ALLEGATO
METODI UFFICIALI DI ANALISI PER LE SEMENTI
1 - CAMPIONAMENTO
Al fine di conseguire risultati di analisi validi e ripetibili e'
indispensabile che il campione sia rappresentativo del lotto di seme
da cui viene prelevato e che nel prelievo dei campioni venga
applicata la idonea metodologia.
Le metodologie di campionamento, per l'applicazione delle leggi
vigenti che disciplinano l'attivita' sementiera, sono indicate nel
presente capitolo.
1.1. LOTTO DI SEME
Il lotto e' la quantita' di seme fisicamente identificabile e
uniforme, di peso non superiore a quello indicato nella successiva
sezione 1.1.2., a cui si riferisce un certificato di analisi.
1.1.1. Uniformita' del lotto
Caratteristica distintiva del lotto e' la sua uniformita', della
quale deve accertarsi il tecnico che effettua il campionamento.
Qualora egli ritenga che il lotto da campionare sia disforme, la
ditta deve procedere ad un rimescolamento della massa al fine di
renderla uniforme; oppure, ove e' possibile, l'intera massa di seme
potra' anche essere ripartita in due o piu' frazioni, ciascuna
costituente un lotto diverso.
1.1.2. Peso del lotto
Un lotto di seme non deve superare i pesi indicati, per ciascuna
specie, nella colonna 3 delle tabelle di cui all'allegato I, con una
tolleranza in piu' del 5%. I quantitativi eccedenti tali limiti
costituiscono un nuovo lotto.
Per le specie non indicate nell'allegato I il peso massimo del
lotto e' uguale a quello delle specie con semi di analoghe dimensioni
citate nella tabella stessa.
1.1.3. Identificazione del lotto
Ogni lotto di seme deve essere opportunamente marcato per poterlo
identificare e distinguere da ogni altro lotto.
All'atto del campionamento tutte le confezioni costituenti un lotto
devono essere contrassegnate mediante l'apposizione di etichette
(anche adesive) o mediante marcatura indelebile direttamente sulla
confezione e devono essere sigillate.
Una confezione deve essere considerata sigillata quando e'
chiaramente impossibile aprirla senza che venga distrutto il sigillo
o rimanga evidente prova di manomissione (es. sacchi di plastica
sigillati a caldo, barattoli di latta, ecc.).
1.2. CAMPIONAMENTO DEL LOTTO
1.2.1. Definizioni
a) Campione elementare: e' la quantita' di seme che proviene da
ogni singolo prelievo effettuato sul lotto.
b) Campione globale: e' la quantita' di seme che si ottiene unendo
e mescolando tutti i campioni elementari.
c) Campione medio finale di prelevamento: e' la quantita' di seme,
di peso non inferiore a quello indicato nella colonna 4 delle tabelle
di cui all'allegato I che, prelevata con opportuni metodi dal
campione globale, viene inviata al laboratorio. Dal campione globale
si possono prelevare piu' campioni medi finali a seconda della
finalita' del campionamento.
d) Campione di analisi: e' la quantita' di seme prescritta per
l'analisi, prelevata in laboratorio dal campione medio finale di
prelevamento che, nel caso dell'analisi della purezza e della
determinazione del numero di semi estranei, deve essere di peso non
inferiore a quello indicato nelle colonne 5 e 6 delle tabelle di cui
all'allegato I.
1.2.2. Frequenza di campionamento
Il numero minimo di campioni elementari da prelevare da ciascun
lotto, secondo le modalita' indicate nella successiva sezione 1.2.4.,
e' il seguente:
a) Se il seme e' in sacchi da 100 kg o in confezioni similari e di
dimensioni uniformi:
fino a 5 confezioni: 1 campione ogni imballaggio, ma comunque non
meno di 5 campioni elementari;
fino a 30 confezioni: almeno 1 campione ogni 3 confezioni e
comunque non meno di 5 campioni elementari;
oltre le 30 confezioni: almeno 1 campione ogni 5 confezioni e
comunque non meno di 10 campioni elementari.
b) Se le confezioni sono di peso inferiore a 100 kg, si raggruppano
piu' confezioni fino a raggiungere l'unita' di campionamento piu'
prossima per difetto a 100 kg, (es.: 4 confezioni da 25 kg o 30
confezioni da 3 kg, o 1 confezione da 60 kg e una da 30 kg). Si pro-
cede poi come al punto a).
c) Se il campionamento e' effettuato su seme sfuso (in mucchio, in
cassoni, in vagoni, ecc.) o che si muove in flusso continuo la
frequenza del campionamento e' la seguente:
fino a 500 kg: almeno 5 campioni elementari, fatta eccezione per i
lotti inferiori a 50 kg dai quali occorre prelevare almeno 3 campioni
elementari;
da 501 a 3000 kg: 1 campione elementare ogni 300 kg ma non meno di
5 campioni elementari;
da 3001 a 40000 kg: 1 campione elementare ogni 500 kg ma non meno
di 10 campioni elementari.
d) Per documentata carenza o elevato costo del seme il
campionamento viene effettuato in modo che, pur mantenendo le
frequenze sopra indicate, si pervenga al quantitativo di seme
previsto alla sezione 1.3.3 b).
1.2.3. Strumenti di campionamento o sonde
a) Sonda lunga (m 1) per sacchi:
1) Tipo per semi grossi - (es. frumento, mais, bietola) a due tubi
cilindrici ruotanti l'uno internamente all'altro, divisi in 6
compartimenti rettangolari; dimensioni come da fig. 1a.
2) Tipo per semi piccoli - (es. medica, cipolla, loietto, ecc.) a
due tubi cilindrici ruotanti l'uno internamente all'altro, divisi in
9 compartimenti rettangolari; dimensioni come da fig. 1b.
b) Sonda lunga (m 2) per casse, silos, ecc. - a due tubi
cilindrici, ruotanti l'uno internamente all'altro, divisi in 11
compartimenti rettangolari; dimensioni come da fig.1c.
c) Sonda corta (m 0,40) - a due tubi cilindrici senza partizioni,
ruotanti l'uno internamente all'altro, provvisti di un'unica apertura
rettangolare lunga 230 mm, con una punta conica con vertice distante
70 mm dall'inizio della finestra e aperta all'impugnatura:
1) Tipo per semi grossi - diametro del tubo esterno 18 mm,
larghezza della finestra 13 mm (fig. 1d).
2) Tipo per semi piccoli - diametro del tubo esterno 11 mm,
larghezza della finestra 7 mm (fig. 1e).
----> Vedere figura a Pag. 10 del S.O <----
d) Sonda tipo Nobbe - tubo singolo lungo approssimativamente 500 mm
compresa la impugnatura di 100 mm e una punta di 60 mm. Appena sopra
la punta essa presenta un'apertura ovale lunga 60 mm. Il diametro del
tubo deve essere di 14 mm per i semi grossi e di 10 mm per i semi
piccoli.
1.2.4. Metodi di campionamento
a) Sacchi aperti: si usa la sonda lunga introducendola, in
posizione chiusa, diagonalmente fino a toccare il fondo. Quindi viene
aperta, agitata leggermente per facilitare l'ingresso del seme,
richiusa ed estratta.
La sonda va poi vuotata su una superficie pulita e piana in modo da
poter osservare l'uniformita' del seme fra i singoli compartimenti.
b) Sacchi chiusi: si usa la sonda corta sez. 1.2.3. c) o la sonda
Nobbe sez. 1.2.3. d).
Queste si introducono nel sacco in direzione ascendente con un
angolo di circa 30 con l'orizzontale. La prima va introdotta in
posizione chiusa; poi si apre, si lascia entrare il seme, si richiude
e si estrae dal sacco.
La sonda Nobbe introduce con l'apertura ovale rivolta verso il
basso, si gira di circa 180 riportando il foro verso l'alto e si
ritira lentamente in modo da conseguire un prelevamento uniforme per
tutta la sezione esplorata.
L'introduzione della sonda nei sacchi prescelti deve aver luogo
alternativamente in alto, in mezzo e in basso.
c) Piccole confezioni chiuse (di carta, di plastica, metalliche,
ecc.)
Ove possibile si procede al campionamento durante le operazioni di
confezionamento del seme (sez. 1.2.4. e).
Diversamente si apre un numero sufficiente di contenitori, previo
loro raggruppamento in unita' di campionamento (sez. 1.2.2. b). Il
seme residuo dei contenitori campionati puo' essere reintegrato nel
lotto.
d) Semente alla rinfusa (mucchio, cassoni, ecc.)
Il seme prima del prelevamento va sistemato spianandolo fino a
ridurlo ad uno strato di spessore uniforme non superiore a 2 m ed a
base pressoche' rettangolare. Il prelevamento deve essere effettuato
in non meno di 5 punti diversi, dei quali uno al centro e i rimanenti
4 lungo le diagonali a 2/3 di distanza dal centro (fig. 2) o ad ogni
2 m di distanza se le diagonali superano i 6 m di lunghezza (fig. 3).
e) Semente in flusso
I prelievi devono essere eseguiti con un recipiente di sezione tale
da comprendere quella del flusso, interponendolo a questo. La
periodicita' del prelevamento e il quantitativo di ogni prelievo
saranno regolati in maniera da ottenere almeno 50 g di seme per ogni
100 Kg fluiti.
f) Sementi poco scorrevoli
Per le sementi per le quali non e' possibile l'uso della sonda
perche' poco scorrevoli, il prelievo dei campioni si fa con strumenti
diversi dalle sonde. In questi casi i contenitori prescelti devono
essere vuotati per consentire il prelievo del campione elementare
procedendo come alla sezione 1.2.4. d).
Il campionamento puo' essere fatto anche durante il confezionamento
del seme (sez. 1.2.4. e).
g) Qualunque metodo si usi, i campioni elementari devono essere fra
loro confrontati per giudicare l'uniformita' del lotto. In caso di
manifesta disformita' si opera come indicato alla sezione 1.1.1.
----> Vedere figura a Pag. 12 del S.O. <----
1.3. FORMAZIONE DEL CAMPIONE GLOBALE E MEDIO FINALE DI PRELEVAMENTO
1.3.1. Campione globale
Per formare il campione globale si riuniscono, rimescolandoli
accuratamente, tutti i campioni elementari.
1.3.2. Campione medio finale di prelevamento
Si ottiene disponendo il campione globale in uno strato di spessore
uniforme su una superficie piana e pulita. Poi si prelevano
quantitativi uguali di seme da non meno di 5 punti diversi dello
strato, fino ad ottenere la quantita' di seme prescritta per il
campione medio finale di prelevamento (1.3.3.).
A tale scopo si impiega uno strumento che renda possibile il
prelievo dell'intero spessore dello strato di semente nei punti
prescelti.
Nel caso si debbano formare piu' campioni medi finali si opera
altrettante volte nel modo descritto previo rimescolamento, ogni
volta, del campione globale residuo.
Per la determinazione dell'umidita' del seme il campione medio
viene formato per primo e immediatamente dopo la formazione del
campione globale; esso deve essere subito chiuso in contenitori a
tenuta stagna, mentre i campioni per le altre determinazioni devono
essere posti in contenitori permeabili all'aria.
1.3.3. Peso minimo del campione medio finale di prelevamento
a) I campioni destinati alle diverse analisi, esclusa quella
dell'umidita', devono avere un peso non inferiore a quello indicato
nella colonna 4 delle tabelle di cui all'allegato I, salvo i casi in
cui particolari norme regolamentari indichino pesi differenti.
b) Per sementi molto costose (linee parentali, ibridi F1, ecc.) o
per lotti di seme di peso inferiore o uguale a 0,1% del peso massimo
indicato nella colonna 3 delle tabelle di cui all'allegato 1, i
campioni devono avere un peso tale da contenere almeno 2500 semi ma
comunque non superiore a quello indicato nella colonna 4 delle
tabelle sopracitate, sempre che non si debba procedere alla
determinazione del numero di semi estranei.
c) I campioni destinati alla determinazione dell'umidita', devono
essere di peso non inferiore a:
100 g per le specie che devono essere macinate
50 g per tutte le altre specie.
d) I campioni di miscugli dovranno avere un peso non inferiore a
quello indicato nella colonna 4 delle tabelle di cui all'allegato I
per la specie componente miscuglio avente semi di maggior peso
unitario.
e) Nel caso in cui il campione prelevato sia di peso inferiore a
quello minimo prescritto alla lettera a), per documentata carenza o
costo elevato del seme, puo' essere effettuata ugualmente l'analisi
purche' sia indicato sul certificato il peso del campione.
1.4. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISI
I campioni di analisi devono presentare le stesse caratteristiche
del campione medio finale di prelevamento cui si riferiscono e devono
essere di peso non inferiore a quello indicato per ciascuna analisi.
1.4.1. Metodi di preparazione
Per ogni analisi che deve essere effettuata in doppio, il campione
di analisi deve essere costituito da due sottocampioni che devono
essere prelevati indipendentemente l'uno dall'altro. Dopo il prelievo
del primo sottocampione, il restante seme deve essere rimescolato
prima di prelevare il secondo. Allo scopo deve essere usato uno dei
seguenti metodi:
a) preparazione meccanica - si usano i seguenti apparecchi:
Divisore conico (Tipo Boerner) - E' costituito da una tramoggia e
da 19 canali, disposti circolarmente, che indirizzano il seme
alternativamente ad uno dei due recipienti sottostanti, ottenendo
cosi' due sottocampioni necessari per l'analisi. Esso e'
particolarmente indicato per i semi scorrevoli.
Divisore orizzontale (Tipo Soil divider) - E' basato sullo stesso
principio del divisore conico, ma i canali sono disposti su uno
stesso piano orizzontale. E' particolarmente indicato per i semi poco
scorrevoli (graminacee, ecc.) e per le sementi ricoperte.
Il campione medio finale di prelevamento versato nella tramoggia,
scorre lungo i canali dividendosi a meta'. Una delle due meta' viene
poi ulteriormente suddivisa e cosi' di seguito fino a raggiungere un
peso non inferiore alla meta' di quello prescritto. Il rimanente seme
viene rimesso tutto nella tramoggia e si ripete l'operazione per
ottenere il secondo sottocampione.
b) Preparazione a mano - Dopo un preliminare mescolamento del
campione medio finale di prelevamento, si versa il seme su un vassoio
con un movimento oscillatorio e alternativamente in una direzione ed
in quella alla prima perpendicolare, fino a coprire uniformemente la
superficie del vassoio facendo attenzione di non scuotere il vassoio
stesso. Con l'ausilio di una spatola o di un cucchiaio si prelevano
poi piccole quantita' di seme da non meno di 5 punti diversi del
vassoio, e, per ogni punto, da tutto lo spessore dello strato, fino a
raggiungere un peso non inferiore alla meta' di quello prescritto. Il
rimanente seme viene nuovamente mescolato e versato sul vassoio come
in precedenza per la preparazione del secondo sottocampione.
1.5. CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI IN LABORATORIO
Quando si devono conservare campioni di seme occorre porli in
ambienti climatizzati a temperatura e umidita' relativa dell'aria
sufficientemente basse, comunque non superiori a 15C ed al 50% di
U.R.
2 - VERIFICA E DETERMINAZIONE DELLA SPECIE
La verifica e la determinazione della specie vengono effettuate in
base alle caratteristiche del seme e, ove idonee, della plantula. Se
tale verifica, in laboratorio, risulta difficile o incerta occorre,
in ogni caso, determinare il genere. La determinazione della specie,
qualora richiesta, puo' essere completata anche con prove colturali.
Nel certificato di analisi deve esse indicato il nome botanico del
genere e della specie e il nome volgare quando sia conosciuto. Nel
caso in cui l'indicazione della specie risulti impossibile o incerta,
si deve indicare solo il nome botanico del genere. Nel caso di specie
difficili da distinguere si procede come indicato nella sez. 3.4.
3 - ANALISI DELLA PUREZZA
3.1. SCOPO
L'analisi della purezza ha lo scopo di determinare le quantita' di
seme puro, di semi estranei e di materie inerti che costituiscono il
campione, per dedurre la composizione del lotto dal quale il campione
proviene.
3.2. PESO MINIMO DEL CAMPIONE DI ANALISI
a) Per le specie elencate nelle tabelle dell'allegato I, il peso
del campione di analisi non deve essere inferiore a quello indicato
nella colonna 5 di dette tabelle.
b) Per le specie non elencate in dette tabelle, esso deve
corrispondere a quello delle specie aventi semi di peso unitario
simile, salvo i casi con particolari norme regolamentari.
c) Per i miscugli si seguiranno le norme seguenti:
I - Qualora una specie o un gruppo di specie con seme di pari peso
unitario siano dichiarate o valutate orientativamente come
costituenti oltre il 50% del miscuglio, il peso del campione di
analisi deve corrispondere a quello indicato nella colonna 5 delle
tabelle dell'allegato I per quella specie o per quel gruppo di spe-
cie.
II - Qualora ciascuna specie o ciascun gruppo di specie con seme di
pari peso unitario siano dichiarati inferiori od orientativamente
presenti nel miscuglio in quantita' inferiori al 50%, il peso del
campione di analisi deve corrispondere alla media dei pesi indicati
nella colonna 5 delle tabelle dell'allegato I per ciascuna specie
componente il miscuglio (1).
d) I due sottocampioni di analisi (sez. 1.4.1.) devono essere di
peso non inferiore alla meta' di quello prescritto nella colonna 5
delle tabelle dell'allegato I e devono essere pesati in grammi con un
numero di cifre decimali come indicato nel prospetto seguente:
Peso del campione di Numero di cifre decimali
analisi in grammi da considerare
Inferiore a......... 1 4
Da 1 a.............. 9,999 3
Da 10 a............. 99,99 2
Da 100 a............ 999,9 1
Uguale o superiore a 1.000 0
3.3. DEFINIZIONI
Il campione di analisi va composto nelle seguenti frazioni:
a) seme puro;
b) semi estranei;
c) materie inerti.
(1) Per esempio: (I valori utilizzati sono puramente
indicativi ai fini di un calcolo semplificato).
1. Specie componenti il miscuglio (1)
2. Percentuali dichiarate o valutate (2)
3. Percentuali arrotondate delle specie o gruppi di specie di peso
diverso (3)
4. Pesi (g) desunti dalla colonna 5 delle tabelle dell'allegato I (4
5. Col. (3) x (4)
1. Agrostis gigantea
2. 5,80
3. 6
4. 0,5
5. 3
1. Festuca rubra
2. 15,35
3. 40
4. 1,0
5. 40
1. Trifolium repens
2. 24,48
3.
4.
5.
1. Lolium multiflorum
2. 18,76
3. 40
4. 2,5
5. 100
1. Medicago sativa
2. 21,37
3.
4.
5.
1. Trifolium incarnatum
2. 11,54
3. 12
4. 5,0
5. 60
1.
2.
3. 98
4.
5. 203
Media ponderata = 203 = 2,07
98
Peso minimo del campione d'analisi del miscuglio = grammi 2
3.3.1. Seme puro
Il seme puro comprende i semi della o delle specie indicate sulla
confezione e/o sulla etichetta o trovate come predominanti nel
campione senza distinzione fra le varieta' botaniche e le cultivar
della o delle specie in esame.
