ALLEGATO C
BRUCELLOSI
A. Siero-agglutinazione.
1. Il siero agglutinante tipo deve essere conforme al siero
campione preparato dal Veterinary Laboratory Weybridge - Surrey,
Inghilterra.
L'ampolla deve contenere 1.000 unita' internazionali (UI)
agglutinanti provenienti dalla liofilizzazione di 1 ml di siero
bovino.
2. La fornitura del siero tipo deve essere assicurata dal
Bundesgesundheitsamt, Berlino.
3. Il tasso delle agglutine brucellari di un siero deve essere
espresso in unita' internazionali per ml (ad es.: siero X - 80 u.i.
per ml).
4. La lettura della siero-agglutinazione lenta in tubi deve
avvenire al 50% o al 75% di agglutinazione; l'antigene utilizzato
dovra' essere stato titolato nelle identiche condizioni in presenza
di siero tipo.
5. L'agglutinabilita' dei vari antigeni nei confronti del siero
tipo deve essere compresa entro i seguenti limiti:
- se la lettura e' fatta al 50%: tra 1/600 e 1/1000;
- se la lettura e' fatta al 75%: tra 1/500 e 1/750.
6. Per la preparazione dell'antigene destinato alla siero-
agglutinazione in tubi (metodo lento) devono essere utilizzati i
ceppi Weybridge n. 99 e USDA 1119 o qualsiasi altro ceppo di
sensibilita' equivalente.
7. I terreni di coltura utilizzati sia per la conservazione del
ceppo nel laboratorio che per la produzione dell'antigene devono
essere scelti in modo da non favorire la dissociazione batterica
(S-R); si dovra' impiegare di preferenza l'agarpatata.
8. L'emulsione batterica deve essere effettuata con soluzione
fisiologica (NaCI 8,5%) fenicato allo 0,5%. Non deve essere usato il
formolo.
9. Si devono incaricare del controllo ufficiale degli antigeni i
seguenti istituti ufficiali:
a) Germania: Bundesgesundheitsamt, Berlino;
b) Belgio: Institut national de recherches ve'te'rinaires,
Bruxelles;
c) Francia: Laboratoire central de recherches ve'te'rinaires,
Alfort;
d) Granducato del Lussemburgo: Istituto del paese fornitore;
e) Italia: Istituto superiore di sanita', Roma;
f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling
Rotterdam;
g) Danimarca: Statens veterinaere Serumlaboratorium, Kobenhavn
V;
h) Irlanda: The Veterinary Research Laboratory Departement of
Agricolture and Fisheries, Thorndale Beaumont Road, Dublin 9;
i) Regno Unito: - Gran Bretagna: The Central Veterinary Labora-
tory, Weybridge, Surrey England;
- Island del Nord: The Veterinary Research Laboratory, Stormont,
Belfast;
j) Grecia: Kthniatrikon Institoytoy Lovvdvn Kai Parasitikvn
Noshmatvn 1era odow75 Auhnai 301;
k) Spagna: Laboratorio de Sanidad y Produccion Animal de
Granada;
l) Portogallo: Laboratorio Naccional de Investigacao veterinaria
- Lisboa.
10. Gli antigeni possono essere forniti concentrati purche' il
coefficiente di diluizione richiesto sia indicato sull'etichetta del
flacone.
11. Per effettuare una siero-agglutinazione occorre preparare
almeno tre diluizioni per ogni siero. Le diluizioni del siero
sospetto devono essere affermate in modo che la lettura della
reazione al limite di infezione avvenga nel tubo mediano. In caso di
reazione positiva in questo tubo il siero sospetto conterra' quindi
almeno la quantita' di 30 UI agglutinanti per millilitro.
B. Reazione di fissazione del complemento.
1. Come siero standard vale lo stesso substandard del siero della
brucellosi di cui al punto A 1 del presente allegato. Oltre alle
unita' di agglutinazione internazionali (UAI), devono essere presenti
in un millilitro di questo siero della brucellosi liofilizzato 1.000
unita' sensibilizzanti che fissano il complemento. Queste unita'
sensibilizzanti sono denominate unita' sensibilizzanti CEE (USC).
2. La fornitura del siero standardizzato e' assicurata dal
BundesgesundheitSamt di Berlino.
3. Il tenore di anticorpi che fissano il complemento, in un siero,
va espresso in unita' sensibilizzanti CEE (USC) (es.: siero x = USC
ml).
4. Un siero contenente in 1/ml 20 unita' sensibilizzanti CEE (il
che corrisponde ad un'attivita' del 20% dell'attivita' del siero di
riferimento) o piu', deve essere considerato positivo.
