SUBSTRATO: carta.
METODO: porre i dischi di carta in ogni capsula Petri, dopo rapida
immersione in un recipiente contenente acqua. Togliere l'eccesso di
acqua e porre 25 semi in ciascuna capsula.
INCUBAZIONE: 10 giorni a 20C preferibilmente alla luce NUV, cicli
di 12 ore di luce e 12 ore di buio.
ESAME: individuare i germinelli affetti da marciume molle e la
presenza di conidi di colore da giallo a bruno chiaro, provvisti di
un lungo rostro all'apice. I conidi misurano 100-450 x 16-25 m. Il
rostro e' lungo 3 volte la lunghezza del corpo del conidio.
b) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
PRETRATTAMENTO: ipoclorito di sodio.
SUBSTRATO: agar malto.
METODO: deporre 10 semi sulla superficie dell'agar in ciascuna
capsula Petri.
INCUBAZIONE: 7 giorni a 20C al buio.
ESAME: ricercare le colonie scure con micelio aereo di colore
grigio verde e diffusione caratteristica di un pigmento bruno
nell'agar. L'esposizione alla luce NUV puo' facilitare la
fruttificazione conidica.
B) ALTERNARIA RADICINA Meier, Drechsl. et Eddy, sin. STEMPHYLIUM
RADICINUM (Meier, Drechsl. et Eddy) Neerg., su DAUCUS CAROTA:
a) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
SUBSTRATO: carta.
METODO: porre i dischi di carta in ogni capsula Petri, dopo rapida
immersione in un recipiente contenente acqua. Togliere l'eccesso di
acqua e porre 25 semi in ciascuna capsula.
INCUBAZIONE: 10 giorni a 20C preferibilmente alla luce NUV, cicli
di 12 ore di luce e 12 ore di buio.
ESAME: ricerca dei sintomi di marciume molle dei semi e dei
germinelli e presenza di conidi scuri, lucenti, a forma di botte,
provvisti di setti trasversali e longitudinali, 25-57 x 9-27 m.
b) CAMPIONE DI LAVORO: 400 semi.
PRETRATTAMENTO: ipoclorito di sodio.
SUBSTRATO: agar malto.
METODO: deporre 10 semi sulla superficie dell'agar in ciascuna
capsula Petri.
INCUBAZIONE: 7 giorni a 20C; la luce, applicata come al metodo di
cui al punto a), puo' facilitare la produzione di conidi.
ESAME: ricercare le colonie di colore grigio oliva scuro, con
abbondante micelio aereo grigio. Il margine delle colonie puo' essere
molto irregolare o circolare. La produzione di conidi puo' essere
facilitata dalla esposizione alla luce. Di solito gli isolati
producono nell'agar cristalli caratteristici, durante il periodo
della prova, che consentono di distinguere le colonie da quelle di
ALTERNARIA TENUIS.
13.5. Espressione dei risultati
I risultati vengono espressi in percentuale di semi infetti.
Nel caso del metodo 13.4.3.1. (b) il risultato verra' espresso in
numero di campioni di 700 semi infetti sui 10 saggiati.
Nel certificato deve essere anche riportata l'indicazione del
metodo usato, del pretrattamento nei casi in cui e' stato effettuato
e la quantita' di campione, o frazione, esaminata.
----> Vedere Allegati da Pag. 83 a Pag. 116 del S.O. <----
IDENTIFICAZIONE VARIETALE DELLE SEMENTI MEDIANTE ELETTROFORESI. (1)
Principio
Le proteine estratte dai semi e separate mediante elettroforesi
generano una sequenza di bande (elettroforegramma) che e' correlata
alla costituzione genetica e puo' essere considerata come "impronta
digitale" della varieta'. Tali elettroforegrammi consentono
l'identificazione di campioni di semi o di singoli semi, di
verificarne l'identita' procedendo a confronto con varieta' note o di
caratterizzare varieta' nuove.