Esso e' costituito:
a) semi intatti, anche se immaturi, raggrinziti, ammalati o
germinati, purche' possano essere chiaramente identificati come
appartenenti alla specie, a meno che non siano trasformati in
sclerozi, ricettacoli fungini o galle di nematodi;
b) pezzi di seme, di acheni, di mericarpi, di cariossidi di
dimensioni superiori alla meta' delle loro dimensioni originarie;
c) semi danneggiati da insetti, purche' la porzione rimasta sia
giudicata dall'analista superiore alla meta' delle dimensioni
originarie del seme. Non e' necessario comunque rigirare ogni singolo
seme per rilevare la presenza o l'assenza di buchi o di altre zone
danneggiate anche nella parte sottostante del seme;
d) acheni o frutti similari, schizocarpi o mericarpi con o senza
perianzio, senza badare se contengono o meno un vero seme, a meno che
ne sia, a prima vista, chiaramente evidente l'assenza; nel caso essi
vanno inclusi fra le materie inerti. Queste strutture seminali devono
essere esaminate soltanto superficialmente, senza far uso di
pressioni, ingrandimenti, diafanoscopi ed altri speciali attrezzi;
e) glomeruli di BETA, (eccetto le cultivar monogermi genetiche) e
pezzi di glomeruli con o senza un vero seme, che sono trattenuti su
un setaccio rettangolare di 200 x 300 mm, con fori rettangolari di
1,5 x 20 mm, dopo setacciatura di un minuto;
f) spighette uniflore di LOLIUM, FESTUCA, AGROPYRON REPENS con
cariosside lunga almeno 1/3 della lunghezza della palea misurata alla
base della rachilla negli altri generi e specie invece le spighette
uniflore con cariosside di qualsiasi dimensione;
g) fiori sterili attaccati a fiori fertili nei seguenti generi:
ARRHENATHERUM, AVENA, DACTYLIS, FESTUCA, HOLCUS, POA e SORGHUM non
devono essere staccati; si considera il tutto come seme puro. Tale
procedura si applica anche ai fiori sterili attaccati del genere
Lolium quando non superano l'apice del fiore fertile esclusa la
resta;
h) cariossidi nude;
i) per POA PRATENSIS e DACTYLIS GLOMERATA, qualora sia previsto il
metodo con corrente d'aria uniforme, vedere sez. 3.6.;
l) semi alati di piante forestali allorche' l'ala o porzione di
essa faccia parte integrante del seme o sia difficilmente staccabile
(ad esempio rispettivamente, ACER, ALNUS, BETULA, CHAMAECYPARIS,
CUPRESSUS, FRAXINUS, ABIES, LIBOCEDRUS, PSEUDOTSUGA, varie specie di
PINUS);
m) unita' seminali multiple. Nei seguenti generi, DACTYLIS e
FESTUCA, le unita' seminali multiple possono essere pesate e
riportate sul certificato quando la loro presenza e' superiore
all'1%.
Sono definite unita' seminali multiple le seguenti strutture (fig.
4):
- un solo fiore fertile con un fiore fertile o sterile attaccato
che si estende anche oltre l'apice del fiore fertile escludendo la
resta (8-12);
- un solo fiore fertile con piu' di un fiore fertile o sterile
attaccato di qualsiasi lunghezza (5-7);
- un fiore fertile con attaccato alla base un fiore sterile di
qualsiasi lunghezza (13).
----> Vedere figura a Pag. 18 del S.O. <----
I fiori con attaccati fiori singoli fertili o sterili che non si
estendono oltre l'apice del fiore fertile, escludendo la resta sono
considerati unita' seminali singole (1-2-3-4). I fiori fertili o
sterili attaccati non vanno rimossi (da I.S.T.A. Rules 1985).
3.3.2. Semi estranei
In questa categoria si comprendono tutti i semi e le strutture
seminali di tutte le specie diverse da quella o da quelle in esame
costituenti il seme puro. Riguardo la loro classificazione nel gruppo
degli altri semi o delle materie inerti si applicano gli stessi
criteri usati per i semi puri (sez. 3.3.1.), fatta eccezione per il
caso della CUSCUTA spp. (sez. 3.3.3.i).
3.3.3. Materie inerti
A - Semi e strutture seminali:
a) Pezzi di semi, acheni, mericarpi e cariossidi rotte o
danneggiate di dimensioni uguali o inferiori alla meta' delle loro
dimensioni originali;
b) i semi di LEGUMINOSAE, CRUCIFERAE e CONIFERAE completamente
privi di tegumento;
c) semi danneggiati da insetti purche' sia evidente, a prima vista,
che la porzione mancante supera la meta' delle dimensioni originarie
del seme (sez. 3.3.1.c);
d) strutture definite nella sezione 3.3.1. d, nelle quali sia
evidente l'assenza di un vero seme;
e) glomeruli di BETA (eccetto le cultivar monogermi genetiche) e
pezzi di glomeruli che passano attraverso fori rettangolari di 1,5 x
20 mm, di un setaccio rettangolare di 200 x 300 mm dopo setacciatura
di un minuto;
f) spighette uniflore di LOLIUM, FESTUCA, AGROPYRON REPENS con
cariosside lunga meno di un terzo della lunghezza della palea;
g) glume vuote, lemme, palee, fiori sterili staccati da quelli
fertili, spighette con cariossidi di dimensioni inferiori a 1/3 della
lunghezza della palea (sez. 3.3.1.f);
h) per POA PRATENSIS e DACTYLIS GLOMERATA, per le quali e'
prescritto il metodo della corrente d'aria uniforme, vedere sezione
3.6;
i) semi di CUSCUTA, spp. che siano fragili o di colore grigio
cenere fino a bianco crema;
l) ali ed altre espansioni seminali rotte e staccate;
m) ali o porzioni d'ala attaccate che non facciano parte integrante
di semi forestali e che siano facilmente staccabili (2).
B - Altri materiali:
terra, foglie, steli, paglie, squame, pezzi di corteccia, boccioli
fiorali, galle di nematodi, corpi fungini e ogni altro materiale che
non sia seme.
(2) Le ali devono essere rimosse completamente in CEDRUS,
PICEA, TSUGA e PINUS e parzialmente, salvo cioe' quella
parte che avvolge il seme ed e' di difficile distacco, in
ABIES, LARIX, LIBOCEDRUS, PSEUDOTSUGA e alcuni PINUS.
3.4. SPECIE DIFFICILI DA DISTINGUERE
Quando e' possibile o difficile distinguere i semi di due o piu'
specie, si puo' procedere come segue:
A - Si classificano come seme puro tutti i semi appartenenti al
genere (ad es. i semi di LOLIUM sia mutici che aristati) indicando
sul certificato di analisi solo il nome del genere (LOLIUM spp.).
B - Dal seme puro classificato come al punto A, vengono presi a
caso, almeno 400 semi sui quali si esegue una piu' accurata
separazione ai fini dell'individuazione della specie. Si calcolano
poi le proporzioni in peso delle frazioni separate rapportandole in-
fine al peso complessivo del campione di analisi secondo la formula
seguente:
m3 x m1
S = x 100
m2 x m
dove: S = percentuale in peso di una specie o frazione separata
m = peso di tutto il campione di analisi
m1 = peso del seme puro
m2 = peso dei 400 semi utilizzati per la separazione definitiva
m3 = peso della specie o frazione separata da m2
Se e' adottato questo procedimento il risultato va riportato nel
certificato di analisi sotto la voce: "altre determinazioni ed
osservazioni" indicando anche il numero di semi esaminati.
3.5. ESECUZIONE DELL'ANALISI
L'analisi della purezza si esegue su ciascuno dei due sottocampioni
di analisi (sez. 3.2. d).
L'esecuzione dell'analisi consiste nella suddivisione del campione
nelle parti indicate nella sezione 3.3. Nella separazione delle di-
verse parti non si deve manipolare o rivoltare ciascuno elemento,
salvo i casi in cui si devono staccare le parti considerate materie
inerti (sez. 3.3.3.). E' consentito l'uso di dispositivi come la luce
riflessa e setacci per separare i fiori sterili di graminacee e i
frammenti di semi risultanti da rotture e da danni di insetti o di
malattie. E' pure ammesso l'uso dei soffiatori per separare i
costituenti leggeri, come paglie, fiori vuoti di graminacee, ecc.,
dai semi piu' pesanti.
3.6. METODO DELLA CORRENTE D'ARIA UNIFORME
Questo metodo e' previsto per POA PRATENSIS e per DACTYLIS
GLOMERATA. A tale scopo si usa un "soffiatore" per semi che deve
fornire una corrente d'aria uniforme e graduabile per le singole spe-
cie, suscettibile di standardizzazione e in grado di trattenere tutte
le particelle separate.
L'apparecchio deve essere calibrato prima di ogni operazione per
mezzo di un campione di ciascuna specie standardizzato dall'I.S.T.A.
(International Seed Testing Association). Il peso del campione di
analisi e' di 1 g per Poa pratensis e di 3 g per DACTYLIS GLOMERATA.
3.6.1. Procedimento
Sistemato il soffiatore al punto di calibratura ottenuto con il
campione standard, si sottopone il campione d'analisi alla corrente
d'aria per 3 minuti frazionandolo cosi' in due parti. Su ciascuna di
queste si fa poi la valutazione dei costituenti come segue:
A - Parte pesante: sono considerati:
a) seme puro:
spighette singole complete;
tutti i fiori intatti multipli di POA PRATENSIS e le unita'
seminali multiple di DACTYLIS GLOMERATA (3.3.1. m);
spighette con corpi fungini, come sclerozi interamente rinchiusi
fra lemma e palea;
spighette e cariossidi danneggiate da insetti o ammalate;
spighette e cariossidi rotte di dimensioni superiori alla meta'
delle dimensioni originarie;
b) materie inerti:
spighette con sclerozi che escono dall'apice;
spighette e cariossidi rotte di dimensioni uguali o inferiori alla
meta' delle dimensioni originarie;
c) gli altri semi (compresi altre specie di POA), frammenti
vegetali, granelli di sabbia ecc., devono essere classificati secondo
le sezioni 3.3.2. e 3.3.3. B.
B - Parte leggera:
tutte le spighette e le cariossidi di POA PRATENSIS, DACTYLIS
GLOMERATA e altro materiale devono essere considerate come materia
inerte;
altri semi (comprese altre POA spp. in P. PRATENSIS), frammenti
vegetali, sabbia, ecc. devono essere classificati secondo le sezioni
3.3.2. e 3.3.3. B. Quando spighette fertili di alcune POA spp. (ex.
POA TRIVALIS e P. COMPRESSA) sono presenti in un campione di POA
PRATENSIS e' necessario esaminare l'intera frazione leggera sotto
ingrandimento. Se i semi di queste specie sono presenti in misura
limitata (1-3%) e' facile separarli sia dalla parte leggera sia da
quella pesante e calcolare la percentuale di altri semi sulla base
del peso totale. Se essi sono invece presenti in maggior misura
(3-5%) si puo' usare il seguente metodo alternativo: spighette
fertili di altre POA spp. possono essere tolte dalla porzione
pesante. Si prendono quindi a caso 400 spighette (ma preferibilmente
800 o 1000) e con l'ausilio di lenti di ingrandimento si separano le
diverse specie di POA e quindi si determina la percentuale in peso di
ciascuna.
3.7. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEL RISULTATO
3.7.1. Calcolo
Dopo la separazione si pesano le singole parti con il numero di
cifre decimali indicato nella sezione 3.2.d.
La percentuale deve essere calcolata sulla somma dei pesi dei
singoli componenti dopo la separazione e non sul peso iniziale del
campione di analisi; ma tale somma deve essere confrontata con il
peso originario per controllare un'eventuale perdita di materiale o
altri errori.
Il risultato finale e' rappresentato, per ogni componente, dalla
media dei valori delle due ripetizioni.
Per valutare l'esattezza della prova si deve verificare se la
differenza tra i risultati delle analisi dei due sottocampioni eccede
o meno la tolleranza ammessa. La verifica deve riguardare tutte e
tre le parti componenti.Allo scopo si utilizza la tabella 1.
Se la differenza rientra nei limiti di tolleranza (3), per tutte le
frazioni, la prova e' da ritenersi valida, diversamente occorre
ripetere l'analisi finche' le differenze non rientrino nei limiti.
3.7.2. Espressione del risultato
Nel certificato di analisi il risultato della determinazione della
purezza deve essere indicato, per ciascuna delle parti (seme puro,
semi estranei e materie inerti) in percentuale del peso totale di
esse. Tali percentuali si calcolano alla seconda cifra decimale e si
indicano soltanto con la prima arrotondata; i cinque centesimi si
arrotondano per eccesso. I valori inferiori a 0,05 si esprimono come
"Tracce" (Tr.). Se il risultato di un componente e' zero, esso si
dovra' indicare, nell'apposito spazio, come segue: "-0,0-". Nel caso
di miscugli, il risultato dell'analisi di purezza si riferisce al
miscuglio nel suo complesso. Inoltre, per tutte le specie, che sono
state dichiarate componenti di miscuglio, si deve indicare il nome
botanico e volgare, e per ciascuna di esse, la percentuale di seme
puro riferita al totale dei pesi di tutte le parti dell'analisi della
purezza del miscuglio.
Nel certificato di analisi, per quanto e' possibile, si devono
indicare i nomi botanici delle specie di semi estranei rinvenuti.
Inoltre, se tra questi vi e' una specie presente in misura pari o
superiore all'1%, tale percentuale deve essere indicata a fianco del
nome botanico. Quando, fra le materie inerti, si riscontrino
organismi nocivi (sclerozi, larve, ecc.), se ne dovra' fare menzione
nel certificato d'analisi.
Quando viene trovato nell'analisi un tipo particolare di materia
inerte o specie di altri semi, o quando il contenuto in unita'
seminali multiple nei generi DACTYLIS, FESTUCA, e' superiore all'1% o
quando a richiesta di chi invia il campione di analisi venga
rinvenuta una specie per piu' dello 0,1%, la percentuale di tali
materiali puo' essere indicata sul certificato di analisi.
(3) Per esempio, i risultati dell'analisi in doppio di un seme di
Trifoglio incarnato siano i seguenti:
1 campione 2 campione Risultato finale
g % g % % media
Seme puro . . . . . 4,941 98,62 5,342 97,10 97,9
Semi estranei . . . 0,042 0,84 0,110 2,00 1,4
Materie inerti. . . 0,027 0,54 0,050 0,90 0,7
5,010 5,502
Per verificare l'attendibilita' dei due dati relativi al seme puro,
ottenuti dalla analisi, si fa riferimento alla colonna A della
tabella 1 in corrispondenza dei valori 97, 75-97, 99 fra i quali e'
compresa la percentuale 97,9 risultato finale dell'analisi stessa.
La differenza massima che si legge nella colonna B della stessa
tabella e' di 1,54 ed e' maggiore della differenza (98,62 - 97,10 =
1,52) esistente fra le due percentuali di seme puro. Tale verifica si
ripete per i semi estranei e per le materie inerti, accertando
l'attendibilita' dei risultati ottenuti. Infatti le differenze
massime ammesse nella colonna B della stessa tabella sono
rispettivamente 1,26 per i semi estranei (maggiore di 2,00 - 0,84 =
1,16) e di 0,95 per le materie inerti (maggiore di 0,90 - 0,54 =
0,36). Pertanto i dati forniti dall'analisi in doppio sono
attendibili e il risultato finale e' il seguente: Seme puro 97,9%;
semi estranei 1,4%; materie inerti 0,7%.
TABELLA 1
DIFFERENZE MASSIME AMMESSE FRA I RISULTATI DELLE DUE PROVE PARALLELE
DI ANALISI VALEVOLI PER QUALSIASI DATO DELL'ANALISI DELLA PUREZZA
(p = 0,05) da I.S.T.A. Rules, 1985
a. Classi di percentuali medie (A)
b. Differenze massime ammesse fra le percentuali relative alle d
prove (B)
a. 99,95-100,0 oppure 0,00- 0,04
b. 0,23
a. 99,90-99,94 " 0,05- 0,09
b. 0,34
a. 99,85-99,89 " 0,10- 0,14
b. 0,42
a. 99,80-99,84 " 0,15- 0,19
b. 0,49
a. 99,75-99,79 " 0,20- 0,24
b. 0,55
a. 99,70-99,74 " 0,25- 0,29
b. 0,59
a. 99,60-99,64 " 0,35- 0,39
b. 0,69
a. 99,55-99,59 " 0,40- 0,44
b. 0,74
a. 99,50-99,54 " 0,45- 0,49
b. 0,76
a. 99,40-99,49 " 0,50- 0,59
b. 0,82
a. 99,30-99,39 " 0,66- 0,69
b. 0,89
a. 99,20-99,29 " 0,70- 0,79
b. 0,95
a. 99,10-99,19 " 0,80- 0,89
b. 1,00
a. 99,00-99,09 " 0,90- 0,99
b. 1,06
a. 98,75-99,99 " 1,00- 1,24
b. 1,15
a. 98,50-98,74 " 1,25- 1,49
b. 1,26
a. 98,25-98,49 " 1,50- 1,74
b. 1,37
a. 98,00-98,24 " 1,75- 1,99
b. 1,47
a. 97,75-97,99 " 2,00- 2,24
b. 1,54
a. 97,50-97,74 " 2,25- 2,49
b. 1,63
a. 97,25-97,49 " 2,50- 2,74
b. 1,70
a. 97,00-97,24 " 2,75- 2,99
b. 1,78
a. 96,50-96,99 " 3,00- 3,49
b. 1,88
a. 96,00-96,49 " 3,50- 3,99
b. 1,99
a. 95,50-95,99 " 4,00- 4,49
b. 2,12
a. 95,00-95,49 " 4,50- 4,99
b. 2,22
a. 94,00-94,99 " 5,00- 5,99
b. 2,38
a. 93,00-93,99 " 6,00- 6,99
b. 2,56
a. 92,00-92,99 " 7,00- 7,99
b. 2,73
a. 91,00-91,99 " 8,00- 8,99
b. 2,90
a. 90,00-90,99 " 9,00- 9,99
b. 3,04
a. 88,00-89,99 " 10,00-11,99
b. 3,25
a. 86,00-97,99 " 12,00-13,99
b. 3,49
a. 84,00-85,99 " 14,00-15,99
b. 3,70
a. 82,00-83,99 " 16,00-17,99
b. 3,90
a. 80,00-81,99 " 18,00-19,99
b. 4,07
a. 78,00-79,99 " 20,00-21,99
b. 4,23
a. 76,00-77,99 " 22,00-23,99
b. 4,37
a. 74,00-75,99 " 24,00-25,99
b. 4,50
a. 72,00-73,99 " 26,00-27,99
b. 4,61
a. 70,00-71,99 " 28,00-29,99
b. 4,71
a. 65,00-69,99 " 30,00-34,99
b. 4,86
a. 60,00-64,99 " 35,00-39,99
b. 5,02
a. 50,00-59,99 " 40,00-49,99
b. 5,16
4 - DETERMINAZIONE DEL NUMERO DI SEMI ESTRANEI
4.1. Scopo
Scopo dell'analisi e' di determinare il numero di semi estranei
(sez. 3.3.2.). Tale determinazione puo' riferirsi ad una sola specie,
a piu' specie, o a tutte le specie presenti, e cio' in relazione a
prescrizioni legislative o ad esigenze commerciali.
4.2. Peso minimo del campione di analisi
Il peso minimo del campione di analisi e' quello indicato nella
colonna 6 delle tabelle dell'allegato I. Nel caso di miscugli, per la
formazione del campione di analisi valgono le stesse norme indicate
per l'analisi della purezza (sez. 3.2.c). Nel caso tuttavia in cui le
norme legislative e regolamentari prescrivano l'assenza o la
limitazione di determinate specie infestanti riferita ad un
determinato peso, il peso del campione di analisi non dovra' essere
inferiore a quello indicato dalle norme stesse.
4.3. Procedura
L'analisi si effettua a mano, separando dal campione tutti i semi
della specie o delle specie per le quali e' richiesta la
determinazione. E' concesso l'uso di setacci ed altre attrezzature
ausiliarie di laboratorio.
4.4. Calcolo ed espressione del risultato
Di ciascuna specie ricercata si effettua il conteggio dei semi
rinvenuti nel campione. Qualora si renda necessario ripetere
l'analisi occorre verificarne la validita' con il calcolo della
tolleranza prevista dalla tab. 2. Se la differenza riscontrata fra le
due stime supera quella indicata nella colonna B della tabella, si
deve ripetere l'analisi.
Il risultato finale dell'analisi e' dato dal numero di semi di
ciascuna specie trovato nel campione di analisi.
Nel caso di due prove riconosciute valide, il risultato finale e'
dato dalla media dei valori ottenuti.
Il risultato viene espresso sul certificato indicando:
a) il peso del campione analizzato;
b) il nome botanico del genere e, ove possibile, della specie
ricercata e trovata e il corrispondente numero di semi.
