METODO 16
ESTRAZIONE, FRAMMENTAZIONE E DETERMINAZIONE
DEL CARBONIO ORGANICO ESTRATTO ED UMIFICATO
1. Oggetto e campo di applicazione
Descrizione di un metodo per:
1.1. Estrazione del carbonio organico in soda e sodio pirofosfato;
1.2. Frazionamento del carbonio organico umificato presente negli
estratti (1.1) mediante l'uso di apposito supporto cromatografico;
1.3. Determinazione per ossidazione con bicromato di potassio del
carbonio organico degli estratti e dei liquidi frazionati;
1.4. Definizione ed espressione dei parametri di umificazione.
Il metodo e' applicabile a tutti i tipi di suolo.
2. Principio
Le sostanze non umificate presenti negli estratti organici del
terreno si ritrovano soprattutto nella frazione solubile in acidi, ma
sono separabili da quelle umificate perche' non assorbite dal
polivinilpirrolidone. Le sostanze umiche possono essere
successivamente lisciviate con soluzione alcalina e mescolate alla
frazione umica.
3. Reagenti
Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o di purezza
equivalente e reagenti di qualita' analitica riconosciuta.
Nel caso venga adottata la titolazione in automatico, i reagenti di
cui ai punti 3.10 e 3.11 non sono necessari.
3.1. Soluzione estraente di soda e sodio pirofosfato 0,1 mol/l:
pesare 44,6 g di Na4P2O7 per 10H2O in un matraccio da 1000 ml,
aggiungere 4 g di NaOH, sciogliere in circa 900 ml di acqua e portare
a volume.
3.2. Azoto gassoso.
3.3. Acido solforico, H2SO4, al 50% (v/v) a partire da H2SO4 al 96%
(m/m) (rho = 1,84).
3.4. Acido solforico, H2SO4, soluzione 0,005 mol/l: portare 10 ml di
acido solforico 1 N prelevati con buretta a 1000 ml con acqua.
3.5. Polivinilpirrolidone resina insolubile (del tipo PVP Cod.
85648/7 Aldrich, Germania).
3.6. Sodio idrossido, NaOH, soluzione 0,5 mol/l: pesare 20 g di sodio
idrossido gocce in un matraccio da 1000 ml. Sciogliere con circa 200
ml di acqua, raffredare e completare a volume.
3.7. Acido solforico, H2SO4, 96% (m/m) (rho = 1,84).
3.8. Potassio bicromato, K2Cr2O7, soluzione 1/6 mol/l: porre 49,04 g
di K2Cr2O7, polverizzato ed essiccato per un'ora da 130 a 140 C, in
un matraccio tarato da 1000 ml ed aggiungere circa 800 ml di acqua.
Agitare sino a diluzione completa, portare a volume con acqua ed
omogeneizzare.
3.9. Acido fosforico, H3PO4, all'85% (rho = 1,7).
3.10. Ferro solfato (II), FeSO4 per 7H2O, soluzione 0,2 mol/l:
sciogliere 55,6 g di solfato ferroso in circa 500 ml di acqua,
agitare fino a completa dissoluzione ed aggiungere 10 ml di H2SO4
(3.7). Raffreddare, portare a volume con acqua ed omogeneizzare. La
soluzione deve essere preparata giornalmente.
3.11. Acido 4-difenilammina solfonato sodico, C12H10NaNO3S,
indicatore: porre 0,2 g di acido 4-difenilamminsolfonato sodico in un
matraccio tarato da 100 ml, sciogliere in H2SO4 (3.7) e portare a
volume sempre in H2SO4 (3.7).
4. Apparecchiatura
Al fine di avere maggiore uniformita' nel procedimento analitico si
consiglia di usare vetreria tipo Duran.
Corrente attrezzatura da laboratorio e in particolare:
4.1. Stufa.
4.2. Agitatore a scosse in bagno d'acqua termoregolabile a 65 C
(agitatore del tipo Dubnoff).
4.3. Centrifuga.
4.4. Tubi da centrifuga da 40 ml e da 150 ml.
4.5. Unita' filtrante composta da beuta per vuoto, attacco per
filtrazione e pompa a vuoto (e' sufficiente anche una normale pompa
ad acqua).