La separazione delle proteine puo' avvenire in elettroforesi
tradizionale su gel di poliacrilammide (PAGE) sia in "nativa", cioe'
sull'estratto tal quale, sia in SDS (sodio dodecil solfato)
denaturando l'estratto, che in elettroforesi capillare (EC).
METODO STANDARD PER L'IDENTIFICAZIONE VARIETALE DI FRUMENTO E ORZO
CON ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE)
1. Introduzione e strumentazione
Le proteine solubili in alcol (gliadine del frumento e ordeine
nell'orzo) vengono estratte dai semi e separate mediante PAGE a pH
3.2, con strumenti per elettroforesi verticale dotati di generatore
di corrente (500 V).
Per conseguire una migliore precisione e ripetibilita' di analisi
si raccomanda l'adozione di sistemi automatizzati tipo Phas System.
2. Reagenti
Tutti i reagenti usati devono essere reagenti a "purezza
analitica".
Acrilammide ("purificata per elettroforesi")
Bisacrilammide ("purificata per elettroforesi")
Urea
Acido Acetico Glaciale
Solfato ferroso
Acido ascorbico
Perossido di idrogeno (o persolfato di ammonio e TEMED - NNN1 N1-
tetrametiletilendiammina)
Monotioglicerolo (o 2-mercaptoetanolo)
Pironina G (o verde metile)
Acido tricloroacetico
Etanolo
2-cloroetanolo
PAGE Blue G-90 (o PAGE Blue 83) (o qualsiasi altro reagente
equivalente al colorante "Blu di Coomassie").
2.1. Soluzioni
a) Soluzione di estrazione
per il frumento: Pironina G (o verde di metile) allo 0.05% in
2-Cloroetanolo al 25% (tenere al freddo)
per l'orzo: Pironina G (o verde di metile) allo 0.05% in
2-Cloroetanolo al 20% contenente urea (18%) e monotioglicerolo (o
2-mercaptoetanolo) (1%) (tenere al freddo o prepararlo al momento)
b) Soluzione tampone per la vasca: acido acetico glaciale (4 ml) e
glicina (0.4 g) portata a 1 litro con acqua; tenere al fresco.
c) Soluzione tampone per il gel: acido acetico glaciale (20 ml) e
glicina (1.0 g) portata a 1 l con acqua; tenere al fresco.
d) Colorante: (1) acido tricloroacetico (100g) in 1 litro di acqua,
(2) PAGE Blue G-90 (o PAGE Blue 83) (1 g) in etanolo (100 ml).
(1) Da: ISTA Rules 1985 e successivi emendamenti.
3. Procedimento
3.1 Preparazione del campione
I semi singoli vengono macinati e trasferiti in tubi da centrifuga
di polipropilene da 1.5 ml. Viene aggiunta la soluzione estraente
(0.2 ml per il frumento, 0.3 ml per l'orzo) e i tubi vengono fatti
riposare tutta la notte a temperatura ambiente. Si effettua poi una
centrifuga di questi a 18000 X (g) e il surnatante viene usato per
l'elettroforesi. Gli estratti vengono normalmente conservati a 4 oC
per 3-4 giorni.
3.2 Preparazione del gel
La cella di separazione pulita e asciutta viene assemblata secondo
le istruzioni della casa costruttrice. Il trattamento delle lastre di
vetro con silicone prima dell'assemblaggio puo' facilitare la
successiva rimozione del gel. Le vaschette del gel possono avere un
supporto in plastica (e.g. "Gel Bond PAG", FMC Corporation). Questa
struttura sostiene il gel durante le operazioni successive. Per avere
100 ml di gel, vengono prelevati circa 60 ml della soluzione tampone
e vengono aggiunti in sequenza acrilamide (10 g), bisacrilamide (0.4
g), urea (6 g), acido ascorbico (0.1 g), solfato ferroso (0.005 g).
