ALLEGATO I
METODI DIAGNOSTICI PER LA CONFERMA
DELLA PESTE SUINA
Ai metodi di diagnosi si applicano le linee direttrici, le norme
ed i criteri minimi qui sotto riportati. I laboratori nazionali di
riferimento per la peste suina stabiliranno i materiali ed i metodi
per la diagnosi.
A) RACCOLTA DEI MATERIALI PER LA DIAGNOSI.
1. Per l'isolamento del virus e la rivelazione dell'antigene e'
essenziale disporre di tessuto delle amigdale. E' inoltre opportuno
prelevare campioni di reni, milza ed ileo, unitamente a linfonodi
mascellari e mesenterici. Ogni campione di tessuto deve essere posto
in un singolo sacchetto di plastica opportunamente etichettato. I
campioni vanno trasportati e conservati in contenitori a perfetta
tenuta. Essi non devono essere congelati, ma conservati in
frigorifero, e vanno esaminati senza indugio.
2. a) I campioni di sangue per l'isolamento del virus devono
essere prelevati da animali che presentano febbre o altri sintomi di
malattia. A tal fine vanno impiegate provette sterili non
citotossiche; i campioni vengono mantenuti al fresco, preferibilmente
in frigorifero, ed il loro esame deve aver luogo quanto prima.
b) Si puo' inoltre procedere al prelievo di campioni di sangue
per l'isolamento del virus dai leucociti dei suini sospetti. Ad
evitare la coagulazione del sangue deve essere fatto ricorso, di
preferenza, all'aggiunta di EDTA (1). I campioni vanno conservati in
frigorifero ed utilizzati entro due giorni.
3. Debbono essere prelevati da animali guariti dall'infezione
sospetta, e da scrofe che risultino aver avuto contatti con altri
animali infetti o sospetti, dei campioni di sangue destinati alla
ricerca degli anticorpi in appoggio alla diagnosi clinica ed a fini
di sorveglianza. Nelle aziende sospette, il prelevamento va
effettuato su tutti i primi venti animali sospetti di malattia o di
contatto con animali infetti e sul 25% dei successivi. Per assicurare
un'alta probabilita' di individuare gli anticorpi indotti dal virus
della peste suina, i campioni devono essere prelevati a tale stadio
in tutte le unita' dell'azienda. La sierodiagnosi non va applicata
laddove si sia proceduto ad una vaccinazione ufficialmente
autorizzata.
B) DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLA PESTE SUINA NELLE AZIENDE SOSPETTE.
La diagnosi di laboratorio della peste suina deve fondarsi
sull'individuazione dell'antigene virale nei tessuti organici come
indicato al capo B, punto 1.
In caso di risultati non conclusivi o negativi, le prove devono
essere ripetute sugli stessi campioni. Eventuali ulteriori campioni
devono essere raccolti dagli stessi animali.
Qualora l'esame di materiali provenienti da animali sospetti di
peste suina o da allevamenti che abbiano avuto contatti con
l'infezione abbia dato risultati negativi o non conclusivi, si deve
procedere all'isolamento del virus. Quando in tali cricostanze
l'individuazione dell'antigene virale o l'isolamento del virus non
hanno avuto successo, si deve procedere alla ricerca degli anticorpi
neutralizzanti su campioni di sangue di animali che hanno superato
l'infezione e di animali che risultino avere avuto contatti con
l'infezione.
I materiali, i metodi e i criteri diagnostici devono essere
prescritti dal laboratorio nazionale per la peste suina.
(1) Etilendiamminotetracetato di sodio.
1. Evidenziamento dell'antigene virale.
Per evidenziare l'antigene virale nei tessuti degli organi si
applica la tecnica dell'immunofluorescenza diretta a sezioni
criostatiche sottili (fino a 5 micron) di amigdale e di tessuti di
altri organi, secondo quanto specificato al capo A, punto 1, del
presente allegato. Nell'applicazione di detta tecnica si adottano i
seguenti criteri base:
a) il siero iperimmune dev'essere preparato a partire da suini
sicuramente sani e che non abbiano anticorpi capaci di pregiudicare
la specificita' o la qualita' della reazione;
b) il coniugato fluorescemico dell'immonoglobulina, preparato a
partire dal siero di suini iperimmunizzati contro la peste suina
secondo quanto specificato alla lettera a), deve avere un titolo
minimo di attivita' 1: 20, determinato su colture cellulari infettate
con virus della peste suina e confermato con prove di controllo su
azioni di tessuti. La diluizione del coniugato deve associare il
massimo di brillantezza al minimo di colorazione di fondo;
c) ogni campione che mostri una fluorescenza citoplasmatica
specifica va considerato positivo. Nei casi dubbi il risultato
dev'essere confermato mediante isolamento del virus in colture
cellulari;
d) qualora si sospetti che una manifestazione di fluorescenza
sia dovuta al virus vaccinale, l'allevamento e' considerato sospetto
fintanto che le autorita' competenti lo riterranno opportuno.
