ALLEGATO B
NORME PER LA FABBRICAZIONE E L'UTILIZZAZIONE
DELLE TUBERCOLINE BOVINE ED AVIARIE
1. Le tubercolinizzazioni controllate ufficalmente devono essere
effettuate mediante tubercoline PPD o tubercoline preparate
sinteticamente e concentrate a caldo ('tubercoline sintetiche').
Lo Stato membro che, alla data di adozione della presente
direttiva, impiega, per il controllo delle tubercoline cosiddette
'sintetiche', una tubercolina standard conforme al campione
internazionale della vecchia tubercolina, puo', in deroga alle
disposizioni dell'allegato B, punto 1 della direttiva 64/432/CEE,
continuare ad utilizzare questo metodo fino all'applicazione di norme
internazionali piu' perfezionate.
2. Gli standard di fabbricazione per il controllo delle
tubercoline PPD bovine e delle tubercoline cosiddette 'sintetiche'
devono essere titolati in unita' tubercoliniche comunitarie (UTC)
mediante prove biologiche secondo le norme CEE per la tubercolina
standard CEE.
3. Gli standard di fabbricazione per il controllo delle
tubercoline aviarie devono essere espressi in unita' internazionali e
titolati per via biologica, secondo lo strandard CEE della
tubercolina PPD aviaria.
4. Lo standard CEE per la tubercolina PPD bovina e' fornito dal
'Centraal Diergeneeskundig Instituut', Afdeling Rotterdam, Paesi
Bassi.
5. Lo standard CEE per la tubercolina 'sintetica' bovina e'
fornita dall''Institut Pasteur' di Parigi, Francia.
6. Lo standard CEE per la tubercolina aviaria e' fornito dal 'Cen-
tral Veterinary Laboratory', Weybridge, Surrey, Regno Unito.
7. Le tubercoline bovine devono essere preparate con uno dei ceppi
di Mycobacterium bovis indicati qui di seguito:
a) An5;
b) Vallee.
8. Le tubercoline aviarie devono essere preparate con uno dei
ceppi di Mycobacterium avium indicati qui di seguito:
a) D4ER;
b) TB56.
9. Il pH delle tubercoline deve essere compreso fra 6,5 e 7,5.
10. Per quanto concerne l'aggiunta alle tubercoline di conservanti
antimicrobici o di altre sostanze, deve risultare dimostrato, a
giudizio dell'istituto statale responsabile del controllo ufficiale
della tubercolina, che tale aggiunta non altera l'innocuita' ne'
l'efficacia del prodotto.
Le concentrazioni massime consentite per il fenolo e la glicerina
sono le seguenti:
a) fenolo - 0,5% M/v;
b) glicerina - 10% v/v.
11. Superata con esito favorevole l'ultima prova di attivita', le
tubercoline, conservate a temperature comprese fra 2 C e 8 C ed al
riparo dalla luce, rimangono valide per tutta la durata dei periodi
sotto indicati:
a) tubercoline PPD liquide: due anni;
tubercoline PPD liofilizzate: otto anni;
b) tubercoline 'sintetiche' diluite: due anni.
12. Nei rispettivi Paesi, gli istituti statali seguenti sono
incaricati del controllo ufficiale delle tubercoline:
a) Germania: Paul-Ehrlich-Institut, Frankfurt/Main;
b) Belgio: Institut d'hygiene et d'epidemiologie, rue J. Wytsman
14, B 1050 Bruxelles;
c) Francia: Laboratoire national des medicaments veterinaires,
Fougeres;
d) Granducato del Lussemburgo: Istituto del paese fornitore;
e) Italia: Istituto superiore di sanita', Roma;
f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling
Rotterdam;
g) Danimarca: Statens veterinaere Serumlaboratorium, Kobenhavn
V;
h) Irlanda: Istituto del paese fornitore;
i) Regno Unito: The Central Veterinary Laboratory, Weybridge,
Surrey;
j) Grecia: Kthniat Inshtouton Loimvdvn Kai Parasiokvn Noshmatan
1era odos75 Auhnai 301;
k) Spagna: Laboratorio de Sanidad y Produccion Animal de
Granada;
l) Portogallo: Laboratorio Naccional de Investigacao veterinaria
- Lisboa.
13. Ciascuna partita di tubercoline infialate e pronte per l'uso
deve essere oggetto di un controllo ufficiale.
