ALLEGATO
           METODO PER LA DIFFERENZIAZIONE DELLA CHIMOSINA
           MICROBICA - DNA RICOMBINANTE DAL CAGLIO ANIMALE
Scopo.
   Il  metodo  consente  di  differenziare la chimosina microbica dal
caglio animale (vitello, bovino, misto).
Principio del metodo.
   La chimosina di origine microbica viene differenziata  dal  caglio
animale  mediante  separazione  su  colonna  cromatografica  HPLC  ad
esclusione    molecolare    (size    exclusion)     e     rivelazione
spettrofotometrica UV.
Attrezzature.
   Cromatografo liquido HPLC
   Rivelatore UV
   Colonna  "size  exclusion"  del tipo SE-250 Zorbax (4 m, 150 A, pH
3-9), per macromolecole da 4000-400.000 daltons.
Reattivi.
   Acqua per HPLC.
   Soluzione di Na2HPO4pH7
 Condizioni cromatografiche.
   Eluizione isocratica
   Flusso eluente 1 ml/min
   Temperatura della colonna 25 ›C
   Rivelazione a lunghezza d'onda di 225 nm
Preparazione del campione.
   I campioni liquidi vengono  filtrati  su  filtro  da  0,45  um  ed
iniettati  in  colonna per la separazione cromatografica e successiva
rivelazione.
   I campioni solidi  vengono  disciolti  nell'eluente,  filtrati  su
filtro da 0,45 um ed iniettati in colonna.
Risultati e discussione.
   La   chimosina   microbica   -   DNA   ricombinante   presenta  un
cromatogramma   caratterizzato   dalla   presenza   di    un    picco
cromatografico  principale  associato  ad altre frazioni, presenti in
quantita' non significative, mentre nel  caglio  sono  evidenziabili,
oltre  al  picco cromatografico della chimosina animale, altri picchi
piu' o meno risolti dalla chimosina, di pari o  maggiore  intensita',
relativi   alle  altre  macromolecole  presenti  nel  caglio  animale
(pepsine ecc.).
   La  metodica  consente  pertanto  di  differenziare  la  chimosina
microbica - DNA ricombinante dal caglio animale.