2. Isolamento e identificazione del virus in colture di cellule.
a) L'isolamento del virus dei campioni di tessuto viene effettuato
su colture di cellule sensibili (PK 15) o di altri tipi di cellule
sensibili, presentanti una sensibilita' analoga; tali colture sono
effettuate su portaoggetti posti a contatto con una sospensione al
10%, opportunamente preparata, di tessuto proveniente dall'animale
sospetto; iniziando da una sospensione al 10%, dette colture devono
essere colorate e sottoposte all'esame della fluorescenza
citoplasmatica specifica a distanza di 24-72 ore dal momento
dell'inoculazione.
b) L'isolamento del virus dai campioni di sangue, raccolti e
trattati come indicato al capo A, punto 2, lettera b), del presente
allegato, viene effettuato per inoculazione di colture di cellule,
come descritto rispettivamente al capo A, punto 2, lettere a) e b).
Tali colture devono essere esposte a una sospensione di "buffy coat"
riportata al volume iniziale del sangue. Nel caso dei campioni di
siero, le colture di cellule vanno esposte a una diluizione del siero
non superiore al 20%.
C) IDENTIFICAZIONE NEI CAMPIONI DI SANGUE DEGLI ANTICORPI
INDOTTI DAL VIRUS DELLA PESTE SUINA.
L'identificazione degli anticorpi neutralizzanti nei campioni di
sangue va effettuata a conferma della diagnosi della peste suina
negli allevamenti dove sono presenti suini che presentano sintomi
clinici della malattia o su animali presumibilmente venuti a contatto
con l'infezione. Essa puo' servire anche ai fini della sorveglianza o
per il controllo degli allevamenti il cui stato sanitario e'
sconosciuto.
A tali fini si provvedera' a sottopore opportuni campioni di
sangue a una prova riconosciuta.
Sono autorizzate le seguenti prove, basate sulla tecnica
dell'immunofluorescenza diretta. Esse devono comprendere gli
opportuni controlli dei sieri positivi e negativi.
1. Prova di riduzione delle placche (PRP).
La prova e' basata sul conteggio delle microplacche. Tre
diluizioni di siero diverse, a partire da una diluizione 1: 20,
vengono fatte reagire con un volume uguale di sospensione di virus
contenente da 300 a 1.000 unita' formatrici di placche (UFP) di un
ceppo virulento di virus della peste suina, impiegando almeno due
colture monostrato per diluizione.
I risultati sono espressi sotto forma di titolo di riduzione delle
placche, che e' il reciproco della diluizione di siero capace di
ridurre del 90% il numero di focolai fluorescenti rispetto al siero
di controllo negativo diluito 1: 20. I titoli vengono determinati
graficamente.
2. Prove dell'indice di neutralizzazione (IN).
La prova e' basata sul conteggio delle microplacche. Un ceppo di
virus viene titolato in colture cellulari in presenza di un uguale
volume di una diluizione 1: 20 di siero. Per ogni diluizione
logaritmica 10 della sospensione di virus sono necessarie almeno due
colture monostrato.
Il grado di attivita' neutralizzante viene espresso come
differenza fra il titolo di infezione in presenza di una diluizione
di 1: 20 di siero riconosciuto come negativo e il titolo della stessa
sospensione di virus in presenza del siero sospetto. Questa
differenza costituisce l'indice di neutralizzazione e viene espressa
logaritmicamente.
3. Prova di neutralizzazione nel virus e immunofluorescenza (IFN).
Questa prova e' fondata sulla determinazione del punto finale al
50%. Le colture vengono inoculate con quantita' costanti di virus
dopo incubazione in presenza del siero, e i risultati sono fondati
sull'assenza totale della fluorescenza citoplasmatica specifica.
Ai fini di uno screening, i sieri vengono diluiti 1: 5. Se e'
necessaria una titolazione completa, si preparano diluizioni al
doppio del siero, a partire da 1: 5. Ogni diluizione e' mescolata con
un volume uguale di sospensione di virus contenente da 100 a 200 dosi
infettive (CTID50). A ciascun livello di diluizione vanno impiegate
almeno due colture. I risultati sono espressi come reciproco del
livello di diluizione al quale la meta' delle colture cellulari inoc-
ulate non presenta alcuna fluorescenza specifica. Se il punto finale
e' compreso fra due livelli di diluizione, lo si calcola per
interpolazione.
D) VALUTAZIONE DEI RISULTATI DELLE PROVE DI LABORATORIO.
1. La conferma della presenza della malattia dev'essere fondata
sull'identificazione dell'antigene virale nei tessuti organici o
sull'isolamento del virus da campioni di tessuti, secondo le tecniche
descritte al capo B, punti 1 e 2, del presente allegato; fa eccezione
il caso in cui sia dimostrato che la reazione e' dovuta al virus
vaccinale, come indicato al capo B, punto 1, lettera d).