14. Le tubercoline devono essere controllate con metodi biologici
e chimici.
15. Le tubercoline devono essere sterili. Le prove di sterilita'
devono essere effettuate secondo le norme della farmacopea europea.
16. Le tubercoline devono risultare esenti da proprieta' tossiche
od irritanti in base a una prova effettuata secondo le norme della
farmacopea europea.
17. Le tubercoline devono essere sottoposte a un'analisi chimica
per determinare l'esatta concentrazione della glicerina e/o del
fenolo, nonche' la concentrazione di altri eventuali conservanti.
18. Una prova di non sensibilizzazione alla tubercolina deve
essere effettuata secondo le norme della farmacopea europea.
19. L'attivita' delle tubercoline deve essere valutata con i
metodi biologici, applicabili alle tubercoline PPD e a quelle
'sintetiche' e basati sul confronto delle tubercoline in esame con
tubercoline standard.
20. Il contenuto proteico delle tubercoline PPD
(tubercoloproteina) si ottiene secondo il metodo di Kjeldahl. Il
fattore di conversione dell'azoto in tubercoloproteine e' 6,25.
21. Lo standard CEE per la tubercolina 'sintetica' bovina ha
un'attivita' di 65.000 unita' tubercoliniche comunitarie (UTC)
provvisorie per ml, e viene distribuito in fiale da 5 ml.
22. Lo standard CEE, per la tubercolina PPD bovina ha un'attivita'
di 50.000 UTC per mg di PPD, e viene distribuito alla stato
liofilizzato in fiale contenenti 1,8 mg di PPD (0,00002 mg di PPD
corrispondono cioe' ad 1 unita' tubercolinica comunitaria di
attivita').
23. La tubercolina PPD aviaria della norma CEE ha un'attivita' di
50.000 unita' internazionali (UI) per mg di derivato proteico
purificato essiccato e viene distribuita allo stato liofilizzato in
fiale contenenti 10 mg di PPD piu' 26,3 mg di sali (0,0000726 mg
dello standard corrispondono cioe' ad 1 unita' internazionale di
attivita').
24. Le tubercoline che i fabbricanti presentano per il controllo
agli istituti statali di cui al paragrafo 12 devono essere state
oggetto di una prova biologica di attivita' in paragone con gli
opportuni standard elencati ai paragrafi 2 e 3.
25. a) Prove di attivita' su cavie.
La prova deve essere effettuata su cavie albine di peso fra g 400
e 600. Tali cavie devono essere in buona salute al momento
dell'inoculazione della tubercolina. Per ciascuna prova vanno
impiegate non meno di otto cavie. La prova deve essere effettuata a
non meno di un mese di distanza dalla sensibilizzazione.
aa) Per il controllo delle tubercoline bovine, le cavie devono
essere sensibilizzate con uno dei metodi seguenti:
1) iniezione di Mycobacterium bovis del ceppo AN5, ucciso col
calore, in coadiuvante oleoso;
2) iniezione di Mycobacterium bovis del ceppo AN5 vivo in
emulsione salina fisiologica:
3) iniezione di vaccino BCG.
bb) Per il controllo delle tubercoline aviarie, le cavie devono
essere sensibilizzate mediante inoculazione di 2 mg, di micobatteri
tubercolari del tipo aviario, uccisi col calore, sospesi in 0,5 ml di
paraffina liquida sterile, ovvero mediante inoculazione di
micobatteri tubercolari vivi del tipo aviario in emulsione salina
fisiologica, Il ceppo da impiegare e' quello del tipo aviario D4.
cc) Qualunque tubercolina esaminata deve essere titolata
mediante inoculazione intradermica in paragone con l'opportuna
tubercolina standard, impiegando gruppi di cavie opportunamente
sensibilizzate.
Le cavie devono essere tosate su due fianchi. La prova deve essere
effettuata confrontando le reazioni indotte da una serie di
inoculazioni intracutanee di dosi da 0,2 ml al massimo di diluizioni
della tubercolina standard in soluzione salina isotonica tamponata
contenente lo 0,0005% di Tween 80, con una corrispondente serie di
inoculazioni della tubercolina in esame. Le diluizioni devono essere
preparate in serie geometrica ed essere iniettate nelle cavie secondo
una distribuzione irregolare in quadrato latino (otto iniezioni, da
praticarsi in quattro punti su ciascun lato). Il diametro delle aree
di reazione su ciascun lato deve essere misurato e registrato dopo
24-28 ore.