4.6. Filtri da 0,45 um del tipo HA della Millipore (comunque non in
cellulosa).
4.7. Siringhe ipodermiche da 10 ml.
4.8. Lana di vetro in fibre.
4.9. Matraccio del tipo illustrato nel metodo 14 (figura 14.1).
4.10. Termometro con scala fino a 200 C con graduazioni di 1C e
porta-termometro come illustrato nel metodo 14.
4.11. Bunsen con piastre di protezione in vetroceramica tipo Ceran
della Duran.
4.12. Titolatore automatico dotato di elettrodo combinato di
Pt-Ag/AgCl (opzionale).
5. Procedimento
5.1. Preparazione del campione per l'analisi
Preparare il campione come descritto nel metodo 2, setacciato a 0,5
mm.
5.2. Estrazione del carbonio organico
5.2.1. Pesare 10 g di terreno in provetta a chiusura ermetica da 250
ml, addizionare 100 ml di soluzione estraente (3.1), insufflare per 1
minuto con azoto (3.2), tappare ermeticamente, porre in agitatore a
scosse (regolato a 65 C e 80 scosse al minuto) per 24 ore.
5.2.2. Raffreddare il matraccio in bagno freddo e travasare
quantitativamente in tubo da centrifuga da 150 ml. Centrifugare a
2500-2700 giri/minuto per 20 minuti. Filtrare il surnatante su filtri
4.6. Travasare il filtrato in recipiente pulito ed asciutto,
insufflare nuovamente azoto (3.2) per un minuto e tappare
ermeticamente.
5.2.3. I campioni, se non vengono analizzati in giornata, possono
essere conservati in frigorifero a 4 C, ma solo per alcuni giorni.
5.3. Frazionamento del carbonio organico umificato
5.3.1. Preparazione del polivinilpirrolidone (PVP)
Introdurre circa 50 g di polvere di polivinilpirrolidone insolubile
(3.5) in un contenitore trasparente almeno da 1 a 1,5 litri,
aggiungere acqua di rubinetto ed agitare molto accuratamente la
miscela. Lasciare decantare le parti piu' grossolane per circa da 10
a 15 minuti e scartare le frazioni piu' fini. Ripetere l'operazione
con acqua di rubinetto per due volte. Lavare per due volte con acqua
distillata la frazione fine ancora in sospensione, quindi aggiungere
la soluzione di H2SO4 (3.4) in quantita' tale da acidificare la
resina. Il PVP cosi' preparato deve essere conservato in contenitore
chiuso, anche a temperatura ambiente, ma sempre ricoperto di
soluzione.
5.3.2. Preparazione delle colonnine
Le colonnine possono essere preparate utilizzando delle siringhe
ipodermiche in plastica da 10 ml (4.7), eliminando l'ago ed inserendo
al suo posto 10 cm circa di tubicino di gomma. Alla base della
siringa viene posto uno strato di circa 0,5 cm di fibre di lana di
vetro (4.8) opportunamente pressato per evitare la fuoriuscita del
PVP. Le colonnine devono essere fissate ad un supporto rigido in
posizione verticale e non devono essere mosse dopo essere state
caricate con la resina. Il caricamento di PVP viene effettuato
versando la sospensione acida dall'estremita' superiore della
colonnina stessa, lasciando sedimentare. L'operazione viene
interrotta quando il volume riempito e' attorno ai 4-6 ml, facendo
attenzione poi a non fare seccare la colonnina dopo aver concluso la
preparazione.
5.3.3. Frazionamento su resina di polivinilpirrolidone
5.3.3.1. Pipettare 25 ml di estratto totale (5.2), porlo in provetta
da centrifuga da 40 ml circa, aggiungere da 0,3 a 0,5 ml di H2SO4 al
50% (3.3) fino a pH < 2, tappare, agitare accuratamente e lasciare
riposare per qualche minuto. Quindi mettere la provetta in centrifuga
da 2.500 a 2.700 giri/minuto, per 20 minuti, togliere il surnatante e
versarlo sulla colonnina preventivamente preparata. Scartare
l'eluato e continuare il lavaggio della colonnina con circa 25 ml di
H2SO4 (3.4). Terminata l'operazione aggiungere lentamente sulla
sommita' della colonnina la soluzione di NaOH (3.6) che consentira'
al materiale adsorbito sul PVP di scendere. Il fenomeno e'
solitamente ben visibile in quanto le sostanze polifenoliche
adsorbite sul PVP sono di colore bruno chiaro-arancio e sono
sufficienti da 3 a 4 ml per fare arrivare la soluzione colorata
all'estremita' della colonnina.