2. Qualora sia stata riscontrata la presenza di anticorpi che
reagiscono con virus della peste suina, l'allevamento di origine
dev'essere considerato sospetto.
a) Per escludere il sospetto di peste suina a seguito
dell'identificazione degli anticorpi, si procede alla prova descritta
al capo E per stabilire se si tratta di anticorpi reattivi
eventualmente indotti dal virus della diarrea virale bovina o di
anticorpi del virus della peste suina. I campioni originari vanno
nuovamente sottoposti alla prova differenziale.
b) Se la prima prova differenziale non risulta sufficiente,
trenta giorni piu' tardi si procede a una nuova prova, in modo da
seguire la possibile diffusione dell'infezione. I campioni vanno
prelevati su tutti i primi venti animali dell'azienda sospetta e sul
25% dei successivi.
3. Interpretazione dei risultati sierologici.
a) Prova di riduzione su placche (PRP).
Un titolo uguale o superiore a 50 su un qualunque suino, associato
a osservazioni cliniche od epizooziologiche tali da far sospettare la
presenza della malattia, costituisce diagnosi positiva.
Un titolo uguale o superiore a 50 su un qualunque suino, non
accompagnato da manifestazioni cliniche o epizooziologiche fa
sospettare la presenza della malattia e deve essere seguito da un
procedimento diagnostico differenziale.
b) Indice di neutralizzazione (IN).
Un titolo uguale o superiore ad 1,0 su un qualunque suino,
associato a sintomi clinici ed epizooziologici tali da far sospettare
la presenza della malattia, costituisce diagnosi positiva.
Un titolo uguale o superiore ad 1,0 su un qualunque suino, non
associato a sintomatologia clinica ed epizooziologica, tali da far
sospettare la presenza della malattia, e' considerato risultato
dubbio e deve essere seguito da un procedimento diagnostico
differenziale.
c) Esami per immunofluorescenza e neutralizzazione del virus (IFN).
Un titolo uguale o superiore a 5 su un qualunque suino, associato
a sintomi clinici od epizooziologici che lascino sospettare la
presenza della malattia, costituisce diagnosi positiva.
Un titolo uguale o superiore a 5 su un qualunque suino, non
associato a sintomi clinici o epizooziologici, lascia sospettare la
presenza della malattia, e deve essere seguito da un procedimento
diagnostico differenziale.
E) DIAGNOSI DIFFERENZIALE DELLA PESTE SUINA (PS) DALLA DIARREA
VIRALE BOVINA (DVB).
1. Le prove per la diagnosi differenziale fra la peste suina (PS)
e la diarrea virale bovina (DVB) sono basate su titolazioni del punto
finale dei sieri in parallelo con ceppi della PS e della DVB e
secondo metodi integralmente comparabili.
I ceppi della PS e della DVB da impiegare nella prova debbono
essere approvati ufficialmente. Per escludere il sospetto di peste
suina sorto in seguito all'identificazione di anticorpi nei suini, i
campioni di sangue devono essere sottoposti a titolazioni comparative
del punto finale degli anticorpi neutralizzati contro i virus della
PS e della DVB.
2. I risultati della prova sierologica differenziale tra la peste
suina e la diarrea virale bovina devono essere intepretati come
segue:
a) se dalla prova comparativa risulta:
che piu' di un suino presenta anticorpi della PS, ma non
presenta anticorpi della DVB, oppure;
che i titoli nei confronti del virus della PS sono uguali o
superiori a quelli contro la DVB in una forte percentuale dei suini;
la peste suina e' confermata;
b) se dalle prove comparative risulta che alcuni dei titoli nei
confronti del virus della PS sono uguali o superiori ai titoli nei
confronti del virus della DVB (su un certo numero di suini), si
sospetta la presenza di peste suina e si procede alla
differenziazione, nel modo seguente:
- i suini che mostrano titoli di neutralizzazione verso il virus
della peste suina superiori o uguali ai titoli verso il virus della
DVB vengono abbattuti, e i loro feti, insieme a qualunque tessuto
ritenuto significativo, vengono sottoposti alla ricerca del virus o
dell'antigene della peste suina;
- se si individua la presenza dell'antigene o del virus della
peste suina, la presenza della malattia e' confermata;
- se l'esame sopra definito al secondo trattino non rivela la
presenza del virus o dell'antigene della peste suina, l'allevamento
e' considerato sospetto fino al momento in cui un'altra serie di
campioni di sangue, raccolti almeno trenta giorni piu' tardi, sia
stata sottoposta ad ulteriori prove comparative;
- se tali ulteriori prove comparative dimostrano che tutti gli
animali hanno titoli contro il virus della DVB significativamente
piu' elevati - almeno quattro volte - rispetto al virus della PS, il
sospetto non viene confermato;
- se uno o piu' animali presentano un titolo contro il virus
della PS uguale o superiore rispetto al titolo contro la DVB, la
peste suina e' confermata;
c) se i titoli nei confronti della DVB non sono tali da
escludere la peste suina, l'azienda dev'essere considerata sospetta
ed essere sottoposta nuovamente alla prova dopo almeno trenta giorni.