ALLEGATO 5
METODI ANALITICI
1. PARAMETRI CHIMICI E CHIMICO-FISICI
Per il controllo dei parametri chimici e chimico-fisici
valgono i metodi analitici allegati al DPR 24 maggio 1988 n.
236 relativo alle acque destinate al consumo umano, secondo
le frequenze e le modalita' di campionamento previste dal
presente regolamento.
2. PARAMETRI MICROBIOLOGICI.
2.1. Prelievo dei campioni.
I prelievi dovranno essere effettuati con bottiglie
sterili, seguendo le usuali norme di asepsi.
Le bottiglie dovranno contenere sempre una quantita' di
sodio tiosolfato idonea a neutralizzare il cloro presente
nell'acqua prelevata. Cio' si ottiene mediante l'aggiunta,
nelle bottiglie da prelievo, prima della sterilizzazione, di
una quantita' tale di sodio tiosolfato da ottenere una
concentrazione finale, nel campione di circa 100 mg/litro.
In pratica e' consigliabile l'aggiunta di una soluzione al
10% di sodio tiosolfato nella quantita' di ml 0,1 (2 gocce)
per ogni 100 ml di capacita' della bottiglia.
I campioni prelevati dovranno essere trasportati in idoneo
contenitore frigorifero che consente il mantenimento di una
temperatura compresa fra i 4 ed i 10C, e dovranno essere
esaminati nel piu' breve tempo possibile e comunque entro 24
ore dal prelievo.
2.2. ESAME BATTERIOLOGICO.
Il campione al momento dell'esame, deve essere
energicamente agitato al fine di ottenere una omogenea
distribuzione del suo contenuto batterico.
2.2.1. Ricerca dei coliformi totali.
2.2.1.1.Ricerca in terreno liquido (Sistema dei tubi multipli MPN).
2.2.1.1.1. Prova presuntiva.
Viene effettuata mediante semina di quantita' note
dell'acqua in esame in idoneo terreno di coltura (Brodo
lattosato - Vedi).
Per verificare la presenza o l'assenza di coliformi totali
in ml 100, sara' sufficiente procedere, per ogni singolo
campione, alla semina di una aliquota di ml 100 in una beuta
contenente ml ml 100 di brodo lattosato a concentrazione
doppia.
2.2.1.1.2. Prova di conferma.
Le aliquote seminate in cui si verifichi dopo 24 o 48 ore
di incubazione a 36 piu' o meno 1C la produzione di gas,
devono essere sottoposte a conferma in tubi di Brodo Bile
Verde brillante a 36C piu' o meno 1C per 48 ore.
Le letture dei tubi di BBVB vanno effettuate, per la
presenza di gas, dopo 24 o 48 ore di incubazione.
Sulla base dei risultati riportare il valore come MPN/100
ml di campione, utilizzando la tabella allegata.
2.2.1.2. Ricerca con il metodo delle membrane filtranti (MF).
Una aliquota di ml 100 del campione in esame viene
filtrata su membrana.
Incubare la membrana su M-Endo-Agar LES (Vedi) a 36C piu'
o meno 1C per 24 ore.
Contare le colonie rosse con o senza riflesso metallico.
2.2.2. Ricerca degli streptococchi fecali.
2.2.2.1.Ricerca in terreno liquido (Sistema dei tubi multipli o
MPN).
2.2.2.1.1. Prova presuntiva.
Viene effettuata mediante semina di quantita' note
dell'acqua in esame in idoneo terreno di coltura (Azide
Dextrose Broth - Vedi)
Per verificare la presenza o l'assenza degli streptococchi
fecali in ml 100, sara' sufficiente provvedere per ogni
singolo campione, alla semina di una aliquota di ml 100 in
una beuta contenente ml 100 di terreno (Aide Dextrose Broth)
concentrazione doppia e incubare a 36C piu' o meno 1C per
24 e 48 ore.