5.3.3.2. Inserire sotto la colonnina la provetta nella quale e'
precipitata la frazione umica e proseguire il lavaggio utilizzando da
20 a 25 ml (o, se necessario, volumi superiori) di NaOH (3.6).
Travasare quantitativamente la soluzione contenente gli acidi umici
ora disciolti e gli acidi fulvici, provenienti dal lavaggio della
colonnina, in un matraccio da 50 ml (talvolta per terreni
particolarmente ricchi di acidi umici come istosuoli e mollisuoli, e'
necessario utilizzare matracci di volume superiore) e portare a volu-
me con NaOH (3.6). Agitare e conservare estratto totale e acidi umici
+ fulvici in frigorifero per la successiva determinazione del
carbonio organico.
5.4. Preparazione della soluzione per la titolazione
5.4.1. Dalle soluzioni, ottenute secondo quanto descritto nelle
sezioni 5.2 e 5.3, prelevare un'aliquota contenente una quantita' di
carbonio compresa tra 5 e 25 mg e comunque non superiore a 10 ml di
volume e trasferirla in un matraccio da attacco (4.9). Per prelievi
inferiori a 10 ml aggiungere, a seconda dei casi, soluzione estraente
(3.1) o acqua fino a raggiungere il volume di 10 ml.
5.4.2. Addizionare all'estratto, per mezzo di una buretta, 5 ml
esatti di soluzione di K2Cr2O7 (3.2) e successivamente goccia a
goccia, o comunque molto lentamente, 20 ml esatti di H2SO4 (3.7),
raffreddando in bagno di acqua e ghiaccio in modo che la temperatura
della soluzione venga mantenuta tra 40 e 50 C. Inserire il
termometro (4.10) in modo che il bulbo non tocchi il fondo del
matraccio.
5.4.3. Posizionare il matraccio su bunsen su piastra di tipo Ceran
(4.11) precedentemente riscaldata e portare la temperatura della
soluzione il piu' rapidamente possibile alla temperatura di 160 piu'
o meno 2 C. Mantenere queste condizioni per 10 minuti esatti,
agitando di tanto in tanto. Al termine raffreddare a temperatura
ambiente, trasferire quantitativamente in beuta da 250 ml, lavando
piu' volte il matraccio d'attacco, fino circa 100 ml, quindi lasciare
raffreddare.
5.5. Prove in bianco
Le soluzioni per le prove in bianco sono:
5.5.1. Carbonio organico estraibile (5.2): soluzione di soda e sodio
pirofosfato (3.1).
5.5.2. Carbonio umico + fulvico (5.3): soluzione di NaOH (3.6)
acidificata a pH da 1 a 1,5 con H2SO4 al 50% (3.3).
5.5.3. Prova in bianco a caldo: prelevare 10 ml della soluzione in
esame e trasferirla in un matraccio da attacco (4.9). Addizionare poi
alla soluzione per mezzo di una buretta 5 ml esatti di K2Cr2O7 (3.8),
procedendo poi come indicato al punto 5.4.
5.5.4. Prova in bianco a freddo: prelevare 10 ml della soluzione in
esame e trasferirla in un matraccio da attacco (4.9). Addizionare poi
all'estratto, per mezzo di una buretta, 5 ml esatti di soluzione di
K2Cr2O7 (3.8) e successivamente goccia a goccia, o comunque molto
lentamente, 20 ml esatti di H2SO4 (3.7), raffreddando in bagno di
acqua e ghiaccio in modo che la temperatura della soluzione venga
mantenuta tra 40 e 50 C. Non scaldare la soluzione, ma trasferirla
quantitativamente e direttamente in beuta da 250 ml, lavando piu'
volte il matraccio d'attacco fino a circa 100 ml, quindi lasciare
raffreddare.
