descritto per le fosfomonoesterasi;
2.5. idrossido di sodio (NaOH) 0,5 M. Preparare come descritto per
le fosfomonoesterasi;
2.6. soluzione standard di p-nitrofenolo. Preparare come descritto
per le fosfomonoesterasi.
3. Apparecchiatura
3.1. Spettrofotometro UV-VIS;
3.2. pHmetro.
4. Procedimento
Porre 1 g di terreno in un matraccio da 50 mL, aggiungere 0,25 mL
di toluene, 4 mL di tampone acetato ed 1 mL di soluzione di
p-nitrofenil solfato di potassio. Agitare la miscela per alcuni
secondi quindi porla ad incubare a 37 gradi C per un'ora. Bloccare la
reazione mediante aggiunta di 1 mL di CaCl(base 2) 0,5 M e 4 mL di
NaOH 0,5 M agitando la miscela per alcuni secondi, quindi filtrare la
sospensione su filtro a fascia blu (o Whatman n. 2). Sul filtrato
eseguire la valutazione del p-nitrofenolo rilasciato seguendo le
modalita' descritte per le fosfomonoesterasi.
5. Espressione dei risultati
I risultati sono espressi in termini di mg di p-nitrofenolo
g(elevato -1) h(elevato alla -1).
Metodi IV.5.
DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITA' DEIDROGENASICA DEL SUOLO
1. Oggetto
Il presente documento fissa i metodi per la determinazione
dell'attivita' deidrogenasica del suolo.
Metodo IV.5.1.
Determinazione dell'attivita' deidrogenasica con
iodo-nitrofenilformazano
1. Principio
Il metodo si basa sulla determinazione del prodotto di reazione,
iodo-nitrofenilformazano (INTF) dopo incubazione per 2 ore di 1 g di
suolo con una soluzione di iodo nitrotetrazoliocloruro (INT). Le
determinazioni vanno eseguite entro poche ore dal prelievo, in quanto
l'attivita' puo' variare considerevolmente con il tempo ed il tipo di
suolo.
2. Reattivi
2.1. Substrato: 2 (p-iodofenil)-3-(p-nitrofenil)-5-fenil
tetrazolio cloruro (iodonitrofeniltetrazolio, INT).
2.2. 500 mg di INT sono miscelati con 2 mL di
N,N-dimetilformammide, agitati vigorosamente, trasferiti in un
matraccio da 100 mL, portati a volume con acqua distillata e tappati;
si disciolgono con ultrasuoni. La soluzione viene preparata al
momento dell'uso e tenuta al buio;
2.3. tampone: TRIS 0.1 M, pH 7.0;
2.4. sciogliere 12.1g di Tris (idrossimetil) aminometano (TRIS) in
800 mL di acqua distillata; neutralizzare con HCl diluito fino a pH
7.0, e portare ad 1 L;
2.5. soluzione estraente del formazano: N,N-dimetilformammide /
etanolo (1:1);
2.6. soluzione standard di iodonitrofenilformazano (INTF): valori
compresi nell'intervallo 0,30 mg/mL(elevato alla -1) rientrano nel
tratto lineare della retta standard.
3. Apparecchiatura
3.1. Spettrofotometro;
3.2. bagno termostatico;
3.3. agitatore;
3.4. pH-metro.
4. Procedimento
1 g di suolo umido prelevato di fresco e' posto in una provetta,
miscelato con 1.5 mL di tampone TRIS 1 M, Ph 7.0 e 2 mL di substrato
INT 0.5 %; per determinare l'attivita' deidrogenasica "naturale", si
aggiunge acqua invece del tampone. Le provette vengono tappate,
agitate leggermente e incubate a 40 gradi C al buio per 2 ore. Viene
preparato un controllo con suolo autoclavato a 121 gradi C per 20
minuti e trattato come i campioni. Le analisi si preparano in triplo.
Dopo 2 ore di incubazione, i campioni vengono trattati con 10 mL
della miscela N,N-dimetilformammide/etanolo, al buio e agitando
vigorosamente ogni 20 minuti per 1 ora, per estrarre l'INTF prodotto.
La soluzione ottenuta viene filtrata e immediatamente si eseguono
le letture allo spettrofotometro a 464 nm, usando la soluzione
estraente come bianco. Il colore e' stabile per circa 3 ore; se
occorre, si puo' diluire con la stessa soluzione estraente, per
abbassare i valori delle letture.
La concentrazione di INTF prodotto viene calcolata da una retta di
taratura che riporta l'assorbanza in funzione di concentrazioni note
di INTF.
5. Espressione dei risultati
I valori delle assorbanze relativi ai controlli (che rappresentano
la riduzione "chimica" o "abiotica" del substrato) si sottraggono da
quelli delle prove.
L'attivita' deidrogenasica viene espressa in nmoli INTF g(elevato
-1) suolo secco x 2 ore.
Metodo IV.5.2.
Metodo di determinazione dell'attivita' deidrogenasica semplificato
1. Principio
Il metodo si basa sulla determinazione del prodotto di reazione,
iodo-nitrofenilformazano (INTF) dopo incubazione per 20 ore di 1 g di
suolo con una soluzione di iodo nitrotetrazoliocloruro (INT).
2. Procedimento
Le determinazioni nei campioni e nei controlli vengono eseguiti in
triplo. E' preferibile eseguire le determinazioni entro poche ore dal
prelievo, in quanto l'attivita' puo' variare considerevolmente con il
tempo e a seconda del suolo. Il suolo (1 g) prelevato di fresco viene
pesato, posto in provette di vetro pirex, e umidificato al 60% della
sua capacita' di ritenzione idrica. Si aggiungono 0.2 mL di INT,
disciolto allo 0.4% in acqua distillata (per sciogliere l'INT in
acqua occorre agitare vigorosamente o utilizzare ultrasuoni). Si pone
ad incubare al buio per 20 ore a temperatura ambiente o, se
disponibile, in camera buia termostatata a 20 gradi C. Si aggiungono
10 mL di una soluzione estraente composta da tetracloroetilene e
acetone (1/1.5), si agita energicamente a mano per 1 minuto
(l'estraente si addiziona subito prima di agitare), si filtra su
carta Watmann N. 41 (se possibile si centrifuga a 4000 giri
min(elevato alla -1), per 5 minuti).
La concentrazione di INTF estratto si determina mediante lettura
spettrofotometrica a 490 nm, utilizzando come bianco la soluzione
estraente.
3. Espressione dei risultati
Le letture di assorbanza delle prove, sottratte dei valori
relativi ai controlli, vengono trasformate in mg INTF mL(elevato alla
-1) mediante una retta di taratura preparata con concentrazioni note
di INTF (1, 2, 2.5, 5.0, 10 mg mL(elevato alla -1)) disciolto nella
soluzione estraente. L'attivita' deidrogenasica si esprime come mg di
INTF prodotto per g di suolo secco (considerando il contenuto di
umidita) per ora di incubazione (mg INTF g(elevato -1) h(elevato alla
-1)).
Calcolo:
----> INSERIRE IMMAGINE PAGINA 63 <----
v* = volume di acqua necessario per mantenere il suolo al 60% della
sua capacita' massima di ritenzione idrica + volume di substrato
aggiunto.