2.2.2.1.2. Prova di conferma.
Le aliquote seminate in cui si verifichi, dopo 24 o 48 ore
di incubazione a 36C piu' o meno 1C, un intorbidamento
visibile, devono essere sottoposti a conferma in tubi di
Ethyl-Violet-Azide-Broth (Eva Broth) a 36C piu' o meno 1C
per 48 ore. Vengono considerati positivi i tubi che
presentano sul fondo un deposito color porpora. Sulla base
dei risultati riportare il valore come MPN/100 ml di
campione.
2.2.2.2.Ricerca con il metodo delle membrane filtranti (MF).
Un'aliquota di ml 100 del campione in esame viene filtrata
su membrana.
Incubare la membrana su KF streptococcus agar (vedi) per
48 piu' o meno 3 ore a 44C 0,2C.
2.2.3. Colonie su Agar a 36C piu' o meno 1C.
Considerato il limite previsto dalla normativa (100
colonie/1 ml per l'acqua di immissione e 300 colonie/1 ml per
l'acqua in vasca) e' consigliabile procedere alla semina di 1
ml per i campioni di acqua di immissione e di 0,1 ml per i
campioni di acqua prelevati in uscita. Effettuare le semine
in agar-germi usando agar per il conteggio delle colonie
(vedi). Incubare a 36C piu' o meno 1C per 48 ore. Contare
le colonie e riportare il valore a ml 1 campione.
2.2.4. Pseudomonas (genere).
Filtrare ml 100 di campione su membrana.
Incubare a 36C piu' o meno 1C per 48 ore su terreno alla
Cetrimide (vedi).
Per la determinazione del numero di Pseudomonas presenti nel
campione, contare tutte le colonie che si sono sviluppate e
riportare il valore come Pseudomonas (genere) per 100 ml.
2.2.5. Straphilococcus (genere).
Filtrare ml 100 di campione attraverso membrana.
Incubare a 35C piu' o meno 1C per 48 ore su Agar-Sale-
Mannite (vedi 2.3.9).
Per la determinazione del numero di stafilococchi presenti
nel campione contare tutte le colonie gialle e riportare il
valore come Staphilococcus (genere) per 100 ml.
2.3. APPENDICE: TERRENI DI COLTURA.
Tutti i terreni di seguito descritti devono essere
preferibilmente preparati partendo dai prodotti disidratati
del commercio.
2.3.1. Brodo lattosato
Composizione:
Estratto di carne g 3
Peptone g 5
Lattosio g 5
Acqua distillata ml 1000
pH finale da 6,8 a 7,0
Per preparare il terreno a concentrazione semplice, pesare g
13 di polvere e sciogliere a caldo in un litro di acqua
distillata.
Per preparare il terreno a concentrazione doppia pesare g
26 di polvere e sciogliere a caldo in un litro di acqua
distillata.
Distribuire in idonei recipienti da fermentazione,
sterilizzare in autoclave a 121C per 15 minuti.
Il terreno pronto per l'uso, alla temperatura di 15 a
30C, si conserva per circa una settimana.
2.3.2. Brodo - bile - verde brillante
Composizione:
Peptone g 10,0
Bile in polvere g 20.0
Lattosio g 10,0
Verde brillante g 0,0133
Acqua distillata ml 1000
pH finale da 7,0 a 7,4
Pesare g 40 di polvere e sciogliere a caldo in un litro di
acqua distillata. Distribuire in tubi da fermentazione.
Sterilizzare in autoclave a 121C per 15 minuti.
Il terreno pronto per l'uso alla temperatura di 2 a 8C, si
conserva per circa una settimana.
2.3.3. m-Endo-Agar LES
Composizione:
Estratto di lievito g 1,2
Idrolisato enzimatico di caseina g 3,7
Thiopeptone o thiotone peptone g 3,7
Idrolisato enzimatico di
proteine (Triptone o altro
equivalente) g 7,5
Lattosio g 9,4
K HPO g 3,3
KH PO g 1,0
Sodio cloruro g 3,7
Sodio desossicolato g 0,1
Sodio laurilsolfato g 0,05
Sodio solfito g 1,6
Fucsina basica g 0,8
Agar g 15,0
pH finale da 7,0 a 7,4
Pesare g 51 di polvere e disciogliere a 100C, in un litro di
acqua distillata alla quale sono stati aggiunti ml 20 di
alcool etilico.