5. I sieri devono essere inattivati come segue:
a) bovini: 56 - 60C per 30-50 minuti;
b) suini: 60C per 30-50 minuti.
6. Per la produzione dell'antigene si devono usare i ceppi
Weybridge n. 99 o USDA 1119.
L'antigene e' costituito da un'emulsione batterica in soluzione
fisiologica allo 0,85% o in soluzione tampone veronal.
7. Per la reazione si deve usare una dose di complemento che sia
maggiore della dose minima necessaria per una emolisi totale.
8. Nell'esecuzione della reazione, si devono effettuare ogni volta
i seguenti controlli:
a) controllo dell'effetto anticomplementare del siero;
b) controllo dell'antigene;
c) controllo delle emazie sensibilizzate;
d) controllo del complemento;
e) controllo di sensibilita' della reazione con l'aiuto di un
siero positivo;
f) controllo della specificita' della reazione con l'aiuto di un
siero negativo.
9. La sorveglianza e il controllo ufficiale dei sieri standard e
degli antigeni sono affidati agli organismi di cui al punto A 9 del
presente allegato.
10. Gli antigeni possono essere forniti in forma concentrata,
purche' sull'etichetta sia indicato il coefficiente di diluizione
necessario.
C. Prova dell'anello (Ring Test).
1. La prova dell'anello deve essere effettuata sul contenuto di
ogni bidone di latte o sul contenuto di ogni grande contenitore
dell'azienda.
2. L'antigene tipo da impiegare deve provenire da uno degli
istituti elencati al punto A 9, lettere da a) a j). Si raccomanda di
impiegare antigeni standardizzati secondo le raccomandazioni
dell'OMS/FAO.
3. L'antigene puo' essere colorato solo con ematossilina o
tetrazolo; occorre dare la preferenza all'ematossilina.
4. Se non sono utilizzati metodi di conservazione, la reazione
deve essere effettuata tra la 18a e la 24a ora successiva alla
mungitura. Qualora la prova sul latte debba essere effettuata oltre
24 ore dopo il prelievo del campione, si devono adottare sistemi di
conservazione. Come conservanti si possono utilizzare il formolo o il
cloruro mercurico; in tal caso, la prova deve essere effettuata entro
14 giorni successivi al giorno in cui e' stato prelevato il campione.
In caso di utilizzazione del formolo, la concentrazione finale nel
campione di latte deve essere dello 0,2%; la proporzione tra la
quantita' del latte e la soluzione di formolo da aggiungere deve
essere almeno di 10 a 1.
Al posto del formolo si puo' utilizzare il cloruro mercurico;
anche in tal caso la concentrazione finale nel latte deve essere
dello 0,2% e la proporzione tra la quantita' di latte e la soluzione
del cloruro mercurico da aggiungere, di 10 a 1.
5. La reazione deve essere effettuata secondo uno dei seguenti
metodi:
- su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol-
ume di latte di 1 ml cui sono stati aggiunti 0,03 ml di uno degli
antigeni standardizzati colorati;
- su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol-
ume di latte di 1 ml cui sono stati aggiunti 0,05 ml di uno degli
antigeni standardizzati colorati;
- su un volume di latte di 8 ml cui sono stati aggiunti 0,08 ml
di uno degli antigeni standardizzati colorati;
- su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol-
ume di latte di 2 ml cui sono aggiunti 0,05 ml di uno degli antigeni
standardizzati colorati.
6. La miscela di latte e di antigeni deve essere tenuta in
termostato a 37 C per almeno 45 e al massimo per 60 minuti. La prova
deve essere valutata entro 15 minuti dalla rimozione della soluzione
dal termostato.
7. La reazione deve essere valutata secondo il seguente criterio:
a) reazione negativa: latte colorato, crema decolorata;
b) reazione positiva: latte e crema colorati in modo identico o
latte decolorato e crema colorata.
D. Prova dell'antigene di Brucella tamponato.
La prova all'antigene di Brucella tamponato puo' essere effettuata
secondo uno dei seguenti metodi:
A. METODO MANUALE.
1. Come siero standard e' impiegato il secondo siero
internazionale standard anti-Brucella abortus, fornito dal Central
Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey, Inghilterra.
2. L'antigene e' preparato senza riferimento alla concentrazione
delle cellule, ma la sua sensibilita' deve essere standardizzata
rispetto al secondo siero internazionale standard anti-Brucella
abortus, in modo tale che l'antigene dia reazione positiva con un
siero diluito 1:47,5 e reazione negativa con un siero diluito 1:55.