Se la ricerca di qualche specie, espressamente richiesta, ha dato
esito negativo, si deve ugualmente indicare sul certificato il
risultato riportando accanto al nome della specie: "-0- semi".
Tabella 2
DIFFERENZE MASSIME AMMESSE TRA LE DUE PROVE DELLA DETERMINAZIONE
DEL NUMERO DI SEMI ESTRANEI PER CAMPIONI DI ANALISI DEL MEDESIMO
PESO (p = 0,05) da ISTA Rules, 1985
1) Media di 2 determinazioni (A)
2) Differenza massima ammessa (B)
3) Media di 2 determinazioni (A)
4) Differenza massima ammessa (B)
5) Media di 2 determinazioni (A)
6) Differenza massima ammessa (B)
1) 3
2) 5
3) 76-81
4) 25
5) 253-264
6) 45
1) 4
2) 6
3) 82-88
4) 26
5) 265-276
6) 46
1) 5-6
2) 7
3) 89-95
4) 27
5) 277-288
6) 47
1) 7-8
2) 8
3) 96-102
4) 28
5) 289-300
6) 48
1) 9-10
2) 9
3) 103-110
4) 29
5) 301-313
6) 49
1) 11-13
2) 10
3) 111-117
4) 30
5) 314-326
6) 50
1) 14-15
2) 11
3) 118-125
4) 31
5) 327-339
6) 51
1) 16-18
2) 12
3) 126-133
4) 32
5) 340-353
6) 52
1) 19-22
2) 13
3) 134-142
4) 33
5) 354-366
6) 53
1) 23-25
2) 14
3) 143-151
4) 34
5) 367-380
6) 54
1) 26-29
2) 15
3) 152-160
4) 35
5) 381-394
6) 55
1) 30-33
2) 16
3) 161-169
4) 36
5) 395-409
6) 56
1) 34-37
2) 17
3) 170-178
4) 37
5) 410-424
6) 57
1) 38-42
2) 18
3) 179-188
4) 38
5) 425-439
6) 58
1) 43-47
2) 19
3) 189-198
4) 39
5) 440-454
6) 59
1) 48-52
2) 20
3) 199-209
4) 40
5) 455-469
6) 60
1) 53-57
2) 21
3) 210-219
4) 41
5) 470-485
6) 61
1) 58-63
2) 22
3) 220-230
4) 42
5) 485-501
6) 62
1) 64-69
2) 23
3) 231-241
4) 43
5) 502-518
6) 63
1) 70-75
2) 24
3) 242-252
4) 44
5) 519-534
6) 64
5 ANALISI DI GERMINABILITA'
5.1. Scopo
Scopo della prova di germinazione in laboratorio e' di determinare
la percentuale in numero di semi puri capaci di produrre germinelli
normali potenzialmente in grado di svilupparsi in piante normali in
condizioni favorevoli di coltura.
Le condizioni di germinazione descritte nel presente capitolo sono
standardizzate in modo che i risultati di analisi, per uno stesso
campione, possano essere riproducibili e fra loro comparabili.
5.2. Categorie di semi e loro definizioni
Le categorie dei semi, in base alla prova di germinazione, si
distinguono in:
1) semi germinati con germinelli normali;
2) semi duri;
3) semi freschi non germinati;
4) semi con germinelli anormali;
5) semi morti o vani.
5.2.1. Semi germinati con germinelli normali.
Sono considerati germinelli normali quelli provvisti di organi
essenziali alla vita della futura pianta. Essi si distinguono in tre
categorie:
A. Germinelli intatti
A seconda della specie in esame, i germinelli intatti debbono
possedere le seguenti strutture armoniosamente sviluppate:
a) SISTEMA RADICALE ben sviluppato e costituito da:
- RADICE PRIMARIA lunga e ben formata, generalmente coperta da
numerosi peli radicali e finemente appuntita;
- RADICI SECONDARIE prodotte entro il periodo di prova prescritto;
- diverse RADICI SEMINALI invece di una radice primaria in certi
generi comprendenti AVENA, HORDEUM, SECALE, TRITICUM, TRITICOSECALE,
CYCLAMEN;
b) ASSE VEGETATIVO ben sviluppato e costituito da:
- IPOCOTILE diritto e generalmente ben formato e allungato,
(ingrossato alla base a formare il tubero in CYCLAMEN) nei germinelli
provenienti da germinazione ipogea;
- EPICOTILE ben sviluppato nei germinelli provenienti da
germinazione epigea;
- sia IPOCOTILE che EPICOTILE allungati in alcuni generi con
germinazione epigea (ad es. PHASEOLUS);
- MESOCOTILE allungato in certi generi di GRAMINACEAE (ad es. ZEA);
c) COTILEDONI in numero appropriato alla specie e cioe':
- UN COTILEDONE nelle monocotiledoni o eccezionalmente nelle
dicotiledoni (puo' essere verde e foglioso o modificato e totalmente
o parzialmente interno al seme). In certi generi (ad es. ALLIUM) esso
e' lungo e foglioso e deve formare una "ginocchiatura" ben definita;
- DUE COTILEDONI nelle dicotiledoni (nelle specie a germinazione
epigea sono verdi e simili a foglia, di forma e dimensione diversa a
seconda della specie. Nelle specie a germinazione ipogea sono
emisferici e carnosi e rimangono avvolti dal tegumento);
- COTILEDONI IN NUMERO VARIANTE (2-18) nelle conifere, generalmente
lunghi e sottili;
d) FOGLIE PRIMARIE, verdi e distese:
- UNA FOGLIA PRIMARIA, talvolta preceduta da alcune squame in
germinelli con foglie alterne;
- DUE FOGLIE PRIMARIE, in germinelli con foglie opposte;
e) GEMMA TERMINALE o apice vegetativo, di sviluppo diverso a
seconda della specie in esame;
f) COLEOPTILE diritto e ben sviluppato nelle GRAMINACEAE,
avvolgente una foglia verde che si estende fino all'apice o da esso
emergente.
B. Germinelli con lievi difetti
I seguenti difetti sono considerati lievi:
- RADICE PRIMARIA con danni limitati o crescita lievemente
ritardata;
- RADICE PRIMARIA (difettosa ma con RADICI SECONDARIE ben
sviluppate nelle LEGUMINOSAE (ad es. PHASEOLUS, PISUM, VICIA) e
GRAMINACEAE (ad es. ZEA) a seme grosso e in tutti i generi di
CUCURBITACEAE (ad es. CUCUMIS, CUCURBITA, CITRULLUS) e di MALVACEAE
(ad es. GOSSYPIUM);
- soltanto due RADICI SEMINALI in: AVENA, HORDEUM, SECALE,
TRITICUM, TRITICOSECALE e CYCLAMEN purche', in quest'ultimo,
l'ipocotile presenti un ingrossamento basale formante il tubero;
- IPOCOTILE, EPICOTILE o MESOCOTILE con danni limitati;
- COTILEDONI con danni limitati, cioe' interessanti una superficie
inferiore al 50% dell'area totale (= "regola del 50%") e purche'
l'apice vegetativo e i tessuti circostanti risultino intatti;
- un solo COTILEDONE normale nelle dicotiledoni, purche' l'apice
vegetativo e i tessuti circostanti risultino intatti;
- tre COTILEDONI invece di due (nel rispetto della "regola del
50%");
- FOGLIE PRIMARIE con danni limitati (nel rispetto della "regola
del 50%");
- una sola FOGLIA PRIMARIA normale ad es. in PHASEOLUS, purche' la
gemma apicale e i tessuti circostanti risultino intatti;
- tre FOGLIE PRIMARIE invece di due, ad es. in PHASEOLUS, (nel
rispetto della "regola del 50%");
- COLEOPTILE con danni limitati;
- COLEOPTILE con una fenditura che si estende dall'apice a non piu'
di un terzo della sua lunghezza;
- COLEOPTILE lievemente contorto o ad anello, perche' imprigionato
tra lemma e palea o sotto il pericarpo;
- COLEOPTILE con una FOGLIA VERDE interna non estesa fino all'apice
ma raggiungente almeno la meta' della sua lunghezza.
C. Germinelli con infezioni secondarie
I germinelli seriamente deteriorati da funghi o batteri vanno
classificati come normali se risulta evidente che la sorgente
dell'infezione non e' nel seme che li ha prodotti e se e' possibile
accertare che tutti gli organi essenziali erano presenti.
5.2.2. Semi duri.
Sono i semi che al termine della prova di germinazione, non sono
germinati ne' rigonfiati, per non aver assorbito acqua.
Semi di questo tipo sono frequenti nelle leguminose VICIA ed in
altre famiglie o generi come ad esempio GOSSYPIUM e HIBISCUS.
5.2.3. Semi freschi non germinati.
Sono i semi che, anche dopo i trattamenti per interrompere la
dormienza (sez. 5.5.2.), rimangono intatti ed apparentemente vitali
senza manifestare marcescenza o ammuffimento al termine della prova
di germinazione.
5.2.4. Semi con germinelli anormali (4).
Semi che, pur essendo germinati, non presentano germinelli tali da
poter essere considerati normali ai termini della sezione 5.2.1., e
cioe':
a) GERMINELLI DANNEGGIATI: germinelli con organi essenziali
mancanti o cosi' gravemente ed irreparabilmente danneggiati da
impedirne uno sviluppo equilibrato;
b) GERMINELLI DEFORMATI: germinelli con sviluppo debole,
fisiologicamente non equilibrato o con organi essenziali deformati o
sproporzionati;
c) GERMINELLI DETERIORATI: germinelli con organi essenziali cosi'
ammalati o deteriorati a causa di infezione "primaria" (proveniente
cioe' dal seme che li ha prodotti), da pregiudicare un normale
sviluppo.
In particolare uno o piu' dei seguenti difetti rende il germinello
anormale.
I. RADICE PRIMARIA: (1) tozza, (2) troncata, (3) ritardata, (4)
assente, (5) rotta, (6) divisa a partire dall'apice, (7) strozzata,
(8) aghiforme, (9) trattenuta dai tegumenti seminali, (10) con
geotropismo negativo, (11) acquosa o vitrea, (12) deteriorata a causa
di infezione primaria.
RADICI SECONDARIE: (13) una sola o assenti. Le radici secondarie o
quelle seminali aventi i difetti sopra indicati sono anormali e non
possono rimpiazzare una radice primaria anormale anche se presenti in
numero elevato (ad es. CUCUMIS) o di due (ad es. TRITICUM).
II. IPOCOTILE, EPICOTILE E MESOCOTILE: (1) corto e tozzo (eccetto
CYCLAMEN), (2) non formante un tubero in CYCLAMEN, (3) profondamente
fessurato o rotto, (4) profondamente diviso, (5) assente, (6)
strozzato, (7) strettamente contorto, (8) ricurvo, (9) formante un
anello o una spirale, (10) aghiforme, (11) acquoso o vitreo, (12)
deteriorato a causa di infezione primaria.
III. COTILEDONI (si applica la "regola del 50%"): (1) molli e
arrotolati, (2) deformati, (3) spezzati o comunque danneggiati, (4)
staccati o assenti, (5) alterati nel colore, (6) necrotici, (7)
acquosi o vitrei, (8) deteriorati a causa di infezione primaria.
Danni o deterioramenti al punto di attacco dei cotiledoni con
l'asse vegetativo o nelle adiacenze di esso, rendono il germinello
anormale indipendentemente dalla "regola del 50%").
Difetti particolari nel cotiledone di ALLIUM spp.: (9) corto e
tozzo, (10) strozzato, (11) ricurvo, (12) formante un anello o
spirale, (13) senza una "ginocchiatura" ben definita, (14) aghiforme.
IV. FOGLIE PRIMARIE (si applica la "regola del 50%": (1) deformate,
(2) danneggiate, (3) assenti, (4) alterate nel colore, (5)
necrotiche, (6) deteriorate a causa di infezione primaria, (7) di
forma normale ma di dimensioni inferiori ad 1/4 di quella normale.
V. GEMMA APICALE e tessuti circostanti: (1) deformata, (2)
danneggiata, (3) mancante, (4) deteriorata a causa di infezione
primaria.
Se la gemma apicale e' difettosa o assente, il germinello e'
anormale anche se si sono sviluppate una o due gemme (ad es.
PHASEOLUS) o germogli ascellari (ad es. PISUM).
VI. COLEOPTILE e PRIMA FOGLIA (GRAMINACEAE)
COLEOPTILE: (1) deformato, (2) danneggiato, (3) assente, (4) con
l'apice danneggiato o assente, (5) decisamente ripiegato, (6)
formante un anello o una spirale, (7) strettamente contorto, (8)
diviso a partire dall'apice per oltre 1/3 della lunghezza, (9) diviso
alla base, (10) aghiforme, (11) deteriorato a causa di infezione
primaria;
PRIMA FOGLIA (interna al coleoptile): (12) allungata per meno della
meta' del coleoptile, (13) assente, (14) lacerata o comunque
deformata.
VII. GERMINELLO nel suo insieme: (1) deformato, (2) fratturato, (3)
cotiledoni emergenti prima della radice, (4) due germinelli, fusi
insieme, (5) avvolgimento persistente dell'endosperma (collare), (6)
giallo o bianco, (7) aghiforme, (8) acquoso o vitreo, (9) deteriorato
a causa di infezione primaria.
(4) Per una piu' particolareggiata descrizione e
valutazione dei germinelli anormali si suggerisce la
consultazione dei testi specializzati editi dall'I.S.T.A.
(International Seed Testing Association).
5.2.5. Semi morti o vani.
Sono i semi che al termine della prova di germinazione non hanno
prodotto germinelli e non possono essere considerati come semi duri o
semi freschi non germinati.
5.3. Attrezzature
Per l'esecuzione delle prove di germinazione si impiegano le
seguenti attrezzature di laboratorio.
5.3.1. Substrati
I substrati devono essere di natura tale da assorbire l'acqua e
cederla ai semi nella quantita' ad essi necessaria per la
germinazione. Essi possono essere di carta da filtro o di sabbia
silicea.
a) Carta da filtro:
la carta da filtro non deve essere resistente alla rottura, avere
adeguato spessore (0,25 mm), elevata capacita' di assorbimento (una
striscia della larghezza di 10 mm sospesa verticalmente con il lembo
inferiore immerso in acqua per 20 mm, l'acqua deve risalire in 2
minuti per non meno di 30 mm), un contenuto di ceneri non superiore
al 2%, deve essere esente da sostanze chimiche dannose alla
germinazione; deve avere un pH = 6,5 - 7,5 ed essere sterilizzata.
b) Sabbia:
la sabbia deve esser formata da particelle di diametro compreso tra
0,05 e 0,8 mm. Deve inoltre essere chimicamente e biologicamente
inerte, priva di sostanze tossiche, avere pH = 6,5 - 7,5 ed essere
sterilizzata.
5.3.2. Germinatoi, armadi e camere di germinazione
A - I germinatoi hanno la funzione di mantenere il grado di
umidita' del substrato il piu' costante possibile. Pertanto e'
opportuno che siano muniti di coperchio o altri dispositivi, atti a
prevenire perdite di umidita' verso l'esterno. Essi possono essere:
a) recipienti tipo capsule Petri, di vetro o di plastica,
particolarmente indicati per semi piccoli e quando si usa come
substrato la carta da filtro;
b) recipienti di altro tipo, materiale, forma e dimensioni
opportune, in relazione anche alle dimensioni del seme da porre in
germinazione. Sono particolarmente indicati per i semi grossi e
quando si usa come substrato la sabbia o la carta da filtro;
c) banchi di germinazione tipo germinatoio Jacobsen od attrezzature
similari nelle quali sia assicurato il mantenimento del grado di
umidita' e di temperatura necessari.
B - Armadi o camere di germinazione
Sono armadi o camere nelle quali vengono realizzate le condizioni
ambientali necessarie per la germinazione dei semi. Essi devono
rispondere ai seguenti requisiti:
a) essere forniti di termostato regolatore con una oscillazione
massima di +- 1C e di consentire, nei casi di alternanza di
temperatura, di raggiungere le temperature prescritte nel termine
massimo di due ore;
b) avere la possibilita' di ottenere, per le prove che richiedono
la luce, una illuminazione di intensita' regolabile tra 250 e 1.250
lux.
La presenza di dispositivi atti a mantenere un'umidita' relativa
prossima alla saturazione all'interno degli armadi o delle camere di
germinazione possono contribuire a ridurre le perdite di umidita' dei
substrati.
5.4. CAMPIONE DI ANALISI.
a) L'analisi di germinazione deve essere eseguita su 400 semi presi
dalla frazione di seme puro dell'analisi di purezza eseguita secondo
le prescrizioni del cap. 3. Allo scopo si mescolano i semi puri dei
due sottocampioni dell'analisi di purezza e si contano 4 ripetizioni
di 100 semi ciascuna da porre nei germinatoi.
b) Quando e' richiesta soltanto la prova di germinazione si
prelevano 2 sottocampioni di analisi con le stesse modalita' indicate
nella sezione 1.4. e ciascuno di peso non inferiore alla meta' di
quello indicato per l'analisi di purezza (colonna 5 dell'allegato I).
Si effettua la separazione dei semi puri dai semi estranei e dalle
impurita' inerti con le stesse modalita' indicate nella sez. 3.3.1,
fino a contare 4 ripetizioni di 100 semi ciascuna.
c) Quando le dimensioni dei semi non consentono una sufficiente
spaziatura nei germinatoi, ogni ripetizione puo' essere suddivisa in
2 sottoripetizioni di 50 semi ciascuna o in 4 di 25 semi ciascuna.
d) Per le specie che sono poco rappresentate nei MISCUGLI puo'
accadere di non trovare tra i semi puri dei due sottocampioni
dell'analisi della purezza i 400 semi necessari per la prova di
germinazione.
In questo caso si dovranno separare anche dalla rimanenza del
campione medio finale di prelevamento tanti semi puri fino ad
ottenere il numero di semi prescritto. Nel caso che tale numero non
venga raggiunto, la prova di germinazione e' effettuata sulla
totalita' dei semi ottenuti, suddivisi in 4 ripetizioni uguali; in
questo caso sul certificato di analisi deve essere indicato il numero
effettivo di semi di ciascun componente sottoposto alla prova.
5.5. ESECUZIONE DELL'ANALISI
I semi devono essere messi nel germinatoio in modo da evitare il
contatto reciproco dei germinelli e devono essere posti nelle
condizioni di germinazione generali e particolari prescritte
(allegato II).
I semi devono essere messi nel germinatoio nello stato in cui
pervengono al laboratorio.
5.5.1. Condizioni generali:
A - Substrato.
Per ogni tipo di seme deve essere usato un adeguato tipo di
substrato, come indicato nella col. 2 delle tabelle dell'allegato II.
a) Carta da filtro.
Puo' essere usata nei seguenti modi:
C ( su carta da filtro). I semi sono messi a germinare su uno o
piu' dischi di carta da filtro posti nei germinatoi (sez. 5.3.2.);
TC (tra carta da filtro). I semi sono messi a germinare tra due
dischi o strati di carta da filtro posti in germinatoi come sopra;
CP (carta da filtro pieghettata). I semi sono messi a germinare tra
le pieghe di una striscia di carta da filtro lunga 200 cm, larga 11
cm. Ogni striscia porta 50 pieghe alte 2 cm. Disposti i semi, il
tutto puo' essere avvolto in un'altra striscia di carta da filtro
lunga 58 cm e larga 11 cm e posto in germinatoio. La carta
pieghettata deve avere un peso di 100-200 g per m2 ed un potere
assorbente di acqua del 220-240%. La striscia avvolgente deve pesare
60 g per m2 ed avere potere assorbente di acqua del 220-240%.
b) Sabbia silicea.
Puo' essere usata come segue:
S (in sabbia). I semi sono posti su uno strato uniforme di sabbia
umida e coperti con un altro strato di 10-20 mm di sabbia;
SS (su sabbia). I semi sono posti e leggermente pressati su uno
strato uniforme di sabbia umida.
B - Umidita'.
Per tutta la durata della prova il substrato deve contenere un
grado di umidita' sufficiente per la germinazione dei semi e non deve
mai essere in eccesso.