5.6. Titolazione
5.6.1. Titolazione manuale: aggiungere alla soluzione da titolare 10
ml di acido fosforico (3.9) e 4 gocce di indicatore (3.11). Titolare
l'eccesso di K2Cr2O7 con ferro solfato (3.10) fino al viraggio dal
violetto al verde, usando una sorgente luminosa al di sotto della
beuta. Titolare allo stesso modo sia la prova in bianco a freddo, sia
quella a caldo.
5.6.2. Titolazione in automatico: si procede allo stesso modo
descritto al punto precedente, ma in questo caso si omette l'aggiunta
al campione dell'acido fosforico e dell'indicatore.
6. Espressione dei risultati
6.1. I contenuti in carbonio organico si esprimono in g/kg, senza
cifre decimali.
6.2. I parametri dell'umificazione si esprimono in percentuale, con
una cifra decimale.
6.3. Il contenuto in carbonio organico, espresso in g/kg, determinato
nelle soluzioni ottenute secondo la sezione 5.2 e 5.3, si ricava
dalla relazione:
(B - Bl) per N1 per D per 3
C = ----------------------------
P
data da:
(B - Bl) per N1 per D per 0,003 per 1000
C = -----------------------------------------
P
dove:
B e' il volume, espresso in millilitri, di soluzione di ferro solfato
(3.10) consumata per titolare la prova in bianco a caldo;
Bl e' il volume, espresso in millilitri, di soluzione di ferro
solfato (3.10) consumata per titolare il campione;
N1 e' la normalita' reale di ferro solfato, calcolata facendo il
rapporto fra i 5 ml di K2Cr2O7 1N presenti nella prova in bianco a
freddo (5.5.4) ed i ml di FeSO4 utilizzati per titolarli, cioe':
5
------------------------------------------------
ml FeSO4 per tiolare prova in bianco a freddo
La sua determinazione e' richiesta per eliminare sia l'errore dovuto
alla minima decomposizione del K2Cr2O7 durante il riscaldamento a 160
C, sia per normalizzare la soluzione di FeSO4. Fare attenzione alla
differenza tra le quantita' di FeSO4 utilizzate per la titolazione
della prova in bianco a freddo e quelle utilizzate per la titolazione
della prova in bianco a caldo. Se tale differenza supera 0,4 ml, e'
opportuno ripetere sia le prove in bianco, sia verificare l'esatta
normalita' del FeSO4.
D e' il fattore di diluizione, calcolato in base all'aliquota
prelevata per la determinazione rispetto al volume totale
dell'estratto;
0,003 e' il peso equivalente del carbonio;
P e' la massa del terreno sottoposto ad analisi, in grammi.
6.4. Parametri dell'umificazione
6.4.1. Dati necessari
Per il calcolo dei parametri dell'umificazione sono necessari i
seguenti dati:
Carbonio organico totale presente nel materiale tal quale (TOC),
determinato con il metodo Springer e Klee (metodo 14);
Carbonio organico dell'estratto totale (TEC), determinato con il
presente metodo (5.2);
Carbonio organico estratto umificato (acidi umici + fulvici, HA +
FA), determinato con il presente metodo (5.3);
Carbonio organico estratto e non umificato (NH), ottenuto per
differenza:
NH = (TEC - (HA + FA))
6.4.2. Calcolo dei parametri dell'umificazione
6.4.2.1. Il grado di umificazione (DH%), ovvero la percentuale del C
organico umico presente nell'estratto rispetto al C totale
dell'estratto, si ricava dalla relazione:
(HA + FA)
DH% = 100 . -----------
TEC
6.4.2.2. Il tasso di umificazione (HR%), ovvero la percentuale del C
organico umico presente nell'estratto rispetto al C totale presente
nel campione, si ricava dalla relazione:
(HA + FA)
HR% = 100 . ----------
TOC
6.4.2.3. L'indice di umificazione (HI), ovvero il rapporto fra il
carbonio non umico dell'estratto e quello umico, si ricava dalla
relazione:
NH
HI = -----------
(HA + FA)