Raffreddare a 45 a 50C e distribuire in piastre di Petri.
Il terreno distribuito in piastre si conserva a 2 a 8C per
circa una settimana.
2.3.4. Azide - dextrose broth
Composizione:
Estratto di carne g 4,5
Peptone triptico g 15,0
Destrosio g 7,5
Sodio cloruro g 7,5
Azide sodica g 0,2
Acqua distillata ml 1000
pH finale da 7,0 a 7,4
Pesare g 34,7 di polvere e sciogliere a caldo in un litro di
acqua distillata.
Distribuire in tubi.
Sterilizzare in autoclave a 121C per 15 minuti.
Il terreno pronto per l'uso si conserva a 2 a 8C per circa
una settimana.
2.3.5. Ethil violet azide broth (EVA broth)
Composizione:
Peptone triptico g 20,0
Destrosio g 5,0
K HPO g 2,7
KH PO g 2,7
Sodio cloruro g 5,0
Azide sodica g 0,4
Etil violetto g 0,00083
Acqua distillata ml 1000
pH finale da 6,8 a 7,2
Pesare g 35,8 di polvere e sciogliere a caldo in un litro di
acqua distillata.
Distribuire in tubi.
Sterilizzare in autoclave a 121C per 15 minuti.
Il terreno pronto per l'uso si conserva a 15 a 30C per circa
una settimana.
2.3.6. KF - streptococcus agar
Composizione:
Peptone g 10,0
Estratto di lievito g 10,0
Sodio cloruro g 5,0
Sodio glicerofosfato g 10,0
Maltosio g 20,0
Lattosio g 1,0
Azide sodica g 0,4
Bromo - cresol - porpora g 0,015
Agar g 20,0
Acqua distillata ml 1000
pH finale da 7,0 a 7,4
Pesare g 76,4 di polvere e sciogliere in un litro di acqua
distillata. Portare ad ebollizione per 5 minuti. Distribuire
in beuta in ragione di ml 100 per beuta. Raffreddare fino a
50C ed aggiungere in ogni beuta ml 1 di una soluzione all'1%
di TTC (trifeniltetrasodiocloruro). Mescolare accuratamente.
Far raffreddare intorno ai 45C e distribuire in piastra di
Petri.
Il terreno pronto per l'uso si conserva al buio e a 2 a 8C
per circa una settimana.
2.3.7. Agar per il conteggio delle colonie
Composizione:
Peptone g 5,0
Estratto di lievito g 2,5
Destrosio g 1,0
Agar g 15,0
Acqua distillata ml 1000
pH finale da 6,8 a 7,2
Pesare g 23,5 di polvere e sciogliere a caldo in un litro di
acqua distillata.
Distribuire e sterilizzare a 121C per 15 minuti.
Il terreno pronto per l'uso si conserva a 15 a 30C per
una settimana circa.
2.3.8. Terreno alla cetrimide
Composizione del terreno base:
Peptone g 20,0
Magnesio cloruro g 1,4
Potassio solfato g 10,0
Cetrimide g 0,3
Agar g 13,6
pH finale da 7,0 a 7,4
Pesare g 45,3 di polvere e sospendere in un litro di acqua
distillata. Aggiungere ml 10 di glicerolo e disciogliere
portando ad ebollizione.
Distribuire e sterilizzare a 121C per 15 minuti.
Il terreno pronto per l'uso si conserva a 2 a 8C per circa
una settimana.
2.3.9. Agar sale mannite
Composizione:
Peptone g 10,0
Estratto di carne g 1,0
D-Mannitolo g 10,0
Sodio cloruro g 75,0
Agar g 15,0
Rosso fenolo g 0,025
Acqua distillata ml 1000
pH finale da 7,2 a 7,6
Pesare g 111 di polvere e disciogliere in un litro di acqua
distillata portando ad ebollizione. Sterilizzare in autoclave
a 121C per 15 minuti. Distribuire in piastre. Il terreno
pronto per l'uso si conserva a 2 a 8C per circa una
settimana.