Tre sono i gradi di umidita' raccomandati: elevato (e), medio (m),
scarso (s). Nella colonna 3 delle tabelle dell'allegato II sono
indicati, per ciascuna specie e per il relativo substrato, i gradi di
umidita' da mantenere per la prova di germinazione.
Per la CARTA DA FILTRO il grado elevato di umidita' si ottiene
immergendo il disco o il foglio completamente in acqua e disponendolo
subito, senza sgocciolarlo, sul fondo del germinatoio; il grado medio
di umidita' si ottiene immergendo completamente il disco o il foglio
nell'acqua contenuta in una vaschetta, indi si estrae strisciandolo
lungo la parete del recipiente per eliminare l'eccesso di acqua prima
di disporlo sul fondo del germinatoio; il grado scarso si ottiene
immergendo il disco o il foglio a meta' nell'acqua e disponendolo
senza sgocciolarlo sul fondo del germinatoio.
Per la SABBIA i tre livelli di umidita' corrispondono al 60%
(elevato), 50% (medio), 40% (scarso) della capacita' idrica di
ritenuta della sabbia usata.
Il grado di umidita' del substrato deve essere mantenuto costante
per tutta la durata della prova; bisogna quindi controllarlo
frequentemente e ripristinarlo, se necessario, con successive
aggiunte di acqua.
C - Temperatura.
Le temperature prescritte per ogni specie di seme sono indicate
nella col. 4 delle tabelle dell'allegato II e devono essere uniformi
in tutto l'ambiente di germinazione (armadi termostatici, camere di
germinazione, ecc.).
Le temperature possono essere:
a) costanti durante le 24 ore giornaliere: esse sono indicate con
un solo numero;
b) alternate nelle 24 ore giornaliere: esse sono indicate con due
numeri separati da una lineetta. In questo caso la temperatura piu'
alta viene usata per 8 ore giornaliere e la piu' bassa per le
rimanenti 16 ore.
D - Luce
Le specie che, per germinare, richiedono la luce, devono essere
poste in ambienti con luce naturale o artificiale.
Nella colonna 5 delle tabelle dell'allegato II sono contraddistinte
con una L le specie per le quali e' prescritta la luce. Si raccomanda
in proposito l'uso di lampade a luce bianca e fredda. I semi devono
essere esposti alla luce per almeno 8 ore al giorno e in concomitanza
con la temperatura piu' alta per le specie che richiedono
l'alternanza di temperatura.
L'intensita' della luce deve essere di circa 750-1.250 lux; per i
semi non dormienti puo' essere sufficiente anche una intensita' di
250 lux.
5.5.2. Trattamenti speciali
Per i campioni che presentano semi freschi o dormienti si adottano
uno o piu' dei seguenti trattamenti speciali, come indicato nella
colonna 8 delle tabelle dell'allegato II.
L'impiego di questi trattamenti speciali deve essere indicato sul
certificato di analisi.
I trattamenti speciali sono:
a) Prerefrigerazione.
Essa consiste nell'esporre preventivamente i semi, gia' posti sul
substrato umido, alle temperature e per i periodi di tempo indicati
per ciascuna specie nella colonna 8 delle tabelle dell'allegato II.
I giorni della prerefrigerazione non devono essere conteggiati ai
fini della durata della prova. Talvolta puo' anche essere necessario
prolungare il periodo di prerefrigerazione o refrigerare di nuovo
dopo il primo conteggio dei semi germinati:
b) Nitrato potassico (KNO3).
All'inizio della prova il grado di umidita' richiesto viene
raggiunto inumidendo il substrato con una soluzione di nitrato
potassico allo 0,2% di acqua distillata. Per le aggiunte successive,
necessarie al ripristino dell'umidita', si impiega acqua normale.
c) Acido gibberellico (GA3).
Il substrato di germinazione e' inumidito con una soluzione di GA3
a 500 ppm, preparato sciogliendo 500 mg di GA3 in un litro di acqua
distillata. Quando la dormienza e' piu' debole la concentrazione puo'
essere limitata a 200 ppm; quando essa e' piu' accentuata la
concentrazione puo' arrivare a 1000 ppm.
Se la concentrazione supera 800 ppm, si puo' sostiture l'acqua con
una soluzione tampone 0,01M, preparata sciogliendo 1,7799 g di
Na2HPO4 e 1,3799 g di NaH2PO4.H2O in un litro di acqua distillata.
d) Prova a temperature diverse.
Talvolta puo' essere necessario effettuare la prova ad una
temperatura diversa da quella normalmente prescritta. Queste sono in-
dicate nella colonna 8 delle tabelle dell'allegato II. Se a
temperatura piu' bassa, il processo germinativo si svolge piu'
lentamente la durata della prova puo' quindi essere prolungata fino a
7 giorni.
e) Prelavaggio.
Quando i semi contengono sostanze naturali che possono inibire la
germinazione, e' necessario rimuoverle immergendo e lavando i semi in
acqua alla temperatura di 20-25C per i tempi indicati nella colonna
8 delle tabelle dell'allegato II.
f) Preessiccamento.
Prima di essere posti nelle condizioni prescritte per la
germinazione, i semi delle ripetizioni sono tenuti ad una temperatura
non superiore a 40C con libera circolazione di aria e per un periodo
massimo di 7 giorni. In alcuni casi puo' essere necessario prolungare
la durata del preessiccamento.
Sul certificato d'analisi dovra' essere indicata, oltre alla
temperatura, anche la durata di tale trattamento.
g) Prova con substrato diverso.
Per certe varieta' di determinate specie l'uso di un substrato
diverso da quello indicato nella colonna 2 delle tabelle
dell'allegato II risulta piu' efficace.
Questo e' indicato nella colonna 8 delle tabelle dell'allegato II.
5.5.3. Durata dell'analisi.
I giorni della prima e dell'ultima conta sono indicati nelle
colonne 6 e 7 delle tabelle dell'allegato II.
Quando i semi sono sottoposti a refrigerazione, i giorni richiesti
per il trattamento sono esclusi dal conteggio dei giorni prescritti
per l'analisi.
Se al termine del periodo di analisi alcuni semi hanno appena
iniziato la germinazione, l'analisi puo' essere prolungata per altri
sette giorni al massimo.
L'analisi puo' essere conclusa anche prima del termine prescritto
quando nessun altro seme, fra quelli rimasti, risulta suscettibile di
germinare ulteriormente.
I giorni indicati per il primo conteggio possono subire variazioni
a discrezione dell'analista; l'importante e' che i germinelli abbiano
raggiunto uno stadio di sviluppo tale da poter consentire una
corretta osservazione e valutazione delle loro strutture essenziali.
Possono essere fatti anche conteggi intermedi per togliere i
germinelli che hanno raggiunto un sufficiente stadio di sviluppo, ma
il loro numero deve essere ridotto al minimo per evitare danni ai
germinelli in incipiente accrescimento.
In certi casi, ad es. prova in sabbia (S), puo' essere conveniente
eseguire solo il conteggio finale.
Se le sementi arboree ed arbustive al termine della prova
presentano ancora semi dormienti, si deve o prolungare la durata
della prova o sezionare il seme ed osservare lo stato dell'embrione e
dei tessuti circostanti o ricorrere alla prova biochimica al
tetrazolo (cap. 6).
Il numero effettivo di giorni impiegato per giungere al risultato
finale deve essere indicato nel certificato di analisi.
5.5.4. Valutazione dei semi germinati e non germinati.
Per un'esatta determinazione della percentuale della
germinabilita', e' necessario valutare attentamente i semi in prova
ricordando le definizioni date alla sezione 5.2.
Nel corso del primo conteggio e di quelli intermedi (sez. 5.5.3.)
devono essere rimossi solo i semi che hanno dato germinelli normali e
quelli evidentemente morti e ammuffiti che possono essere fonte di
contaminazione per quelli sani. Una esatta valutazione dei semi
germinati puo' essere fatta solo quando i germinelli hanno raggiunto
uno stadio di sviluppo sufficiente per accertare se posseggono i
requisiti necessari per essere considerati normali. Talvolta e'
necessario rimuovere il tegumento del seme per esaminare la piumetta
ed i cotiledoni che, al momento del conteggio finale, vi fossero
inclusi. In particolare, l'esame dei cotiledoni in alcune specie (per
es. PHASEOLUS), deve essere fatto previo divaricamento degli stessi,
quando siano ancora a contatto fra loro, per controllare eventuali
manifestazioni di necrosi interne e le condizioni della piumetta.
I campioni trattati chimicamente che presentano nelle prove su
carta anomalie dei germinelli, per probabile fitotossicita', vanno
riesaminati ripetendo la prova con sabbia.
Le strutture a semi multipli (ad esempio semi polispermi, glomeruli
di barbabietola e spighette pluriflore di graminacee) comprese nella
frazione del seme puro (sez. 3.3.1.) devono essere considerate, ai
fini dell'analisi di germinabilita', cone singoli semi. Il risultato
dell'analisi indica la percentuale di strutture che hanno prodotto
almeno un germinello normale.
Un seme di pianta forestale che produce piu' germinelli per effetto
della poliembrionia deve essere contato come un singolo seme. Quando
i semi a piu' embrioni superano il 5%, si deve indicare la
percentuale esatta sul certificato d'analisi.
Per le specie con strutture a seme multiplo, qualora sia richiesta
anche la determinazione del grado di germia (es. barbabietole),
nell'analisi di germinazione si deve adottare un metodo (es. CP) che
consenta, per il sufficiente distanziamento delle strutture seminali,
il conteggio di tutti i germinelli da esse prodotti.
Si determina cosi' il numero di strutture che hanno prodotto uno,
due o piu' germinelli normali e di ciascun gruppo viene indicata la
percentuale sul numero complessivo di strutture germinate.
5.6. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEL RISULTATO.
5.6.1. Calcolo del risultato.
Il risultato dell'analisi di germinabilita' e' dato dal valore
medio dei risultati ottenuti dalle quattro ripetizioni (sez. 5.4.a.).
Nel caso in cui si devono eseguire piu' sottoripetizioni (sez.
5.4.c.), queste si raggruppano in modo da ottenere le 4 ripetizioni
di 100 semi ciascuna.
Si verifica poi l'attendibilita' della prova usando la tabella 3.
Quando la differenza fra il risultato piu' elevato e quello piu'
basso delle quattro ripetizioni, rispetto al loro valore medio,
rientra nei limiti indicati nella colonna 3 della tabella suddetta,
la prova risulta statisticamente valida e la media dei risultati
delle quattro ripetizioni rappresenta il valore definitivo che deve
essere riportato sul certificato di analisi.
Il risultato non e' considerato valido e le prove devono essere
ripetute quando:
a) le differenze fra le ripetizioni escono dai limiti di tolleranza
indicati nella tabella 3;
b) quando e' evidente che i risultati non sono soddisfacenti a
causa di errate condizioni di analisi, intervenute anche per brevi
periodi, o di errate valutazioni dei germinelli o di altri fattori
accidentali;
c) quando e' evidente che il risultato non puo' essere accettabile
a causa di dormienza dei semi, di fitotossicita' o di diffusione di
funghi e batteri.
Nel caso di ripetizione dell'analisi, se il secondo risultato e'
compatibile con il primo, la media di entrambe le analisi rappresenta
il risultato definitivo che deve essere riportato sul certificato.
I due risultati sono fra loro compatibili se la loro differenza,
rispetto alla loro media, rientra nei limiti di tolleranza prescritti
nella colonna 3 della tabella 4. Nel caso di incompatibilita' si deve
fare un'altra analisi e tenere valido, come risultato definitivo, la
media fra i due compatibili.
TABELLA 3
TOLLERANZE MASSIME AMMESSE FRA LA PERCENTUALE DI GERMINAZIONE PIU'
ALTA E QUELLA PIU' BASSA, DI QUALSIASI CATEGORIA DI SEMI OTTENUTE
NELLE QUATTRO RIPETIZIONI DELLA PROVA DI GERMINAZIONE (p = 0.025) da
I.S.T.A. Rules, 1985
a) Percentuale media di germinazione
b) Tolleranza massima
c) Percentuale media di germinazione
d) Tolleranza massima
a) 99 2
b) 5
c) 87-88 13-14
d) 13
a) 98 3
b) 6
c) 84-86 15-17
d) 14
a) 97 4
b) 7
c) 81-83 18-20
d) 15
a) 96 5
b) 8
c) 78-80 21-23
d) 16
a) 95 6
b) 9
c) 73-77 24-28
d) 17
a) 93-94 7-8
b) 10
c) 67-72 29-34
d) 18
a) 91-92 9-10
b) 11
c) 56-66 35-45
d) 19
a) 89-90 11-12
b) 12
c) 51-55 46-50
d) 20
TABELLA 4
TOLLERANZE MASSIME AMMESSE NELLE DIFFERENZE DI RISULTATI FRA DUE
ANALISI ESEGUITE SULLO STESSO CAMPIONE (p = 0.025) da I.S.T.A.
Rules, 1985
i. Percentuale media di germinazione
ii. Tolleranza
iii. Percentuale media di germinazione
iv. Tolleranza
i. 98-99 2-3
ii. 2
iii. 77-84 17-24
iv. 6
i. 95-97 4-6
ii. 3
iii. 60-76 25-41
iv. 7
i. 91-94 7-10
ii. 4
iii. 51-59
iv. 42-50
i. 8
ii. 85-90 11-16
iii. 5
iv.
5.6.2. Espressione del risultato.
Il risultato dell'analisi di germinazione deve essere espresso
indicando sul certificato di analisi la durata effettiva della prova
(in giorni), escludendo dal conteggio i giorni richiesti per
eventuali pretrattamenti, nonche' il dato percentuale dei germinelli
normali, dei germinelli anormali, dei semi duri, dei semi freschi non
germinati e dei semi morti. Dette percentuali devono essere espresse
da numeri interi, arrotondando per eccesso i decimali uguali o
superiori a 0,5 e per difetto quelli inferiori.
Nel caso di miscugli, accanto al nome botanico di ciascuna specie,
che e' stata dichiarata come componente del miscuglio, si deve
indicare la corrispondente percentuale di semi germinati con
germinelli normali e, per le specie che ne contengono, la percentuale
di semi duri. Quando la prova e' stata eseguita su un numero di semi
minore di 400 (sez. 5.4.d.) questo numero dovra' essere precisato nel
certificato di analisi.
Quando sia necessario ricorrere a trattamenti speciali (sez.
5.5.2.) bisogna indicare nel certificato di analisi i trattamenti
effettuati.
Nel caso di semi forestali si deve riportare sul certificato di
analisi, la percentuale di semi vani.
6 - DETERMINAZIONE DELLA VITALITA'
DEL SEME CON SAGGIO BIOCHIMICO
(Prova al Tetrazolo)
Questa determinazione (5) ha per scopo la stima della vitalita' dei
semi di alcune specie arbustive ed arboree che germinano troppo
lentamente, (oltre 2 mesi incluso il periodo di prerefrigerazione)
quando vengono analizzate con le normali prove di germinazione, o che
presentano, al termine della prova di germinazione, semi dormienti di
cui si deve determinare la vitalita' (sez. 5.5.2.).
Le specie per le quali e' ammessa questa determinazione sono: ACER
spp., CARPINUS spp., CELTIS AUSTRALIS, CHAMAECYPARIS THYOIDES, CORNUS
MAS e C. SANGUINEA, CORYLUS spp., CRATAEGUS spp., ELAEAGNUS
ANGUSTIFOLIA, EVONYMUS EUROPAEA, FAGUS SYLVATICA, FRAXINUS spp.,
JUNIPERUS spp., LIBOCEDRUS DECURRENS, LIGUSTRUM VULGARE, LIRIODENDRON
TULIPIFERA, MALUS spp., OSTRYA spp., PINUS spp., PRUNUS spp., PYRUS
spp., ROSA spp., SORBUS spp., TAXODIUM DISTICUM, TAXUS spp. e TILIA
spp.
6.1. CAMPIONE D'ANALISI.
La prova viene eseguita su 4 ripetizioni, ciascuna di 100 semi (o
frutti) puri, prelevate secondo le direttive date per l'analisi della
germinabilita' (sez. 5.4.).
6.2. ESECUZIONE DELL'ANALISI.
6.2.1. Indicazioni generali.
Per questa determinazione si impiega una soluzione acquosa all'1%
di 2,3,5,cloruro-trifenil-tetrazolo. I semi di ciascuna delle 4
ripetizioni devono venire immersi nella soluzione al tetrazolo e
conservati al buio alla temperatura di 30C +- 1, a meno che non si
tratti di specie per le quali le direttive particolari prevedano un
grado di temperatura diverso, e per un periodo di tempo variabile a
seconda della specie (sez. 6.2.2.).
Terminato il trattamento al tetrazolo, la soluzione viene decantata
ed i semi vengono risciacquati con acqua per procedere poi all'esame
della colorazione assunta dall'embrione e dall'endosperma. Per
questo esame e' necessario stendere i semi di ciascuna ripetizione su
una piastra, per meta' bianca e per meta' nera e mantenerli umidi
durante il corso dell'operazione.
(5) Il saggio biochimico si basa sui processi di riduzione
che avvengono nei tessuti viventi del seme a carico di un
indicatore, il 2, 3, 5, trifeniltetrazolo-cloruro o
bromuro, che, per idrogenazione, da' origine ad una
sostanza, il trifenilformazano, rossa, stabile e non
diffusibile; cio' permette di distinguere le parti vitali,
colorate in rosso, da quelle non vitali, senza colore. La
posizione e la proporzione delle aree necrotiche
dell'embrione e dell'endosperma permettono la
determinazione della vitalita' del seme. Per questi motivi
il metodo e' anche chiamato Metodo Topografico al
Tetrazolo.
6.2.2. Indicazioni particolari.
Oltre alle direttive generali teste' descritte ve ne sono altre,
particolari, per ciascuna delle specie sottoindicate, che precisano
le tecniche da seguire e i criteri di valutazione dei risultati:
a) ACER spp.
Si rimuove dal seme il pericarpo con l'ala. I semi vengono quindi
tenuti in acqua per 18-20 ore, quando il seme e' secco si consiglia
un trattamento di prerefrigerazione a 3-5C per sette giorni. Si
libera l'embrione dalla pellicola servendosi di una lancetta per
dissezione. Con un bisturi sottile si tagliano 0,5 mm della punta
della radichetta e dei cotiledoni dalla parte opposta alla
radichetta. I semi cosi' preparati si immergono nella soluzione al
tetrazolo per 24 ore.
Si considerano vitali i semi che presentano:
1) embrione completamente colorato;
2) embrione con punto non colorato all'estremita' della radichetta,
se questo non oltrepassa la meta' della lunghezza della radichetta;
3) embrione con macchie incolori sulla meta' dei cotiledoni opposta
alla radichetta;
4) embrione che presenta contemporaneamente le caratteristiche in-
dicate in 2 e 3.
b) CARPINUS spp. e OSTRYA spp.
Si devono tenere i frutti in acqua per 18-20 ore. Per mezzo di
piccole e robuste cesoie si rimuove il terzo inferiore dell'achenio,
cioe' la porzione piu' slargata al di sopra della cicatrice basale
che e' opposta alla radichetta. Si immerge la parte dell'achenio che
contiene la radichetta nella soluzione al tetrazolo per 24 ore. Si
estrae poi l'embrione dai tegumenti per mezzo di una lancetta da
dissezione.
Si considerano vitali i semi che presentano:
1) embrione completamente colorato;
2) embrione con punto non colorato all'estremita' della radichetta;
3) embrione con macchie incolori sulla porzione dei cotiledoni che
e' opposta alla radichetta, se queste non oltrepassano la meta' del
cotiledone nel caso di necrosi superficiale e il terzo del cotiledone
quando si tratti di necrosi profonda;
4) embrione che presenta contemporaneamente le caratteristiche in-
dicate in 2 e 3.
c) CELTIS AUSTRALIS L.
