta di fondo. Un altro metodo consiste
nell'applicare una risposta che sia superiore alla risposta di
fondo (fattore d'induzione 5 volte il solvente in bianco) calcolata
dalla curva di taratura del giorno. E possibile scegliere come
limite di quantificazione un valore equivalente a 5-6 volte lo
scarto-tipo della soluzione di solvente in bianco o della risposta
di fondo oppure applicare una risposta che sia nettamente superiore
alla risposta di fondo (fattore d'induzione 10 volte il solvente in
bianco) calcolata dalla curva di taratura del giorno.
7.4. Requisiti specifici per i biotest effettuati con kit (1)
- Occorre seguire le istruzioni del fabbricante relative alla
preparazione dei campioni e alle analisi.
- Il kit non deve essere utilizzato oltre la data di scadenza
indicata.
- Non si devono utilizzare materiali o componenti previsti per altri
kit.
- I kit vanno conservati e utilizzati alle temperature di
conservazione e di impiego indicate.
- Il limite di rilevazione per gli immunodosaggi e' pari alla somma
della media e 3x lo scarto tipo, basandosi su 10 analisi ripetute
del bianco, diviso per il valore della pendenza dell'equazione di
regressione lineare.
- E' opportuno impiegare standard di riferimento per le prove di
laboratorio, al fine di garantire che la risposta allo standard
rientri in un intervallo di valori accettabile.
8. Comunicazione dei risultati
A condizione che il metodo d'analisi impiegato io consenta, i
risultati dell'analisi devono contenere i livelli dei singoli
congeneri di PCDD/F e PCB, nonche' essere indicati come limite
inferiore, limite superiore e valore intermedio, onde fornire la
maggior quantita' di dati possibile e permettere cosi' d'interpretare
i risultati in base alle prescrizioni specifiche.
La relazione deve inoltre menzionare il contenuto lipidico del
campione e il metodo impiegato per l'estrazione del grasso.
I recuperi dei singoli standard interni devono essere forniti se
si situano al di fuori dell'intervallo menzionato al punto 6 e
qualora eccedano il livello massimo; negli altri casi, dietro
richiesta.
(1) I kit per biotest attualmente in commercio non hanno dato prove
sufficienti di sensibilita' e affidabilita', tali da poterli
utilizzare per rilevare la presenza di diossine ai livelli richiesti
nei campioni di prodotti alimentari e mangimi.