La soluzione viene fatta agitare e portata a 100 ml con la soluzione
tampone. Viene aggiunta una soluzione fatta al momento allo 0.6% di
perossido di idrogeno (0.35 ml per 100 ml di gel), mescolare
velocemente e versare il gel. Notare che la miscela di gel puo'
essere raffreddata fino quasi al congelamento prima di aggiungere il
perossido. La polimerizzazione si completa in 5-10 minuti. Un
"pettine" acrilico viene posto in cima alla vasca, per fare pozzetti
nel gel. Il gel versato deve abbondantemente riempire la vasca, e
questo si puo' fare anche con acqua, per poter assicurare una
soddisfacente polimerizzazione della superficie superiore.
Come alternativa al perossido di idrogeno, che ha funzione di
catalizzatore della polimerizzazione, e' possibile usare solfato di
ammonio (0.1 ml di una soluzione al 10%, preparata al momento) e
TEMED (0.3 ml) aggiunti alla miscela del gel prima di versarlo.
3.3 Elettroforesi
Il pettine acrilico viene rimosso dal gel e i pozzetti per il
campione vengono lavati con la soluzione tampone per la vasca.
Quest'ultima viene riempita con un volume appropriato di tampone (a
seconda dell'apparecchiatura usata). I campioni (10-20 ul) vengono
posti ("caricati") nei pozzetti e il gel posto nella vasca,
assicurandosi che i pozzetti stessi siano colmi.
L'elettroforesi viene fatta a 500 V (voltaggio costante) per due
volte il tempo che la pironina G (colorante) impiega a scomparire dal
gel, o tre volte se si utilizza come colorante il verde di metile.
Sarebbe consigliabile inoltre far circolare l'acqua attraverso la
vasca per mantenere la temperatura a 15-20C.
3.4 Fissaggio e colorazione
Il gel viene rimosso dalla vasca, e posto in una scatola di
plastica contenente 5-10 ml di PAGE G90 allo 0.1% (o PAGE Blue 83) in
200 ml di acido tricloroacetico al 10%. La colorazione viene
completata in 1-2 giorni e la decolorazione in genere non e'
necessaria. Il colorante che precipita si deve rimuovere dalla
superficie del gel, che viene lavato in acqua per favorire la
colorazione. Infine viene esaminato o fotografato. Qualsiasi "fondo"
(background) blu nel gel viene rimosso lavando quest'ultimo in acido
tricloroacetico al 10%. I gel si possono conservare in buste di
polietilene a 4C per molti mesi senza alcun danno o deterioramento.
3.5. Identificazione delle bande delle gliadine e ordeine
Le bande delle ordeine e delle gliadine si possono identificare
misurando le loro mobilita' relative (Wrigley, C.W., Autran, J.C. e
Bushuk, W., 1982, Advances in Cereal Science and Technology, 5,
211-259), sia mediante una formula elettroforetica (1) che mediante
confronto diretto dei tracciati (2).
4. Valutazione del risultato
I risultati delle determinazioni vengono principalmente valutati
con metodo comparativo, cioe' mediante confronto della sequenza di
bande o di tracciati elettroforetici con quelli delle varieta' di
riferimento. Di solito e' utile includere in ogni lastra un campione
di una varieta' a sequenza proteica nota. Questo puo' servire come
standard di qualita'; se la sequenza di bande o il tracciato della
varieta' di riferimento si vede chiaramente, allora si puo' procedere
nell'analisi per ulteriori informazioni. In aggiunta, il gel o il
tracciato puo' essere tarato con l'inserimento di proteine standard
di peso molecolare o punto isoelettrico noti, il che permette il
calcolo del peso molecolare delle bande interessanti o il loro punto
isoelettrico.
(1) Konarev, V.B., Gavrilyuk, I.P., Gubareva, N.K. e
Peneva, T.I., 1979, Cereal Chemistry, 56, 272-278.
(2) Shewry, P.R., Pratt, H.M., Faulks, A.J., Parmar, S. e
Miflin, B.J., 1979, Journal of the National Institute of
Agricultural Botany, 15, 5-40.
IL MINISTRO
DELL'AGRICOLTURA E DELLE FORESTE
FONTANA