Si liberano i semi dalla polpa, quando questa e' presente, dopo
averli tenuti in acqua per 18-20 ore, asciugandoli poi sommariamente
con carta da filtro. Si rompe il guscio con una morsa ad alveoli di
dimensione opportuna. Si tengono i semi, cosi' preparati, in acqua
per 18-20 ore. Si libera l'embrione dalla pellicola, servendosi di
una lancetta da dissezione, se l'operazione precedente non l'ha
completamente rimossa. Si immergono gli embrioni nella soluzione di
tetrazolo per 24 ore.
Sono da considerare vitali i semi che presentano l'embrione
completamente colorato. Sono tollerate piccole necrosi superficiali
nella meta' dei cotiledoni opposta alla radichetta.
d) CHAMAECYPARIS THYOIDES L. (B.S.P.)
Si tengono i semi in acqua per 18-20 ore. Si rimuove un quarto del
seme dalla parte basale, opposta alla radichetta, mediante un bisturi
sottile. I semi cosi' trattati vengono immersi per 24 ore nella
soluzione al tetrazolo. Si libera l'endosperma dai tegumenti seminali
mediante una lancetta da dissezione e si separa l'embrione.
Vanno considerati vitali i semi con embrione ed endosperma
completamente colorati.
e) CORNUS MAS L. e CORNUS SANGUINEA L.
Si tengono i semi in acqua per circa 48 ore. Con l'aiuto di piccole
e robuste cesoie si taglia un terzo del seme dalla parte basale
opposta alla radichetta. Si immergono i semi cosi' preparati nella
soluzione al tetrazolo per 48 ore. Servendosi di una lancetta da
dissezione si estrae l'embrione dagli involucri seminali e dal
sottile endosperma.
Sono da considerare vitali i semi che presentano:
1) embrione completamente colorato;
2) embrione con punto non colorato all'estremita' della radichetta.
f) CORYLUS spp.
Si tengono le nocciole in acqua per 18-20 ore. Si rompe il guscio
con una morsa o con una pinza per liberare i semi che vengono poi
immersi in acqua per 18-20 ore. Si rimuovono i tegumenti seminali
scuri con una lancetta da dissezione e si divide il seme in due parti
lungo la linea di separazione dei cotiledoni. Si immergono nella
soluzione di tetrazolo per 24 ore solo i cotiledoni che presentano
radichetta e piumetta.
Si considerano vitali i semi che presentano:
1) embrione completamente colorato;
2) embrione con punto non colorato all'estremita' della radichetta;
3) embrione con macchie scolorate sul cotiledone se queste non
superano la meta' del cotiledone opposto alla radichetta e con
necrosi nel centro della parte ventrale del cotiledone se il diametro
della macchia non supera il raggio del cotiledone;
4) embrione che presenta contemporaneamente le caratteristiche 2 e
3.
g) COTONEASTER spp., CRATAEGUS spp. e ROSA spp.
Si fanno rigonfiare i semi in acqua per 18-20 ore. Per mezzo di
fini e robuste cesoie si rimuove la parte basale del seme, un terzo o
poco piu', cioe' la parte piu' larga che contiene l'ilo e che e'
opposta alla radichetta. Si immergono i semi cosi' preparati nella
soluzione di tetrazolo per 24 ore. Si estrae, per mezzo di una
lancetta, l'embrione dagli invogli seminali.
I semi da considerare vitali con quelli che presentano:
1) embrione completamente colorato;
2) embrione con punto non colorato all'estremita' della radichetta;
3) embrione con macchie bianche nella porzione dei cotiledoni
opposta alla radichetta, se queste non interessano piu' della meta'
del cotiledone quando si tratti di necrosi superficiali o piu' di un
terzo del cotiledone nel caso di necrosi profonda;
4) embrione che riunisce contemporaneamente le caratteristiche 2 e
3.
h) ELEAGNUS ANGUSTIFOLIA L.
Si mettono i semi in acqua per 18-20 ore. Mediante piccole cesoie
si taglia un terzo del seme dalla parte basale opposta alla
radichetta. Si immerge il seme cosi' preparato nella soluzione al
tetrazolo per 24 ore.
Si rimuove l'embrione dai tegumenti seminali e dal rudimentale
endosperma con una lancetta da dissezione.
Si considerano vitali i semi che presentano:
1) embrione completamente colorato;
2) embrione con punto non colorato all'estremita' della radichetta;
3) embrione con macchie scolorate sulla meta' superiore dei
cotiledoni opposta alla radichetta;
4) embrione che presenta contemporaneamente le caratteristiche 2 e
3.
i) EVONYMUS EUROPAEA L.
Si mettono i frutti in acqua per 18-20 ore. Si rimuove la polpa dal
seme e con piccole cesoie si taglia un terzo della parte basale
opposta alla radichetta. Si mette il seme cosi' preparato nella
soluzione di tetrazolo per 48 ore. Mediante una lancetta da
dissezione si rimuove il tegumento seminale e si pone il seme senza
tegumento in acqua ancora per 3 ore.
Indi si rimuove la sottile pellicola procedendo dal taglio verso
l'estremita' del seme. Si apre l'endosperma e si libera l'embrione.
I semi da considerare vitali sono quelli che presentano embrione ed
endosperma colorati completamente.
k) FAGUS SYLVATICA L.
Si immergono i frutti nell'acqua per 18-20 ore. Si rimuove il
pericarpo e si pongono i semi in acqua per un ulteriore periodo di
almeno 6 ore. Con l'aiuto di una lancetta da dissezione si rimuove il
tegumento e si pongono i semi nella soluzione di tetrazolo per 24
ore.
Si considerano vitali i semi che presentano:
1) embrione completamente colorato;
2) embrione con macchia non colorata all'estremita' della
radichetta superiore ad un terzo della parte visibile della
radichetta;
3) embrione con macchie non colorate sulla meta' superiore dei
cotiledoni opposta alla radichetta, senza macchie non colorate sulla
superficie esterna ed interna della meta' inferiore dei cotiledoni.
I cotiledoni devono essere aperti per rilevare eventuali macchie
senza colore;
4) embrione che presenta contemporaneamente le caratteristiche 2 e
3.
l) FRAXINUS spp.
Si rimuove il pericarpo con l'ala. I semi vengono quindi tenuti in
acqua per 18-20 ore. Si asporta una striscetta di endosperma larga
circa 1 mm da entrambi i fianchi del seme. Si immergono i semi cosi'
trattati nella soluzione di tetrazolo per 24-48 ore. Si apre
l'endosperma nelle sue due meta' per mezzo di una lancetta, mettendo
allo scoperto l'embrione.
Sono da considerare vitali i semi che presentano:
1) embrione ed endosperma completamente colorati;
2) embrione completamente colorato, ma endosperma con macchie non
colorate alla sua periferia e quindi in zone distanti dall'embrione.
m) JUNIPERUS spp.
Si deve rimuovere la polpa della pseudobacca per liberare i semi,
che vengono poi immersi in acqua per 18-20 ore. Si rimuove un quarto
del seme dalla parte basale, opposta alla radichetta, mediante
piccole robuste cesoie. I semi cosi' trattati vengono immersi nella
soluzione di tetrazolo per 24 ore. Si libera l'endosperma includente
l'embrione dai tegumenti seminali mediante una lancetta da
dissezione. Si apre l'endosperma e si scopre l'embrione.
Sono da considerare vitali soltanto i semi che presentino embrione
ed endosperma completamente colorati.
n) LIBOCEDRUS DECURRENS TORR.
Si rimuove l'ala del seme secco. Si tagliano 1-2 mm dalla parte
terminale del seme opposta all'ala. Si fanno rigonfiare i semi cosi'
preparati in acqua per 18-20 ore, indi si pongono nella soluzione di
tetrazolo per 48 ore. Con l'aiuto di una lancetta da dissezione si
tolgono i tegumenti seminali, si apre l'endosperma e si scopre
l'embrione.
Sono da considerare vitali i semi che presentino embrione ed
endosperma completamente colorati.
o) LIGUSTRUM VULGARE L.
Si immergono i semi in acqua per 18-20 ore. Mediante piccole cesoie
si taglia un quarto di seme dalla parte opposta alla radichetta ed i
semi cosi' preparati si pongono nella soluzione di tetrazolo per 24
ore. Con una lancetta si rimuovono endosperma ed embrione dai
tegumenti seminali, si apre l'endosperma e si scopre l'embrione.
Si considerano vitali i semi con embrione ed endosperma
completamente colorati.
p) LIRIODENDRON TULIPIFERA L.
Si taglia l'ala dal frutto secco e si immergono i semi in acqua per
18-20 ore. Si asportano 2-3 mm dalla parte terminale del seme opposta
all'ala. I semi cosi' preparati vengono posti nella soluzione di
tetrazolo per 48 ore. Rimossi pericarpo e tegumenti seminali si apre
l'endosperma e si scopre l'embrione.
Sono da considerare vitali i semi con embrione ed endosperma
completamente colorati.
q) MALUS spp., PYRUS spp. e SORBUS spp.
Si rimuove la polpa, se presente, per liberare i semi, che vengono
poi fatti rigonfiare in acqua per 18-20 ore. Per mezzo di una
lancetta da dissezione si rimuovono entrambi i tegumenti seminali, in
modo da mettere a nudo l'embrione. Si immergono quindi gli embrioni
nella soluzione di tetrazolo per 18-20 ore.
Vanno considerati vitali i semi aventi:
1) embrione completamente colorato;
2) embrione con punto non colorato all'estremita' della radichetta;
3) embrione con macchie non colorate sulla porzione dei cotiledoni
opposta alla radichetta purche' esse non superino la meta' o un terzo
del cotiledone, a seconda che si tratti rispettivamente di necrosi
superficiale o profonda;
4) embrione che presenta contemporaneamente le caratteristiche 2 e
3.
r) PINUS CEMBRA L., P. COULTERI D. Don e P. KORAIENSIS Sieb. et
Zucc.
Si rompe e si rimuove il guscio legnoso per mezzo di una pinza o di
una morsa. Si tengono i semi cosi' preparati in acqua per 18-20 ore.
Si libera l'endosperma dal sottile tegumento seminale interno con una
lancetta da dissezione. I semi cosi' trattati vengono messi in
soluzione di tetrazolo per 48 ore. Si apre l'endosperma e si separa
l'embrione.
Sono da considerare vitali i semi aventi embrione completamente
colorato e ben sviluppato, cioe' occupante almeno la meta' della
cavita' embrionale, nonche' l'endosperma completamente colorato.
s) PINUS HELDREICHII Christ., P. JEFFREYI Grev. et Balf., P.
LAMBERTIANA Dougl., P. MONTICOLA Dougl., P. PARVIFLORA Sieb. et
Zucc., P. PEUCE Griseb., P. PUMILA Beg. e P. STROBUS L.
Con l'aiuto di un piccolo bisturi si tagliano 2-3 mm della parte
terminale della radichetta del seme secco. Si fanno rigonfiare i semi
cosi' trattati in acqua per 18-20 ore, indi si mettono nella
soluzione di tetrazolo per 48 ore. Mediante una lancetta da
dissezione si tolgono i tegumenti seminali, si apre l'endosperma e si
scopre l'embrione.
Vanno considerati vitali i semi che presentano embrione ed
endosperma completamente colorati.
t) PRUNUS spp.
Si rimuove la polpa se e' presente, poi si rompe il guscio con una
morsa. I semi vengono immersi in acqua per 18-20 ore. I semi molto
secchi non vanno immersi in acqua, ma debbono essere posti per una
notte fra due fogli di carta da filtro bagnata o su sabbia bagnata
per permetterne il graduale rigonfiamento. E' consigliabile
scarificare i semi dalla parte opposta della radichetta prima di
passarli in acqua o su substrati bagnati per farli rigonfiare. Si
rimuovono i tegumenti residui che avvolgono l'embrione per mezzo di
una lancetta da dissezione e si mettono gli embrioni nella soluzione
di tetrazolo per 18-20 ore.
Vanno considerati vitali i semi che presentano:
1) embrione completamente colorato;
2) embrione con punto non colorato all'apice della radichetta;
3) embrione con macchie non colorate nella porzione dei cotiledoni
opposta alla radichetta purche' esse non superino la meta' o un terzo
del cotiledone, rispettivamente nel caso di necrosi superficiale o
profonda;
4) embrione con le caratteristiche 2 e 3 riunite.
u) TAXODIUM DISTICUM Rich.
Si immergono i semi in acqua per 18-20 ore. Mediante un piccolo
bisturi si asporta un quarto del seme nella parte terminale piu'
larga. I semi cosi' preparati vengono messi nella soluzione di
tetrazolo per 48 ore. Con un bisturi si taglia il tegumento
longitudinalmente e si rimuove l'endosperma con l'embrione. Si apre
l'endosperma e si scopre l'embrione.
Vanno considerati vitali i semi con embrione ed endosperma
completamente colorati.
v) TAXUS spp.
I semi vanno tenuti in acqua per 18-20 ore. Si rinuove un quarto
del seme dalla parte basale per mezzo di piccole e forti cesoie.
Quindi si immergono i semi cosi' preparati nella soluzione di
tetrazolo per 48 ore. Con una lancetta si estrae l'endosperma,
racchiudente l'embrione, dai tegumenti seminali. Si apre poi
l'endosperma, e si scopre l'embrione, oppure si taglia
longitudinalmente il seme a meta'.
Sono da considerare vitali i semi con embrione ed endosperma
completamente colorati.
Se l'endosperma mostra una manifesta insufficienza di colorazione,
il trattamento va ripetuto con le seguenti modalita': dopo essere
stati preliminarmente tagliati, i semi vanno tenuti sotto vuoto per 4
ore a 45C in una soluzione di tetrazolo dove poi rimarranno ancora
durante la notte a 30C.
w) TILIA spp.
Si rimuove il pericarpo dai frutti secchi e si tengono i semi in
acqua per 18-20 ore. Si liberano i semi dal rivestimento che li
avvolge coll'aiuto di una lancetta da dissezione e si pongono, cosi'
preparati, nella soluzione di tetrazolo per 24 ore. Si apre quindi
l'endosperma per mettere a nudo l'embrione.
Vanno considerati vitali i semi che presentano:
1) embrione ed endosperma completamente colorati;
2) embrione completamente colorato, ma endosperma con qualche
piccola macchia superficiale sulla parte esterna.
6.3. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEL RISULTATO.
6.3.1. Calcolo del risultato.
Per il calcolo del risultato finale e la verifica
dell'attendibilita' della prova si procede nel modo indicato per la
determinazione della germinabilita' (sez. 5.6.), adottando le
differenze massime ammesse nella tabella 4.
Se la prova e' risultata statisticamente attendibile il risultato
finale e' dato dalla media delle percentuali di semi considerati
vitali ottenute nelle quattro ripetizioni.
6.3.2. Espressione del risultato.
Nel certificato di analisi il risultato di questa determinazione
viene indicato in percento senza decimali.
7 - DETERMINAZIONE DELL'UMIDITA'
7.1. Scopo
Scopo della determinazione dell'umidita' e' quello di accertare il
contenuto in acqua dei semi. Essa si esegue impiegando i seguenti
metodi appropriati onde evitare, nel corso della determinazione,
processi ossidativi, decomposizioni o perdite di sostanze volatili
che possono alterare il risultato di analisi.
Essa va effettuata quanto prima possibile dopo il ricevimento del
campione che deve essere conforme a quanto indicato nella sezione
1.3.3.
Si utilizza il metodo di essiccamento in stufa per le specie indi-
cate nelle tabelle 6 e 7.
Il grado di umidita' e' determinato dalla perdita di peso del
campione, espressa come percentuale in peso.
7.2. Attrezzature
Per la determinazione dell'umidita' dei semi sono richieste le
seguenti attrezzature di laboratorio:
a) bilancia analitica sensibile al milligrammo;
b) pesafiltri cilindrici di forma bassa di diametro non inferiore a
55 mm;
c) stufa a riscaldamento elettrico e a circolazione d'aria,
provvista di regolatore termostatico che consente di raggiungere
rapidamente, entro 1 ora, la temperatura di 130C e di mantenerla a
+- 2C;
d) essiccatore di vetro contenete gel di silice colorato con
cloruro di cobalto;
e) macinino per la triturazione dei semi, costruito con materiali
che non assorbano o cedano umidita'. Deve operare la triturazione dei
semi in ambiente chiuso senza riscaldare il materiale durante la
macinazione; deve consentire una facile pulizia delle diverse parti
meccaniche che lo compongono e infine deve essere graduabile in modo
da permettere sia una macinazione fine che una grossolana (sez.
7.3.2.).
7.3. Campione di analisi
L'analisi deve essere fatta su due ripetizioni, separatamente
prelevate dal campione ricevuto, ciascuna del peso di 4-5 g per il
metodo in stufa.
Prima di prelevare i campioni di analisi, il campione ricevuto deve
essere rimescolato accuratamente con uno dei seguenti metodi:
a) agitare con un cucchiaio il campione nel suo contenitore;
b) collocare l'apertura del contenitore originale contro l'apertura
di un altro contenitore similare e versare il seme piu' volte avanti
e indietro fra i due contenitori.
Il prelievo dei campioni di analisi deve essere fatto il piu'
rapidamente possibile, in modo che i campioni stessi non rimangano
esposti all'aria per piu' di 30 secondi.
7.4. Triturazione dei semi
I semi grossi, prima della determinazione in stufa, devono essere
triturati a meno che il loro elevato contenuto in olio renda
difficile la triturazione (es. semi di lino) o provochi un aumento di
peso per effetto dell'ossidazione.
Le specie per le quali e' obbligatoria la triturazione sono
elencate nella tabella 5.
La triturazione prescritta puo' essere:
a) FINE: almeno il 50% del materiale triturato deve passare
attraverso un vaglio con maglie di 0,5 mm e non piu' del 10% deve
rimanere sopra un vaglio con maglie di 1,0 mm; questo tipo di
triturazione e' prescritta per i semi di cereali e di cotone;
b) GROSSOLANA: almeno il 50% del materiale triturato deve passare
attraverso un vaglio con maglie di 4,0 mm; questo tipo di
triturazione e' prescritto per i semi grossi di leguminose quali ad
es. LUPINUS spp., PHASEOLUS spp., PISUM spp. e VICIA spp. e di specie
legnose.
La triturazione va in ogni caso effettuata separatamente sui due
campioni di lavoro, ciascuno di circa 10 g di seme.
TABELLA 5
SPECIE PER LE QUALI E' OBBLIGATORIA LA TRITURAZIONE
ARACHYS HYPOGAEA ORYZA SATIVA
AVENA spp. PHASEOLUS SPP.
CICER ARIETINUM PISUM SATIVUM
CITRULLUS LANATUS QUERCUS SPP.
FAGOPYRUM ESCULENTUM RICINUS communis
FAGUS spp. SECALE CEREALE
GLYCINE max SORGHUM SPP.
GOSSYPIUM spp. TRITICOSECALE
HORDEUM VULGARE TRITICUM SPP.
LATHYRUS spp. VICIA SPP.
LUPINUS spp. ZEA MAYS
7.5. Preessiccazione
Se la specie in esame richiede di essere macinata ed il suo
contenuto in umidita' e' tale (superiore al 17%, 10% per la soia) da
non consentire una buona triturazione occorre la preessiccazione. I
due sottocampioni, ciascuno di peso sufficiente in modo d'avere, dopo
preessiccazione, il quantitativo di seme prescritto nella sezione
7.3., sono pesati e posti in contenitori di peso noto in stufa a
105C per 30-60 minuti.
Si tiene quindi conto della perdita di peso avvenuta in ciascuno
dei due sottocampioni e si procede poi alla triturazione col metodo
indicato alla sezione 7.4.
7.6. Esecuzione delle analisi
La determinazione in stufa e' fatta secondo due metodi:
a) BASSA TEMPERATURA COSTANTE:
105C +- 2C per 17 ore a +- 1 ora per le specie elencate nella
tabella 6;
b) ALTA TEMPERATURA COSTANTE:
130-133C per 4 ore per Zea mays, 2 ore per gli altri cereali ed 1
ora per le altre specie indicate nella tabella 7.