Per ciascun campione di tubercolina sotto prova deve essere
effettuata una valutazione dell'attivita' relativa e dei suoi limiti
di affidabilita', basata su metodi statistici, impiegando come
metametri i diametri delle aree di reazione e dei logaritmi delle
dosi. L'attivita' della tubercolina bovina in esame e' accettabile
se, in base alla valutazione, ogni dose destinata ai bovini risulta
contenere 2.000 UTC (+/- 25%). L'attivita' di qualunque
tubercolina in esame deve essere espressa, secondo i casi, in unita'
tubercoliniche comunitarie o in UI/ml.
b) Controllo dell'attivita' sui bovini.
Un controllo dell'attivita' delle tubercoline bovine puo' essere
effettuato periodicamente su bovini infetti da tubercolosi per via
naturale o artificiale. Dette prove di attivita', da praticarsi su
gruppi di bovini tubercolotici, devono essere effettuate per
inoculazione intradermica della tubercolina in esame in quattro o sei
punti, in paragone con l'opportuno standard; l'attivita' della
tubercolina deve essere valutata con metodi statistici come nella
prova su cavie.
26. Per l'etichettatura dei contenitori e degli imballaggi delle
tubercoline devono essere rispettate le seguenti norme.
L'etichetta del contenitore e quella dell'imballaggio devono
indicare:
- il nome del preparato:
- per i preparati liquidi, il volume totale del contenitore;
- il numero di unita' comunitarie o di unita' internazionali per
ml o per mg;
- il nome del fabbricante;
- il numero della partita;
- per i preparati liofilizzati, la natura e la quantita' del
liquido di ricostituzione.
L'etichetta del contenitore o dell'imballaggio deve indicare:
- data di scadenza;
- condizioni di conservazione;
- denominazione e, se possibile, proporzione di ogni sostanza
aggiunta;
- tipo di bacillo dal quale e' stata ricavata la tubercolina.
27. Dei laboratori comunitari designati conformemente all'art. 3
verranno incaricati di controlli complementari delle tubercoline
normalmente utilizzati nei vari Stati membri per assicurare che
l'attivita' di ciascuna di queste tubercoline sia conforme a quella
della corrispondente tubercolina standard comunitaria. Tali analisi
devono essere effettuate su bovini tubercolotici, su cavie
opportunamente sensibilizzate e mediante appropriate reazioni
chimiche.
28. Sono riconosciute ufficialmente le seguenti tecniche di
intradermotubercolinizzazione:
a) intradermotubercolinizzazione unica: inoculazione singola di
tubercolina bovina;
b) intradermotubercolinizzazione comparativa: inoculazione
simultanea delle due tubercoline (aviaria e bovina).
29. La dose di tubercolina inoculata non deve essere inferiore:
1) a 2.000 UTC di tubercolina bovina;
2) a 2.000 u.i. di tubercolina aviaria.
Il volume di ciascuna dose non deve superare 0,2 ml.
30. La tubercolinizzazione deve essere effettuata inoculando la
tubercolina, o le tubercoline, nella pelle del collo. I punti di
inoculazione devono trovarsi al limite tra il terzo anteriore ed il
terzo mediano del collo. Quando nello stesso animale vengono inocu-
late ambedue le tubercoline il punto di iniezione della tubercolina
aviaria deve trovarsi a 10 cm circa dalla cresta del collo ed il
punto di inoculazione della tubercolina bovina a 12,5 cm al di sotto
di una linea approssimativamente parallela a quella delle spalle, o
su diversi punti del collo; negli animali giovani, sul cui collo non
vi e' abbastanza spazio per effettuare le due inoculazioni a distanza
sufficiente sullo stesso lato, ciascuna inoculazione va praticata su
uno dei due lati del collo, in punti identici, al centro del terzo
mediano del collo.
31. Tecnica ed interpretazione delle reazioni di
tubercolinizzazione.
a) Tecnica.
Tosare e pulire i punti di inoculazione. Prendere fra il pollice e
l'indice una piega di pelle in ciascuna delle zone depilate,
misurarne lo spessore con calibro e annotarne il risultato.
Introdurre obliquamente negli strati piu' profondi della pelle,
tenendo il taglio trasversale della punta rivolto verso l'esterno, un
ago corto sterile, collegato ad una siringa graduata caricata con la
tubercolina in esame. Iniettare la dose di tubercolina.