Per le specie non elencate nelle tabelle 6 e 7 si procede con il
metodo indicato per le specie affini, o, nei casi dubbi, con il
metodo a bassa temperatura costante.
Per entrambi i metodi si procede come segue: 5 g circa di seme
appena prelevato o di materiale appena triturato vengono messi nel
pesafiltro, previamente tarato col suo coperchio (peso a), in modo da
formare uno strato di spessore uniforme che ricopra tutto il fondo
del pesafiltro stesso.
Il pesafiltro viene quindi chiuso col coperchio e pesato nuovamente
(peso b).
Si porta la stufa alla temperatura voluta e vi si introduce il
pesafiltro ponendo accanto ad esso il relativo coperchio.
Si chiude subito la stufa e si attende che la temperatura, scesa
durante la introduzione del pesafiltro, raggiunga nuovamente il grado
desiderato.
Da questo momento si calcola il tempo di riscaldamento indicato in
a) e b).
Al termine il pesafiltro viene immediatamente chiuso col proprio
coperchio e messo nell'essiccatore per 40 minuti circa, dopo di che
viene nuovamente pesato (peso c).
TABELLA 6
SPECIE PER LE QUALI DEVE ESSERE USATA LA TEMPERATURA COSTANTE DI
+ 105C
ALLIUM spp. HELIANTHUS ANNUUS
ARACHIS HYPOGAEA LINUS USITATISSIMUM
BRASSICA spp. RAPHANUS SATIVUS
CAMELINA SATIVA RICINUS COMMUNIS
CAPSICUM spp. SESAMUM INDICUM (S. orientale)
GLYCINE max SINAPIS spp.
GOSSYPIUM spp. SOLANUM MELONGENA
TABELLA 7
SPECIE PER LE QUALI DEVE ESSERE USATA LA TEMPERATURA COSTANTE DI
+ 130C
AGROSTIS spp. LEPIDIUM SATIVUM
ALOPECURUS PRATENSIS LOLIUM spp.
ANETHUM GRAVEOLENS LOTUS spp.
ANTHOXANTHUM ODORATUM LUPINUS spp.
ANTHRISCUS spp. LYCOPERSICON LYCOPERSICUM (L. ESCULENTUM)
APIUM GRAVEOLENS MEDICAGO spp.
ARRHENATHERUM spp. MELITOTUS spp.
ASPARAGUS OFFICINALIS NICOTIANA TABACUM
AVENA spp. ONOBRYCHIS VICIAEFOLIA
BETA VULGARIS ORNITHOPUS SATIVUS
BROMUS spp. ORYZA SATIVA
CANNABIS SATIVA PANICUM spp.
CARUM CARVI PAPAVER SOMNIFERUM
CHLORIS GAVANA PASPALUM DILATATUM
CICER ARIETINUM PASTINACA SATIVA
CICHORIUM spp. PETROSELINUM CRISPUM
CITRULLUS LANATUS PHALARIS spp.
CUCUMIS spp. PHASEOLUS spp.
CUCURBITA spp. PHLEUM spp.
CUMINUM CYMINUM PISUM SATIVUM
CYNODON DACTYLON POA spp.
CYNOSURUS CRISTATUS SCORZONERA HISPANICA
DACTYLIS GLOMERATA SECALE CEREALE
DAUCUS CAROTA SORGHUM spp.
DESCHAMPSIA spp. SPINACIA spp.
FAGOPYRUM ESCULENTUM TRIFOLIUM spp.
FESTUCA spp. TRISETUM FLAVESCENS
HOLCUS LANATUS TRITICUM spp.
HORDEUM VULGARE VALERIANELLA LOCUSTA
LACTUCA SATIVA VICIA spp.
LATHYRUS spp. ZEA MAYS
7.7. Calcolo ed espressione del risultato
7.7.1. Calcolo del contenuto in umidita'
Il contenuto in umidita' deve essere calcolato come percentuale in
peso con una cifra decimale secondo la formula seguente:
b - c
Umidita' % = x 100
b - a
dove:
a = peso del pesafiltro vuoto e del suo coperchio;
b = peso del pesafiltro col seme e del suo coperchio prima
dell'essiccamento;
c = peso del pesafiltro col seme e del suo coperchio dopo
l'essiccamento.
Se il materiale e' stato sottoposto anche a preessiccamento il
risultato finale sara' calcolato secondo la seguente formula:
S1 x S2
Umidita' % = S1 + S2 -
100
dove:
S1 = umidita' persa nella prima fase (preessiccamento);
S2 = umidita' persa nella seconda fase.
7.7.2. Tolleranze
La determinazione deve essere sempre fatta su due ripetizioni ed
essa si deve ritenere esatta se la differenza fra le due ripetizioni
non supera lo 0,2%.
Diversamente si deve ripetere la determinazione sempre su due
ripetizioni.
7.7.3. Espressione del risultato
Nel certificato di analisi si riporta la media delle due
percentuali, espressa con una sola cifra decimale per arrotondamento.
8 - DETERMINAZIONE DEL PESO DI 1.000 SEMI
Scopo di questa determinazione e' quello di accertare il peso di
1.000 semi del campione.
8.1. Procedura
Da ciascuna delle due frazioni di seme puro del campione di analisi
per la determinazione della purezza, si contano 4 ripetizioni di 100
semi ognuna.
Ogni ripetizione viene pesata in grammi con lo stesso numero di
decimali di un'analisi di purezza (sez. 3.2.d).
Si calcola quindi la varianza, la deviazione standard ed il
coefficiente di variazione come segue:
n (sigmax2) - (sigmax)2
varianza =
n (n - 1)
dove:
x = peso di ogni ripetizione in grammi;
n = numero di ripetizioni;
sigma = sommatoria di
Deviazione standard (S) = radice quadrata varianza
Coefficiente di variazione = S x 100
-x
dove:
-x = peso medio di 100 semi.
Il coefficiente di variazione non deve eccedere 6,0 per i semi
vestiti di graminacee, 4,0 per gli altri semi.
In caso contrario occorre eseguire altre otto ripetizioni e
calcolare la deviazione standard delle 16 ripetizioni; si scartano
poi tutte le ripetizioni che si discostano dalla media per piu' di
due volte la deviazione standard calcolata.
8.2. Calcolo ed espressione del risultato
Si calcola il peso medio di tutte le ripetizioni valide secondo i
calcoli di cui alla sezione 8.1. e si moltiplica per 10 ottenendo
cosi' il peso di 1.000 semi.
Il risultato deve essere espresso in grammi con un numero di cifre
decimali come per l'analisi di purezza (sez. 3.2.d.).
9 - DETERMINAZIONE DEL PESO PER ETTOLITRO
Questa determinazione viene effettuata in doppio con una bilancia
di Tipo Schopper. La differenza tra i due pesi per ettolitro ottenuti
non deve essere superiore a 500 g, altrimenti occorre ripetere la
prova in doppio.
Il risultato e' dato dalla media dei due pesi e viene espresso nel
certificato di analisi in kg con una sola cifra decimale.
10 - DETERMINAZIONE IN NUMERO DELLE CARIOSSIDI ROSSE NEL RISO
Questa determinazione viene effettuata su un campione di 500 g di
seme, che viene sottoposto ad una operazione di sbramatura per
liberare le cariossidi dalle glumelle.
Dalle cariossidi cosi' svestite vengono separate e contate quelle
che presentano il pericarpo totalmente o parzialmente rosso.
Qualora si renda necessario ripetere l'analisi occorre verificarne
la validita' operando nel modo indicato per la ricerca del numero di
semi estranei (sez. 4.4.). Il risultato di questa ricerca viene
espresso nello stesso modo indicato per la determinazione del numero
di semi estranei (sez. 4.4.).
11 - ANALISI DEI SEMI RICOPERTI
Le norme qui di seguito riportate si applicano a sementi ricoperte
con materiali che rendono impossibile l'identificazione di ciascun
seme o di materie inerti ivi contenute senza una preventiva rimozione
del materiale stesso. I semi possono essere rivestiti con materiali
diversi, sia singolarmente (es. confetti) sia in nastri, in tappeti,
ecc. Invece i semi soltanto trattati o conciati non rientrano tra i
semi rivestiti e devono pertanto essere analizzati secondo i metodi
prescritti negli altri capitoli.
Quando nel presente capitolo si fa riferimento a seme "confettato"
cio' e' valido anche per il seme "incrostato" o per il seme "in
granuli".
Se si fa riferimento a seme "in nastri" esso e' valido anche per
seme "in tovaglie o tappeti". In assenza di specifiche indicazioni,
ci si deve attenere alle prescrizioni dei capitoli precedenti.
11.1. Definizioni
SEME CONFETTATO. Confetti piu' o meno sferici idonei per semine di
precisione, comprendenti di norma un singolo seme di forma e
dimensione non evidenti. Il confetto, assieme al materiale
confettante, puo' contenere fitofarmaci, coloranti od altri additivi.
SEME INCROSTATO. Semi ricoperti di materiale incrostante ma che
mantengono in modo piu' o meno evidente la forma del seme, seppure
con peso e dimensioni piu' o meno aumentati. Il materiale incrostante
puo' contenere fitofarmaci, coloranti od altri additivi.
SEME IN GRANULI. Granuli di forma piu' o meno cilindrica, compreso
granuli con piu' di un seme uniti insieme. Il materiale granulante
puo' contenere fitofarmaci, coloranti od altri additivi.
SEME IN NASTRI. Strisce strette o nastri di materiale degradabile,
come la carta o altro, con semi variamente spaziati in gruppi o in
unica fila.
SEME IN TAPPETI. Strisce larghe tovaglie o tappeti di materiale
degradabile come carta o altro, con semi disposti a file, a gruppi o
a spaglio.
SEME TRATTATO. Semi conciati ai quali cioe' sono stati applicati
fitofarmaci, coloranti od altri additivi soltanto e che, pertanto,
non hanno modificato sostanzialmente forma, dimensione o peso del
seme originale, per cui possono essere analizzati secondo i metodi
prescritti negli altri capitoli.
11.2. Campionamento
11.2.1. Dimensioni del lotto
Il peso del lotto non deve superare la quantita' indicata nella
colonna 2 delle tabelle dell'Allegato I con una tolleranza del 5% e
puo' contenere un numero massimo di 1.000 milioni (es. 10.000 unita'
di 100.000 semi ciascuna) di semi confettati o di semi in nastri.
Comunque il peso del lotto al lordo del materiale ricoprente il seme
non deve superare i 42.000 kg (piu' 5%). Quando la dimensione del
lotto e' espressa sul certificato in unita' di semi, va riportato
anche il peso totale del lotto.
11.2.2. Frequenza di campionamento e precauzioni
Il campionamento di lotti di seme confettato va eseguito secondo le
norme prescritte nella sezione 1.2.2. Il campionamento di lotti di
seme in nastri va eseguito prelevando a caso pacchetti o pezzi di
nastro (dai rotoli) analogamente a quanto prescritto nella sezione
1.2.4., purche' i pacchetti o i rotoli, contenenti fino a 2 milioni
di semi (es. 20 unita' da 100.000 semi), possano essere raggruppati a
formare l'unita' di campionamento voluta.
Poiche' i campioni di seme confettato contengono meno semi dei
corrispondenti campioni di seme non confettato, occorre prestare
particolare cura nel prelievo al fine di avere un campione
rappresentativo del lotto e di evitare danni o modificazione ai
confetti o ai semi in nastri durante il prelievo, la manipolazione e
il trasporto. I campioni vanno posti entro contenitori idonei a
proteggerli.
11.2.3. Campione medio finale di prelevamento
Il campione medio finale di prelevamento deve contenere un numero
di confetti o di semi in nastri non inferiore a quello indicato nella
colonna 2 della tabella 8. Se il campione e' di dimensioni piu'
piccole ci si comporta in modo analogo a quanto previsto nella
sezione 1.3.3. B e E, indicando sul certificato il numero di confetti
o di semi in nastri in esso contenuti.
11.2.4. Campione d'analisi
Il campione d'analisi deve contenere un numero di confetti o di
semi in nastri non inferiore a quello indicato nella colonna 3 della
tabella 8. Se viene usato un campione piu' piccolo si deve indicare
sul certificato il numero effettivo di confetti o di semi impiegato.
Per i semi confettati il campione d'analisi puo' essere prelevato con
un divisore meccanico (sez. 1.4.1.a.), purche' l'altezza di caduta
non superi 0,25 m. Per i semi in nastri si prendono a caso pezzi di
nastro in quantita' sufficiente a fornire i semi necessari per
l'analisi.
Tabella 8
Dimensioni dei campioni di semi ricoperti
Determinazioni (1) Campione medio di Campione di analisi
prelevamento non non inferiore a (3)
inferiore a (2)
I. SEMI CONFETTATI N. DI CONFETTI N. DI CONFETTI
Analisi della
purezza compresa
la verifica della
specie 7.500 2.500
Determinazione
del peso 7.500 la frazione dei
confetti puri
Analisi della
germinabilita' 7.500 400
Ricerca di altre
specie 10.000 7.500
Ricerca di altre
specie (in semi
incrostati o in
granuli) 25.000 25.000
Calibratura 10.000 2.000
II. SEMI IN NASTRI NUMERO DI SEMI NUMERO DI SEMI
Analisi della
purezza 2.500 2.500
Verifica della
specie 2.500 100
Analisi della
germinabilita' 2.500 400
Ricerca di altre
specie 10.000 7.500
11.3. Verifica e determinazione della specie
Al fine di controllare se i semi confettati sono della specie
indicata, occorre rimuovere, mediante lavaggio o allo stato secco, il
materiale confettante da 100 confetti puri e determinare il nome e il
numero di semi di ogni specie trovata. Per i semi in nastri occorre
rimuovere ed esaminare 100 semi, separandoli dal materiale avvolgente
o dissolvendolo, e indicare poi il nome ed il numero dei semi di ogni
specie.
11.4. Analisi della purezza
L'analisi della purezza in senso stretto (cioe' del seme
all'interno dei confetti o dei nastri) non e' necessaria a meno che
non sia espressamente richiesta. In questo caso occorre deconfettare
i semi o rimuoverli dai nastri secondo le procedure riportate alla
sezione 11.4.3. e procedere secondo quanto indicato al capitolo 3.
Per l'analisi del seme confettato si osservano le definizioni qui
di seguito date (sez. 11.4.1.). Per il seme in nastri non esistono
definizioni particolari diverse da quelle del capitolo 3.
11.4.1. Definizioni per il seme confettato
Le componenti in cui deve essere suddiviso il campione d'analisi
sono cosi' definite:
a) CONFETTI PURI:
- confetti interi sia che contengano o no un seme;
- confetti rotti o danneggiati nei quali piu' della meta' della
superficie del seme sia coperta dal materiale confettante, a meno che
non sia evidente che il seme non appartiene alla specie indicata o
che esso non sia presente.
b) SEMI NON CONFETTATI:
- semi non confettati di qualsiasi specie;
- confetti rotti contenenti semi che non appartengono alla specie
indicata;
- confetti rotti contenenti semi della specie indicata ma non
includibili nella frazione dei confetti puri.
c) MATERIE INERTI:
- materiale confettante libero;
- confetti rotti senza seme;
- ogni altro materiale definito come materia inerte nella sezione
3.3.3.
11.4.2. Esecuzione dell'analisi ed espressione del risultato
L'analisi viene effettuata su due sottocampioni di peso non
inferiore alla meta' di quello indicato nella colonna 3 della tabella
8. Per il seme confettato, ciascun sottocampione viene separato nei
tre componenti come indicato nella sezione 11.4.1. Dopo la
separazione ogni componente deve essere pesato in grammi con un
numero di decimali necessario per calcolare la percentuale con una
cifra decimale (sez. 3.2.d.). Il calcolo delle percentuali delle
singole componenti, la verifica dell'attendibilita', nonche'
l'espressione del risultato finale viene eseguito secondo quanto
indicato nelle sezioni 3.7.1. e 3.7.2.
11.4.3. Analisi della purezza di semi deconfettati e di semi
rimossi dai nastri
Se occorre procedere ad una analisi di purezza del seme
deconfettato, il campione di analisi di non meno di 2.500 confetti,
deve essere deconfettato agitandolo entro un setaccio immerso in
acqua e a maglie fini tali da impedire perdite di seme e lasciare
disperdere il materiale confettante nell'acqua.
Il materiale trattenuto dal setaccio viene essiccato per 16-20 ore
su carta da filtro poi in una stufa a circolazione di aria come
indicato nella sezione 7.5 per la specie in oggetto. Dopo
l'essiccamento il materiale deve essere sottoposto all'analisi di
purezza, in conformita' al capitolo 3. Le percentuali delle parti
componenti (seme puro, altri semi, materie inerti) vengono calcolate
rispetto al totale dei loro pesi, ignorando il materiale confettante.
La percentuale del materiale confettante deve essere riportata
separatamente e viene desunta per differenza dal peso iniziale del
campione di analisi.
Se occorre procedere ad un'analisi della purezza di semi rimossi
dai nastri, il materiale ricoprente i nastri di carta contenenti i
semi viene cautamente separato ed allontanato. Il nastro di materiale
solubile in acqua viene bagnato fino a liberare il seme. Se vi e'
seme confettato si procede come al precedente comma. Il seme liberato
viene essiccato e sottoposto all'analisi della purezza, come sopra
indicato.
Le percentuali dei singoli componenti vengono calcolate, sempre
come sopra, ignorando il peso del materiale avvolgente il seme.
Il risultato di queste analisi va riportato nel certificato nello
spazio riservato a "altre determinazioni" annotando il peso del
materiale ricoprente eliminato.
11.5. Determinazione del numero di semi di altre specie
Questa determinazione viene fatta solo se richiesta. Il campione
d'analisi non deve essere inferiore a quello indicato nella colonna 3
della tabella 8. Il materiale ricoprente il seme deve essere rimosso
dall'intero campione d'analisi nel modo indicato nella sez. 11.4.3.,
ma l'essiccamento del seme non e' obbligatorio.
Dal campione di seme cosi' ottenuto vengono separati e contati i
semi di tutte le specie rinvenute estranee o soltanto di quelle
richieste.
Il peso effettivo del campione esaminato ed il numero
approssimativo di confetti in esso contenuto ovvero la lunghezza del
nastro o l'area del tappeto esaminata, il nome latino e il numero di
semi di ciascuna specie ricercata in questo peso, lunghezza o area,
devono essere riportati nel certificato di analisi. In aggiunta, il
risultato puo' essere riportato in altro modo (ad es. numero di semi
per chilogrammo, per metro o per metro quadrato).
Qualora si renda necessario ripetere l'analisi occorre verificarne
la validita' con il calcolo della tolleranza prevista nella tabella 2
e procedere come indicato nella sezione 4.4. I due campioni a
confronto devono essere approssimativamente dello stesso peso,
lunghezza o area.
11.6. Analisi di germinabilita'
L'analisi di germinabilita' per il seme confettato deve essere
fatta sui confetti puri dell'analisi della purezza. I confetti devono
essere posti sul substrato nelle condizioni in cui sono pervenuti,
cioe' senza alcun pretrattamento. L'analisi del seme in nastri deve
essere fatta sui nastri senza rimuoverne i semi e senza trattare in
alcun modo il materiale che li ricopre.
Se richiesta o come controllo dell'analisi dei confetti o dei
nastri, si puo' fare in aggiunta l'analisi su semi rimossi dai
confetti o dai nastri. In questo caso e' necessario che la rimozione
del materiale ricoprente avvenga in modo da non danneggiare la
capacita' germinativa del seme (ad es. come indicato nella sezione
11.4.3. ma senza essiccamento del seme rimosso).
11.6.1. Campione di analisi
Per il seme confettato si usano 400 confetti puri in quattro
repliche da 100 confetti ciascuna. Per il seme in nastri si usano
pezzi di nastro presi a caso e in quantita' tale da formare quattro
repliche di almeno 100 semi ciascuna.
11.6.2. Materiali e procedure d'analisi
Per l'analisi dei semi ricoperti si usano gli stessi metodi,
substrati, temperature, condizioni di illuminazione e trattamenti
speciali descritti nel capitolo 5 e prescritti per ciascuna specie
nelle tabelle dell'Allegato II.
Poiche' il substrato piu' appropriato e' risultato, in genere,
essere la carta da filtro pieghettata (CP) per il seme confettato e
tra due carte da filtro (TC) per il seme in nastri, ne viene
raccomandato l'uso e, particolarmente, quando i substrati prescritti
nelle tabelle dell'Allegato II risultano non dare risultati
soddisfacenti.
La quantita' di acqua puo' variare a seconda del materiale
ricoprente e della specie di seme, in modo da raggiungere le
condizioni ottimali per la germinazione. Se il materiale confettante
aderisce ai cotiledoni al momento del conteggio, si deve spruzzare
cautamente dell'acqua per allontanarlo.
A causa del materiale ricoprente puo' essere necessaria una durata
del periodo d'analisi superiore a quella prescritta nelle colonne 6 e
7 delle tabelle dell'Allegato II. In tal caso di procede come
indicato alla sezione 5.5.3.
11.6.3. Valutazione dei germinelli
La distinzione dei germinelli in normali ed anormali deve essere
fatta secondo le indicazioni della sezione 5.5.4. Le anomalie possono
essere dovute anche al materiale confettante. Qualora ci fosse questo
sospetto e la prova fosse stata fatta in carta, si deve fare un'altra
prova in sabbia.
Strutture a semi multipli possono essere inglobate nei confetti o
nei nastri, o piu' di un seme in un confetto. In ogni caso queste
vanno considerate come un solo seme e come germinate se producono
almeno un germinello normale della specie indicata. I confetti o i
semi in nastri che producono due o piu' di tali germinelli devono
essere annotati. Se e' richiesto, il grado di germia dei confetti che
hanno prodotto uno, due o piu' germinelli normali, viene espresso
come percentuale del numero totale dei confetti che hanno dato almeno
un germinello normale.
I confetti o i semi in nastro che hanno prodotto germinelli
chiaramente non appartenenti alla specie indicata non devono essere
considerati germinati. Il loro numero pero' deve essere riportato sul
certificato.
11.6.4. Calcolo ed espressione del risultato
Il risultato dell'analisi e' espresso come media delle percentuali
in numero di confetti o di semi in nastri con germinelli normali,
germinelli anormali o senza germinelli delle quattro repliche, previa
verifica dell'attendibilita' della prova secondo le indicazioni della
sezione 5.6.1., e viene riportato sul certificato unitamente
all'indicazione del metodo usato e della durata dell'analisi. In
aggiunta, per il seme in nastri, si deve calcolare e riportare sul
certificato il numero di germinelli normali per metro di nastro o per
metro quadrato di tappeto o tovaglia.
Il risultato di una analisi di germinazione dei semi rimossi dai
confetti o dai nastri va riportato sotto "altre determinazioni".
11.7. Determinazione del peso e del calibro dei confetti
A causa delle esigenze tecniche della semina di precisione, puo'
essere necessaria la determinazione del peso e del calibro dei
confetti.
La determinazione del peso deve essere fatta con confetti presi
dalla frazione del seme puro dell'analisi di purezza (sez. 11.4.1.a)
e fatta secondo le prescrizioni del capitolo 9.
La calibratura deve essere fatta secondo le prescrizioni del
capitolo 12, fatta eccezione per il campione di analisi che non deve
contenere un numero di confetti inferiore a quello indicato nella
colonna 3 della tabella 8 e che deve essere pesato prima della
vagliatura. I risultati sono espressi come percentuale del peso
totale dei confetti del campione di analisi.
11.8. Prescrizioni particolari per il certificato di analisi
Sul certificato di analisi per semi rivestiti deve essere
chiaramente riportata, possibilmente a fianco della voce "Risultati
d'analisi" la dicitura SEME CONFETTATO, SEME INCROSTATO, SEME IN
GRANULI, SEME IN NASTRI, SEME IN TAPPETI o SEME IN TOVAGLIE.
12 - CALIBRATURA DEI SEMI
Le seguenti norme sono applicabili esclusivamente ai semi di Beta
spp. ed ai semi confettati.
Il controllo del calibro e' fatto su un campione di almeno 250 g
che deve essere inviato al laboratorio in un contenitore di materiale
impermeabile.
L'analisi deve essere fatta su due campioni di analisi di circa 50
g ciascuno, comunque non meno di 45 g e non piu' di 55 g.
I due campioni di analisi vengono sottoposti separatamente ad una
vagliatura.
Devono essere usati i seguenti vagli a fori rotondi:
- uno con fori di 0,25 mm di diametro inferiore al valore nominale
piu' basso delle dimensioni del seme;
- una serie di setacci con intervallo di calibro di 0,25 mm;
- un setaccio con fori di 0,25 mm di diametro superiore al valore
nominale maggiore delle dimensioni del seme.
L'ampiezza di oscillazione dei vagli deve essere compresa fra 45 e
50 mm.
La durata della vagliatura deve essere di un minuto per i semi
confettati e di 3 minuti per quelli non confettati.
Le frazioni ottenute dalla vagliatura, compresa quella che passa
attraverso il setaccio inferiore, sono pesate ed il peso e' indicato
con due cifre decimali.
I pesi delle frazioni sono espressi come percentuali, ad una cifra
decimale, del peso totale. La media dei valori ottenuti dai due
campioni di analisi rappresenta il risultato finale purche' la
differenza tra le percentuali rispetto alla media, non superi l'1,5%.
Se tale limite e' superato deve essere analizzato un altro campione
di 50 g e, se necessario, anche un quarto.
In ogni caso si deve riportare sul certificato di analisi la media
di due calibrature che rientrino nei limiti di tolleranza ammessi.
13 - DETERMINAZIONE DELLO STATO
SANITARIO DELLE SEMENTI
13.1. Scopo
Scopo dell'analisi sanitaria delle sementi e' la determinazione
dello stato sanitario di un campione rappresentativo del lotto cui si
riferisce, al fine di contribuire alla valutazione agronomica e
commerciale del lotto stesso.
L'analisi sanitaria e' importante per le seguenti ragioni:
1. l'inoculo portato dal seme puo' causare malattie in campo e
ridurre il valore commerciale della coltura;
2. lotti di semente importati possono introdurre malattie in nuove
aree. Possono pertanto essere necessarie analisi per ottemperare alle
norme di quarantena;
3. l'analisi sanitaria della semente puo' fornire informazioni
sull'andamento delle prime fasi di sviluppo delle plantule,
integrando i risultati ottenuti nelle prove di germinazione.
13.2. Definizioni
13.2.1. STATO SANITARIO: lo stato sanitario del seme riguarda
principalmente la presenza o assenza di organismi patogeni quali
funghi, batteri, virus e di animali comunque dannosi (nematodi,
insetti). In qualche caso puo' riguardare anche disturbi di carattere
fisiologico del seme quali le carenze di microelementi.
13.2.2. INCUBAZIONE: e' il mantenimento del seme in condizioni
favorevoli allo sviluppo di patogeni o di sintomi.
13.2.3. PRETRATTAMENTO: viene cosi' definito qualsiasi trattamento
chimico o fisico del campione di analisi, applicato prima
dell'incubazione allo scopo di semplificare o comunque migliorare le
procedure analitiche.
13.2.4. TRATTAMENTO: e' considerato trattamento ogni intervento
fisico o chimico cui sia stato sottoposto il lotto di semente.
13.3. Principio
Nell'analisi sanitaria delle sementi viene determinata la presenza
o assenza di patogeni o altri organismi nocivi, nonche' di anomale
condizioni fisiologiche. Il numero di semi del campione, interessati
da ciascuno dei citati aspetti negativi, viene stimato con la
precisione permessa dal metodo applicato.
Le determinazioni possono essere influenzate dai trattamenti subiti
dal lotto. E' pertanto importante che sia indicato se il seme e'
stato trattato e con quali modalita', prodotti e relativa classe di
tossicita'.
13.4. Esecuzione delle analisi
13.4.1. Campione di analisi
Quando non sia diversamente richiesto, il campione di analisi deve
essere costituito da almeno 400 semi puri presi dal campione medio di
prelevamento (sez. 1.2.1.c.).
13.4.2. Indicazioni generali
Importante fonte di informazioni sulle malattie trasmissibili per
seme e' costituita dal Manuale sull'analisi sanitaria delle sementi
dell'ISTA (ISTA Handbook on Seed Health Testing), con particolare
riguardo alla Sez. 1.1.
Ulteriori utili riferimenti sono reperibili in: Richardson, M.J.
(1990). An annotated list of seed borne diseases, ISTA.
E' raccomandabile, ai fini dell'uniformita' nell'applicazione dei
metodi e nel rilevamento dei risultati, che gli operatori i quali
dovranno applicare un metodo, lo apprendano per pratica diretta
accanto ad esperti dei vari settori.
Per l'esecuzione delle analisi si adottano metodi basati sull'esame
dei semi senza incubazione o dopo incubazione e sull'esame delle
plantule con tecniche particolari. La scelta del metodo dipende dal
tipo di patogeno, dalle condizioni in cui si opera, dalla specie di
seme in esame e dallo scopo dell'analisi.
a) Esame senza incubazione
Queste prove non danno alcuna indicazione sulla vitalita' del
patogeno:
1) Esame del seme secco
Viene esaminato il campione medio di prelevamento o un suo
sottocampione, con o senza microscopio stereoscopico, per ricercare
sclerozi del genere CLAVICEPS o altri sclerozi, galle di nematodi,
sori di carboni, insetti, acari, segni evidenti di malattie e di
danni da insetti sui semi o su materiali inerti, come anche corpi
fruttiferi di microrganismi, alterazioni di colore e qualsiasi altro
danno.
2) Esame di semi imbibiti
Il campione di analisi viene immerso in acqua o in altro liquido
per rendere piu' facilmente visibili corpi fruttiferi, sintomi di
alterazioni o parassiti animali, oppure per facilitare la liberazione
delle spore. Dopo l'imbibizione i semi vengono esaminati esternamente
o internamente, preferibilmente al microscopio stereoscopico.
3) Esame di organismi rimossi mediante lavaggio
Il campione di analisi viene immerso in acqua con aggiunta di un
bagnante, oppure in alcool, agitato energicamente per rimuovere spore
fungine, ife, nematodi, ecc., presenti nella semente o aderenti al
seme. Il liquido in eccesso viene quindi eliminato mediante
filtrazione, centrifugazione o evaporazione e il materiale estratto
viene esaminato al microscopio.
b) Esame dopo incubazione
Dopo un determinato periodo di incubazione il campione di analisi
viene esaminato per rilevare la presenza di microrganismi patogeni o
sintomi di malattia, parassiti animali e alterazioni di carattere
fisiologico nei semi o nei germinelli. Comunemente vengono usati due
tipi di substrati:
1) Substrati di carta umida (vedi sez. 13.4.3.) nei casi in cui si
deve osservare lo sviluppo di microrganismi patogeni o quando si
devono esaminare le plantule. I semi, con o senza pretrattamento,
vengono disposti sulla carta e distanziati in modo da evitare la
diffusione per contatto di saprofiti. Quando e' necessario si
applicano particolari condizioni di luce atte a stimolare la
sporificazione dei funghi. In alcuni casi puo' essere utile inibire
la germinazione con sostanze chimiche o con altri mezzi. Alcuni
patogeni possono essere identificati senza ingrandimento, ma il piu'
delle volte e' necessario lo stereomicroscopio o il microscopio
composto per l'identificazione delle spore fungine.
2) Substrati agarizzati, quando e' necessario per l'identificazione
dei microrganismi che si sviluppano dai semi. In questo caso si deve
operare in condizioni di sterilita'. I semi, di solito dopo
pretrattamento, sono deposti sulla superficie dell'agar sterilizzato
e incubati. E' possibile identificare le colonie che si sviluppano
sull'agar dalle loro caratteristiche, con l'osservazione macroscopica
o microscopica. Spesso puo' essere utile l'azione della luce durante
l'incubazione; inoltre, possono essere usati inibitori della
germinazione del seme.
c) Esame delle plantule
In alcuni casi l'osservazione di determinati sintomi sulle plantule
e' il metodo piu' pratico per determinare la presenza di batteri,
funghi o virus nel campione di semi. Allo scopo, si puo' o seminare
semi del campione in prova, oppure usare l'inoculo ottenuto dai semi
del campione per effettuare prove di infezione artificiale su
plantule sane o su parti di piante sane. In questo caso le piante
devono essere protette da possibili infezioni provenienti
dall'esterno e puo' essere necessario operare in condizioni
accuratamente controllate.
d) Altre tecniche
Per alcuni particolari agenti patogeni (batteri, virus) vengono
adottati appositi metodi specifici come reazioni sierologiche, od
altro.
Per stimolare la sporificazione e favorire l'identificazione si
raccomanda l'uso di luce alternata durante l'incubazione, con periodi
di 12 ore di buio e 12 ore di esposizione a luce NUV (luce
ultravioletta ottenibile da lampade fluorescenti a "luce nera" con
picco a 360 nm). Possono dare risultati soddisfacenti anche tubi
fluorescenti a luce diurna.
13.4.3. Indicazioni specifiche
Nella presente Sezione vengono descritte le metodiche di analisi
gia' standardizzate per la ricerca di alcuni patogeni per le specie
di semi o gruppi di specie. Per altre metodiche, relative a specie o
patogeni non riportati nel presente elenco, si rimanda ai metodi
internazionali di analisi delle sementi.
I metodi messi a punto nelle indicazioni specifiche non sono, di
norma, idonei per semi conciati; fanno eccezione i metodi per
USTILAGO NUDA.
Quando non e' diversamente stabilito, il pretrattamento con
ipoclorito di sodio consiste nell'immersione dei semi per 10 minuti
in una soluzione di ipoclorito di sodio all'1% di cloro attivo, e
successiva decantazione del liquido.
Qualora non sia diversamente previsto, il substrato da impiegare
per il metodo su carta dovra' essere costituito da uno o piu' dischi
di carta da filtro o di carta bibula esente da sostanze tossiche e da
microrganismi contaminanti per i patogeni oggetto di ricerca. Le
caratteristiche del substrato dovranno essere tali da garantire un
apporto di almeno 3,4 g di acqua per capsula Petri di 9 cm di
diametro dopo imbibizione per immersione e successivo sgocciolamento
per gravita'. Per tutta la durata della prova, la carta dovra'
apparire umida, ma esente da velo liquido apprezzabile ad occhio nudo
sulla sua superficie. Per mantenere tali condizioni potra' rendersi
necessaria l'aggiunta periodica di acqua.
Per il metodo su carta umida e substrati agarizzati si usa acqua
distillata o deionizzata.
Quando viene indicato il numero di semi da porre in una capsula
Petri, ci si riferisce ad una capsula di 9 cm di diametro.
Qualora i semi debbano essere esaminati piu' di una volta, si
dovra' indicare, nei risultati, soltanto la percentuale di infezione
totale.
13.4.3.1. Compositae
A) BOTRYTIS CINEREA Pers. ex Pers. su HELIANTHUS ANNUUS.
CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
SUBSTRATO: carta da filtro Whatman n. 1.
METODO: preparare 80 capsule Petri e porre in ciascuna di esse due
dischi di carta da filtro, aggiungere 5 ml di una soluzione al 3% di
estratto di malto. Togliere il liquido in eccesso e porre 5 semi in
ciascuna capsula.
INCUBAZIONE: 9 giorni a 20C al buio.
ESAME: dopo 5, 7 e 9 giorni esaminare i semi ad occhio nudo per
osservare le radichette che presentano marciume molle e sono coperte
da micelio grigio, abbondante. Nei casi dubbi puo' essere utile
esaminare il micelio a un ingrandimento di 200 x per osservare le ife
settate, nastriformi e i conidiofori ramificati.
B) Virus del mosaico della lattuga su LACTUCA SATIVA:
a) ESAME DELLE PLANTULE
CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
SUBSTRATO: terreno torboso con aggiunta di una adeguata quantita'
di elementi nutritivi per ottenere uno sviluppo soddisfacente delle
plantule.
METODO: i semi vengono seminati ad una distanza di almeno 2,5 cm
uno dall'altro e ricoperti con uno strato di terra di circa 1 mm.
INCUBAZIONE: 5 giorni a 5-10C al buio, e successivamente per 13-19
giorni a 20C a luce continua. Il numero di giorni necessario per
ottenere lo sviluppo di almeno 3 foglie varia a seconda della
varieta'. Come sorgente di luce si usano lampade fluorescenti, alter-
nate nello spazio, rispettivamente con emissione di luce rossa
(699-700 nm) e luce blu (400-510 nm). Sono sufficienti 8 tubi tipo
Sylvania "Gro Lux" da 40 watt per ogni 0,6 m2: 120 x 50 cm), da
collocarsi ad una distanza di circa 30 cm dalla superficie del
substrato.
ESAME: contare le piantine che presentano a vista sintomi di
mosaico sulle prime 3 foglie vere. L'osservazione dei sintomi puo'
essere facilitata esaminando le piantine per trasparenza, tenendole
sollevate verso una sorgente di luce diffusa.
b) Metodo su: CHENOPODIUM QUINOA
CRESCITA DELLE PIANTE: si seminano in terreno i semi di C. QUINOA.
Successivamente si trapiantano le singole piante, allo stadio di
sviluppo dei cotiledoni o di 2 foglie, in vasi di 10 cm di diametro
contenenti terra. Le piante cosi' preparate sono tenute a temperatura
da 18C a 20C, con esposizione a luce artificiale (cicli di 16 ore
di luce e 8 ore di buio).
Se non e' possibile ottenere queste condizioni le piante, dopo la
crescita a luce continua, dovrebbero essere poste al buio per 24 ore
prima delle inoculazioni. Le piante sono pronte quando si sono
sviluppate da 4 a 6 foglie. Non si devono usare piante con fiori.
PREPARAZIONE DELL'INOCULO: prelevare 10 campioni di semi di
lattuga, ciascuno costituito da 700 semi; frantumare i semi di ogni
campione in 5 ml di una soluzione tampone a pH 7 di (Na2HPO4 . 12H2O)
0,03 M, con aggiunta di una soluzione allo 0,2% di dietil-
ditiocarbammato di sodio (C5H10NNaS2 . 3 H2O) e una soluzione allo
0,5% di NaHSO3. Aggiungere 375 mg di carbone attivato e usare
l'impasto, come inoculo, entro 10 minuti dalla preparazione.
INOCULAZIONE: l'inoculo preparato da ciascun campione di semi di
lattuga viene usato per inoculare le foglie di C. QUINOA dopo aver
livemente cosparso la superficie fogliare con carborundum. Per ogni
campione inoculare 3 foglie giovani di 3 piante. Dopo l'inoculazione
le foglie vengono risciacquate leggermente con acqua di rubinetto.
Le piante devono quindi essere coperte con buste di plastica per 24
ore per mantenere le foglie inoculate in condizioni di elevata
umidita'.
INCUBAZIONE: le piante inoculate devono essere poste in serra o
preferibilmente in una camera di crescita a 25C con esposizione a
luce artificiale (cicli di 16 ore di luce e 8 ore di buio), oppure a
luce continua, per un periodo da 5 a 14 giorni.
ESAME: le piante vengono esaminate dopo un periodo che va da 6 a
20 giorni per rilevare i sintomi che possono comparire sulle
foglie inoculate, come macchie clorotiche localizzate e, sulle foglie
apicali come macchie sistemiche di mosaico. I sintomi sono di facile
rilevamento a vista.
13.4.3.2. Coniferae
FUSARIUM MONILIFORME var. SUBGLUTINANS Wollenw. et Reink. su PINUS
TAEDA e P. ELLIOTTII
CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi
SUBSTRATO: carta bibula blu in scatole di plastica (133x133x32 mm)
con coperchio trasparente.