L'inoculazione e' avvenuta in modo corretto se la palpazione rivela
un piccolo gonfiore, delle dimensioni di un pisello, in ciascun punto
di inoculazione. A distanza di 22 ore dall'inoculazione, misurare
nuovamente lo spessore della piega cutanea in ciascun punto di
inoculazione e annotarne il risultato.
b) Interpretazione delle reazioni.
- L'interpretazione delle reazioni deve essere fondata su
osservazioni cliniche e sulla registrazione dell'aumento, o degli
aumenti, dello spessore della piega cutanea nei punti di
inoculazione, 72 ore dopo l'inoculazione della tubercolina o delle
tubercoline;
ba) reazione negativa: si osserva solo un gonfiore circoscritto
con aumento di spessore della piega cutanea non superiore a 2 mm
senza segni clinici, quali edema diffuso od esteso, esudazione,
necrosi, dolore o infiammazione dei dotti linfatici della regione o
dei linfonodi.
bb) reazione dubbia: non si osservano segni clinici del tipo di
quelli menzionati al punto ba), e l'aumento dello spessore della
piega cutanea e' superiore a 2 mm ed inferiore a 4 mm.
bc) reazione positiva: si osservano segni clinici del tipo di
quelli menzionati al punto ba), si riscontra un aumento di 4 mm o
piu' dello spessore della piega cutanea nel punto di iniezione.
32. Interpretazione delle intradermotubercolinizzazioni ufficiali:
a) Intradermotubercolinizzazione singola:
positiva: reazione secondo la definizione del par. 31 bc);
dubbia: reazione secondo la definizione del par. 31 bb);
negativa: reazione secondo la definizione del par. 31 ba).
Gli animali per i quali l'intradermotubercolinizzazione singola
non da' esito conclusivo devono essere sottoposti ad un'altra prova a
distanza di almeno quarantadue giorni.
Gli animali che non risultano negativi a questa seconda prova
devono essere ritenuti positivi.
Gli animali che risultano positivi
all'intradermotubercolinizzazione singola possono essere sottoposti
ad un'intradermotubercolinizzazione comparativa.
b) Intradermotubercolinizzazione comparativa per il
riconoscimento degli allevamenti ufficialmente indenni da tubercolosi
e per il mantenimento di tale qualifica:
positiva: reazione bovina positiva, superiore di oltre 4 mm alla
reazione alla tubercolina aviaria, ovvero presenza di segni clinici;
dubbia: reazione bovina positiva o dubbia, superiore da 1 a 4 mm
alla reazione alla tubercolina aviaria, ed assenza di segni clinici;
negativa: reazione bovina negativa, ovvero reazione bovina
positiva o dubbia, ma di intensita' pari o inferiore ad una reazione
positiva o dubbia alla tubercolina aviaria ed assenza di segni
clinici in ambedue i casi.
Gli animali per i quali l'intradermotubercolinizzazione
comparativa non da' esito conclusivo devono essere sottoposti ad
un'altra prova a distanza di almeno quarantadue giorni.
Gli animali che non risultano negativi a questa seconda prova
devono essere ritenuti positivi.
c) Per gli allevamenti dove siano presenti animali per i quali si
ritenga che:
1) abbiano avuto una reazione dubbia ad una
intradermotubercolinizzazionesingola,
2) siano risultati positivi all'intradermotubercolinizzazione
singola, ma che sono in attesa di un nuovo controllo per
intradermotubercolinizzazione comparativa,
3) abbiano avuto una reazione dubbia ad una
intradermotubercolinizzazionecomparativa,
la qualifica di allevamento ufficialmente indenne da 'tubercolosi'
puo' essere sospesa fino al momento in cui sia chiarito lo stato
degli animali di cui sopra.
33. Gli animali destinati al commercio intracomunitario devono
essere sottoposti a intradermotubercolinizzazione singola nei trenta
giorni precedenti lo spostamento; gli animali che mostrano un aumento
dello spessore della piega cutanea superiore a 2 mm o la presenza di
segni clinici non possono essere ammessi allo scambio
intracomunitario.
Gli animali provenienti dagli allevamenti di cui al par. 32,
lettera c), sono esclusi dagli scambi intracomunitari fino a quando
non sara' stato chiarito lo stato sanitario degli animali ivi
contemplati.