METODO: mettere i semi sulla carta disposta nei contenitori,
adagiando in ciascuno di questi 25 semi egualmente distanziati tra
loro. Schiacciare i semi con una lastrina di plastica sterilizzata,
di dimensioni adeguate ad essere contenuta nell'interno delle
scatole. Irrorare quindi semi e carta con una soluzione cosi'
preparata:
15 g di peptone, 5 g di Mg SO4 . 7 H2O, 1 g KH2PO4, 1 g di polvere
bagnabile al 75% di PCNB (pentacloronitrobenzene), sono disciolti
accuratamente in un litro di acqua distillata. La soluzione viene
quindi sterilizzata in autoclave (120C, 15 min), e lasciata
raffreddare a temperatura ambiente. Vengono quindi aggiunti 1 g di
solfato di streptomicina e 0,12 g di solfato di neomicina.
Le piastre vengono quindi coperte ed incubate.
INCUBAZIONE: 10-16 giorni a 20C sotto luce fluorescente alternata
al buio sino a quando le colonie raggiungono il diametro di circa 2
cm.
ESAME: osservare ogni colonia al microscopio (100-400
ingrandimenti) per ricercare i polifialidi, microconidi e macroconidi
caratteristici del fungo. Le colonie con microconidi catenulati o
piriformi, o con clamidospore, non saranno conteggiate, anche se in
esse sono presenti polifialidi.
13.4.3.3. Cruciferae
A) LEPTOSPHAERIA MACULANS (Desm.) Ces. et de Not., stato
imperfetto: PHOMA LINGAM (Tode ex Fr.) Desm. su CRUCIFERAE.
CAMPIONE DI LAVORO: 1000 semi.
SUBSTRATO: carta da filtro (Whatman n. 1).
METODO: porre 3 dischi di carta da filtro in ogni capsula Petri e
aggiungere 5 ml di una soluzione allo 0,2% del sale di sodio
dell'acido 2-4 dicloro-fenossiacetico per inibire la germinazione del
seme. Togliere l'eccesso della soluzione di (2-4D), lavare i semi in
acqua sterile e porre 50 di essi in ciascuna capsula.
INCUBAZIONE: 11 giorni a 20C con cicli alternati di 12 ore di luce
e 12 ore di buio.
ESAME: dopo 6 giorni esaminare ad ingrandimento di 25 x per
osservare la crescita di micelio bianco-argento, aereo e i primordi
dei picnidi di PHOMA LINGAM sul seme e sul substrato. Dopo 11 giorni
fare un secondo esame per osservare i picnidi sui semi infetti e
sulla carta da filtro vicino ai semi infetti. Sono conteggiati come
infetti i semi dai quali si sono sviluppati picnidi di P. LINGAM.
B) ALTERNARIA BRASSICICOLA (Schw.) Wilts. su BRASSICA spp.
a) CAMPIONE DI LAVORO: 1000 semi.
SUBSTRATO: carta.
METODO: porre i dischi di carta in ogni capsula Petri, dopo rapida
immersione in un recipiente contenente acqua. Togliere l'eccesso di
acqua e porre 50 semi in ciascuna capsula.
INCUBAZIONE: 6 giorni a 18-20C con esposizione a luce NUV, cicli
di 12 ore di luce e 12 ore di buio.
ESAME: individuare la presenza di macchie scure allungate sui
cotiledoni e sull'ipocotile e, conidi di colore da verde oliva a
bruno scuro, disposti in catene e provvisti di rostro corto, non ben
visibile. La misura dei conidi e' di 18-120 x 8-20 m. I setti
verticali sono meno frequenti che in A. BRASSICAE e i conidi di
colore piu' scuro. Il corpo del conidio e' molto piu' lungo di quello
di A. TENUIS.
b) CAMPIONE DI LAVORO: 1000 semi.
PRETRATTAMENTO: ipoclorito di sodio.
SUBSTRATO: agar malto.
METODO: deporre 25 semi sulla superficie dell'agar in ciascuna
capsula Petri.
INCUBAZIONE: 5 giorni a 18-20C preferibilmente con esposizione a
luce NUV, cicli di 12 ore di luce e 12 ore di buio.
ESAME: ricercare le colonie con micelio aereo di colore verde oliva
chiaro, aspetto vellutato, con fruttificazioni conidiche disposte a
cerchi concentrici.
C) ALTERNARIA BRASSICAE (Berk.) Sacc. su BRASSICA spp.
a) CAMPIONE DI LAVORO: 1000 semi.
SUBSTRATO: carta.
METODO: porre i dischi di carta in ogni capsula Petri, dopo rapida
immersione in un recipiente contenente acqua. Togliere l'eccesso di
acqua e porre 50 semi in ciascuna capsula.
INCUBAZIONE: 6 giorni a 18-20C con esposizione a luce NUV, cicli
di 12 ore di luce e 12 ore di buio.
ESAME: individuare la presenza di macchie scure e strisce sui
cotiledoni e sull'ipocotile, non cosi' scure come in A.
BRASSICICOLA. Conidi di colore da verde oliva chiaro a bruno, con
setti longitudinali e trasversali, provvisti di rostro. I conidi
misurano 75-350 x 20-30 m. Il rostro e' lungo da 1/3 a 1/2 della
lunghezza totale del conidio.
b) CAMPIONE DI LAVORO: 1000 semi.
PRETRATTAMENTO: ipoclorico di sodio.
SUBSTRATO: agar malto.
METODO: deporre 25 semi sulla superficie dell'agar in ciascuna
capsula Petri.
INCUBAZIONE: 5 giorni a 18-20C preferibilmente con esposizione a
luce NUV, cicli di 12 ore di luce e 12 ore di buio.
ESAME: ricercare le colonie con micelio aereo cotonoso, di colore
bianco o rosa, con zone di fruttificazione conidiche disposte a
cerchi, di colore da verde chiaro a verde oliva scuro. Il micelio
sommerso non colorato o di colore verde scuro, presenta crescita
radiale o ondulata. La fruttificazione conidica e' abbondante.
13.4.3.4. Graminaceae
A) LEPTOSPHAERIA NODORUM Muller, stato imperfetto: SEPTORIA NODORUM
Berk. su TRITICUM AESTIVUM:
a) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
SUBSTRATO: carta.
METODO: porre i dischi di carta in ogni capsula Petri, dopo rapida
immersione in un recipiente contenente acqua. Togliere l'eccesso di
acqua e porre 25 semi in ciascuna capsula.
INCUBAZIONE: 14 giorni a 10C al buio.
ESAME: individuare la presenza di macchie brune sul coleoptile, con
o senza attorcigliamento del germinello. Il coleoptile appare spesso
accorciato e piccole protuberanze scure possono essere presenti sul
germinello, specie se l'umidita' e' scarsa. In condizioni di umidita'
elevata, dopo 2 giorni, si sviluppano sul coleoptile i picnidi di S.
NODORUM. Se il periodo di incubazione e' piu' breve e la temperatura
piu' elevata, le protuberanze sono meno evidenti.
b) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
PRETRATTAMENTO: ipoclorito di sodio.
SUBSTRATO: agar malto o agar patate-destrosio, contenente 100 mg/1
di solfato di streptomicina.
METODO: deporre 10 semi sulla superficie dell'agar in ciascuna
capsula Petri.
INCUBAZIONE: 7 giorni a 22C al buio.
ESAME: ricercare le colonie rotonde, a crescita lenta, finemente
lanose, con micelio aereo bianco che spesso ricopre il seme. Il retro
della colonia e' di colore giallo, giallo scuro, tendente al colore
oliva, molto variabile. I picnidi difficilmente si sviluppano durante
il periodo della prova.
B) MONOGRAPHELLA NIVALIS (Schaffn.) Muller sin. MICRONECTRIELLA
NIVALIS (Schaffn.) Booth, stato imperfetto: GERLACHIA NIVALIS (Ces.ex
Sacc.) Gams et Muller, sin. FUSARIUM NIVALE (Fr.) Ces., su TRITICUM
AESTIVUM:
a) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
SUBSTRATO: carta.
METODO: porre i dischi in ogni capsula Petri, dopo averli
rapidamente immersi in un recipiente contenente acqua. Togliere
l'eccesso di acqua e porre 25 semi in ciascuna capsula.
INCUBAZIONE: 14 giorni a 8-10C al buio.
ESAME: esaminare ogni seme per reperire il caratteristico micelio
poco abbondante, accompagnato da masse conidiche di colore rosa-
arancio. Piccole masse conidiche sparse possono apparire su un seme e
sulla carta in prossimita' di questo. Sui semi germinati si puo'
osservare una colorazione scura del coleoptile, diffusa o ristretta
in piccole zone. Le radici sono imbrunite alla base.
b) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
PRETRATTAMENTO: ipoclorito di sodio.
SUBSTRATO: agar patate-destrosio.
METODO: deporre 10 semi sulla superficie dell'agar in ciascuna
capsula Petri.
INCUBAZIONE: 8 giorni a 22C a luce diurna o fluorescente, oppure
al buio.
ESAME: ricercare le colonie a crescita rapida, di colore da bianco
a rosa pallido, con formazione di cordoni o filamenti miceliali. Con
esposizione alla luce si producono, durante la prova, conidi ialini,
1-3 settati, curvi, 10-30 x 2,5-5 m.
C) USTILAGO NUDA (Ojens.) Rostr. su HORDEUM VULGARE:
a) CAMPIONE DI LAVORO: 2 ripetizioni di 100-120 g di semi che
contengono, in relazione al peso dei 1000 semi, da 2000 a 4000 semi.
METODO: porre il campione di lavoro in 1 litro di una soluzione
acquosa al 5% di idrato di sodio (NaOH), preparata di fresco.
Mantenere in immersione a 20C per 24 ore.
Trascorso questo tempo trasferire l'intero campione in un adatto
contenitore e lavare i semi in acqua tiepida per separare gli
embrioni che fuoriescono dai pericarpi ammorbiditi. Raccogliere gli
embrioni in un setaccio con fori di 1 mm. Se necessario, si possono
usare setacci con fori piu' grandi per separare i pezzi di endosperma
e la pula. Trasferire gli embrioni in una miscela in parti uguali di
lattofenolo (un terzo di glicerolo, un terzo di fenolo e un terzo di
acido lattico) e acqua, nella quale si potra' fare l'ulteriore
separazione di embrioni e pula.
Trasferire gli embrioni in un becker contenente lattofenolo privo
di acqua e rischiararli mantenendo il lattofenolo al punto di
ebollizione per circa 30 secondi sotto cappa.
Trasferire gli embrioni in glicerina, leggermente tiepida, per
l'esame.
ESAME: esaminare 1000 embrioni per ciascuna replicazione con
ingrandimento di 16-25 x e con adeguato apparecchio di illuminazione
per osservare il micelio caratteristico di colore bruno chiaro di
USTILAGO NUDA.
b) CAMPIONE DI LAVORO: 2 ripetizioni di 100-120 g di semi che
contengono, in relazione al peso dei 1000 semi, da 2000 a 4000 semi.
METODO: porre il campione di lavoro in un litro di una soluzione
acquosa al 5% di idrato di sodio (NaOH) preparata di fresco alla
quale sia stato aggiunto 1,5/l di blu di tripano (trypan blu).
Mantenere in immersione a 20C per 2 ore.
Trascorso questo tempo, trasferire l'intero campione in un adatto
contenitore e lavorare i semi in acqua tiepida per separare gli
embrioni che fuoriescono dai pericarpi ammorbiditi. Raccogliere gli
embrioni in un setaccio con fori di 1 mm. Se necessario, si possono
usare setacci con fori piu' grandi per separare i pezzi di endosperma
e la pula. Gli embrioni vengono riuniti in un adatto contenitore (es:
colino metallico) con maglie uguali o inferiori ad un mm e vengono
immersi per 2 minuti in alcol etilico, scolati, quindi trasferiti in
una miscela di acido lattico, glicerina ed acqua (1:2:1 in volume)
nella quale si potra' fare l'ulteriore separazione di embrioni e pula
utilizzando un imbuto di vetro collegato a un tubo di gomma lungo
circa 10 cm, chiudibile con pinze di Mohr.
Trasferire gli embrioni in un becker contenente una miscela (1:2)
di acido lattico e glicerina, portata all'ebollizione e mantenerla
per circa 2 minuti, trasferire in glicerina leggermente tiepida per
l'esame.
ESAME: come per il metodo descritto al precedente punta a).
D) PYRENOPHORA GRAMINEA Ito et Kuribay., stato imperfetto:
DRECHSLERA GRAMINEA (Rabenh. ex Schlecht.) Shoemaker, su HORDEUM
VULGARE:
a) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
SUBSTRATO: carta.
METODO: porre i dischi di carta in ogni capsula Petri, dopo rapida
immersione in un recipiente contenente acqua. Togliere l'eccesso di
acqua e porre 25 semi in ciascuna capsula.
INCUBAZIONE: 8 giorni a 20C alla luce NUV, cicli di 12 ore di luce
e 12 ore di buio, oppure 12 ore a 20C alla luce (NUV o diurna) e 12
ore a 5-10C al buio.
ESAME: ricercare i conidiofori corti, di colore bruno scuro. Conidi
piu' scuri dei conidiofori, 50-80 x 14-20 m, prevalentemente in
catene di 2-3 conidi. In condizioni di elevata umidita' si possono
formare catene di 5-6 conidi.
b) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
PRETRATTAMENTO: ipoclorito di sodio.
SUBSTRATO: agar patate-destrosio o agar malto.
METODO: deporre 10 semi sulla superficie dell'agar in ciascuna
capsula Petri.
INCUBAZIONE: 8 giorni a 22C alla luce NUV, cicli di 12 ore di luce
e 12 ore di buio.
ESAME: ricercare le colonie di colore grigio o verde oliva scuro,
con sfumature di colore arancio, di solito senza produzione di
conidi. Qualche volta si formano picnidi sul seme.
E) PYRICULARIA ORYZAE Cav. su ORYZA SATIVA:
CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
SUBSTRATO: carta.
METODO: porre i dischi di carta in ogni capsula Petri, dopo rapida
immersione in un recipiente contenente acqua. Togliere l'eccesso di
acqua e porre 25 semi in ciascuna capsula.
INCUBAZIONE: a) 7 giorni a 20C preferibilmente alla luce NUV,
cicli di 12 ore di luce e 12 ore di buio; b) 1 giorno a 20C, 1
giorno a -20C e 5 giorni a 20oC preferibilmente alla luce NUV, cicli
di 12 ore di luce e 12 ore di buio.
ESAME: esaminare i semi allo stereomicroscopio, 12-50 x.
Generalmente il fungo produce colonie piccole, di colore grigio,
localizzate sulle glume. I conidiofori sono corti, delicati e portano
un grappolo di conidi all'apice. Raramente lo sviluppo del fungo
riesce a coprire l'intero seme. Nei casi dubbi e' necessario
osservare i conidi a piu' forte ingrandimento (200-400 x): essi
appaiono tipicamente piriformi, ialini, con la base troncata e
provvista di un piccolo dente, 2-settati, di solito con apice
appuntito 20-25 x 9-12 m.
F) COCHLIOBOLUS MIYABEANUS (Ito e Kuribay.) Drechsl. ex Dastur,
stato imperfetto: DRECHSLERA ORYZAE (van Breda de Haan) Subramanian
et Jain su ORYZA SATIVA:
a) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
SUBSTRATO: carta.
METODO: porre i dischi di carta in ogni capsula Petri, dopo rapida
immersione in un recipiente contenente acqua. Togliere l'eccesso di
acqua e porre 25 semi in ciascuna capsula.
INCUBAZIONE: 7 giorni a 22C alla luce NUV, cicli di 12 ore di luce
e 12 ore di buio.
ESAME: ricercare i conidiofori prodotti non solamente sul tegumento
del seme ma anche su micelio aereo, di colore grigio, che ricopre
tutto o una parte del seme. Il fungo puo' invadere la carta. Nei casi
dubbi, la conferma si puo' avere osservando i conidi a maggiore
ingrandimento (200 x). I conidi, di colore da giallo a bruno chiaro,
di solito curvi, piu' larghi nella parte mediana e progressivamente
assottigliati verso gli apici arrotondati, misurano 35-170 x 11-17 m.
Si puo' osservare, a volte, anche marciume dei germinelli.
b) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
PRETRATTAMENTO: ipoclorito di sodio.
SUBSTRATO: agar patate-destrosio.
METODO: deporre 10 semi sulla superficie dell'agar in ciascuna
capsula Petri.
INCUBAZIONE: 7 giorni a 22C alla luce NUV, cicli di 12 ore di luce
e 12 ore di buio.
ESAME: ricercare le colonie di colore bruno scuro, a crescita
rapida, con margini regolarmente circolari e produzione di poco
micelio aereo di colore bianco o grigio. Rapida fruttificazione
conidica.
13.4.3.5. Leguminosae
A) ASCOCHYTA PISI Lib. su PISUM SATIVUM:
CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
PRETRATTAMENTO: ipoclorito di sodio.
SUBSTRATO: agar malto o agar patate-destrosio.
METODO: deporre 10 semi sulla superficie dell'agar in ciascuna
capsula Petri.
INCUBAZIONE: 7 giorni a 20C al buio.
ESAME: dopo 7 giorni esaminare ogni seme ad occhio nudo per
osservare l'abbondante micelio bianco che spesso ricopre i semi
infetti. L'identificazione delle colonie fungine in dubbio potra'
essere confermata dalla presenza di ife ondulate nella parte aerea
della colonia, quando osservate con ingrandimento di 25 x.
B) COLLETOTRICHUM LINDEMUTHIANUM (Sacc. et Magn.) Bri. et Cav. su
PHASEOLUS VULGARIS:
CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
PRETRATTAMENTO: ipoclorito di sodio.
SUBSTRATO: carta in fogli di almeno 35 x 45 cm.
METODO: distribuire i semi in replicazioni di 50 su due fogli di
carta, che e' stata prima bagnata in acqua. Coprire i semi con un
altro foglio dello stesso tipo di carta bagnata in acqua. Ripiegare
la carta due volte nel senso della lunghezza e coprire con un foglio
di polietilene per mantenere l'umidita' durante l'incubazione.
INCUBAZIONE: 7 giorni a 20C al buio.
ESAME: dopo 7 giorni rimuovere il tegumento dei semi e osservare la
presenza di macchie scure con margini ben definiti sui cotiledoni.
Per le osservazioni usare lo stereomicroscopio con ingrandimento 25 x
e conteggiare i semi che presentano acervuli con sete nere, settate.
13.4.3.6 Linaceae
A) ALTERNARIA LINICOLA Groves, et Skolko su LINUM USITATISSIMUM:
CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
PRETRATTAMENTO: nessuno.
SUBSTRATO: carta.
METODO: porre i dischi di carta in ogni capsula Petri, dopo averli
rapidamente immersi in un recipiente contenente acqua sterile.
Togliere l'eccesso di acqua e porre 25 semi in ciascuna capsula
Petri.
INCUBAZIONE: 6-8 giorni a 20C con esposizione a luce NUV, cicli di
12 ore di luce e 12 ore di buio.
ESAME: l'osservazione delle fruttificazioni sviluppatesi sui semi
va effettuata allo stereomicroscopio, (12-40 x), talvolta su
cotiledoni ed ipocotili si formano lesioni scure. Nella parte
terminale dei conidiofori, di colore scuro, si inserisce un solo
conidio (150-300 x 17-24 m) caratterizzato da un lungo rostro;
quest'ultimo carattere e l'assenza di catenelle di conidi differenzia
questo micete da altre specie di ALTERNARIA.
B) BOTRYTIS CINEREA Pers. su LINUM USITATISSIMUM:
CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
SUBSTRATO: agar malto al 2% di agar e 1% di estratto di malto.
METODO: deporre 10 semi sulla superficie dell'agar in ciascuna
capsula Petri.
INCUBAZIONE: 7 giorni a 20C al buio.
ESAME: dopo 5 e 7 giorni osservare le radichette affette da
marciume molle e coperte da abbondante micelio grigio. Nei casi dubbi
si puo' avere conferma mediante l'osservazione con ingrandimento di
200 x, per individuare le ife settate, nastriformi e i ciuffi di
conidiofori ramificati.
13.4.3.7 Umbelliferae
A) ALTERNARIA DAUCI (Kuhn) Groves et Skolko su DAUCUS CAROTA:
a) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.