3. L'antigene deve essere sospeso in diluente per l'antigene di
Brucella tamponato a pH 3,65 (Piu' o Meno) 0,5, e puo' essere stato
colorato mediante rosa Bengala.
4. Per la preparazione dell'antigene devono essere utilizzati il
ceppo Weybridge n. 99 oppure l'USDA 1119 o qualunque altro ceppo di
sensibilita' equivalente.
5. I terreni di coltura impiegati per la conservazione del ceppo
in laboratorio e per la produzione dell'antigene devono essere tali
da non provocare la dissociazione batterica (S-R); sono
raccomandabili il terreno agarpatata oppure i metodi di coltura
continua.
6. L'antigene deve essere controllato nei confronti di 8 sieri
liofilizzati riconosciuti rispettivamente positivi e negativi.
7. La sorveglianza e il controllo ufficiale dei sieri e degli
antigeni standard sono effettuati dagli organismi ufficiali elencati
nell'allegato C, punto A 9.
8. L'antigene deve essere fornito pronto per l'uso.
9. La prova dell'antigene di Brucella tamponato deve essere
effettuata nel modo seguente:
a) porre una goccia (0,03 ml) di antigene a fianco di una goccia
(0,03 ml) del siero su una piastra bianca;
b) mescolare con un agitatore, prima di linea retta, poi
tracciando dei cerchi del diametro di 10-12 mm circa;
c) agitare la piastra alternativamente per 4 minuti (circa 30
movimenti al minuto);
d) effettuare la lettura della prova in buone condizioni
d'illuminazione: in mancanza di agglutinazione la prova sara'
considerata negativa; qualsiasi grado di agglutinazione va
considerato positivo, salvo quando appare chiara un'eccessiva
essiccazione intorno ai margini.
B. METODO AUTOMATIZZATO.
Il metodo automatizzato deve essere sensibile ed esatto almeno
quanto il metodo manuale.
E. Prova dell'anello di latte, effettuata su plasma sanguigno.
A. PRELIEVO DEL PLASMA SANGUIGNO.
Le provette con il sangue teso non coagulabile mediante aggiunta
di EDTA sono centrifugate per 3 minuti a 3000 giri al minuto e poi
conservate per 12-24 ore a 37 C.
B. IMPOSTAZIONE DIAGNOSTICA.
Si versano 0,2 di plasma stabilizzato in una provetta contenente 1
ml di latte crudo. Dopo aver agitato, si aggiunge una goccia (0,05
ml) di antigene ABR e si agita nuovamente. L'antigene e'
standardizzato rispetto ad un antigene standard messo a disposizione
dall'istituto menzionato al punto A 9 a).
Dopo aver lasciato riposare per 45 minuti ad una temperatura di
37 C, si esamina il risultato entro 15 minuti. La prova e'
considerata positiva se l'anello di latte ha la stessa colorazione o
una colorazione piu' pronunciata di quella della colonna di latte.
F. Agglutinazione del plasma sanguigno.
Il plasma sanguigno ottenuto conformemente al metodo di cui alla
sezione E, punto A, puo' essere utilizzato immediatamente dopo
centrifugazione senza che sia necessario procedere alla
stabilizzazione termica.
Si mescolano 0,05 ml di plasma con 1 ml di antigene per la
sieroagglutinazione al 50%, il che corrisponde ad un titolo di
diluizione 1:20 nel caso della sieroagglutinazione. Si esamina il
risultato dopo aver lasciato riposare per 18-24 ore alla temperatura
di 37 C. La prova e' considerata positiva se l'aggiudicazione e'
uguale o superiore al 50%.
G. Prova di microagglutinazione.
1. Il diluente e' preparato da una soluzione salina fisiologica
0,85% fenicata allo 0,5%.
2. L'antigene preparato nel modo descritto nei punti 6,7 e 8
dell'allegato C, punto A, e titolato nel modo descritto al punto A5
dell'allegato C. Al momento dell'uso dell'antigene si aggiunge
safranina 0 alla 0,02% (diluizione finale).
3. Il siero standard e' lo stesso siero di cui al punto A1
dell'allegato C.
4. La fornitura del siero standard e' assicurata dal
Bundesgesundheitsamt di Berlino.
5. La prova di microagglutinazione utilizza piastre fornite di
pozzetti a fondo conico e della capacita' di 0,250 ml. La prova viene
eseguita nella maniera seguente:
a) prediluizioni dei sieri: a ciascun pozzetto di una piastra
contenente 0,075 ml di diluente si aggiungono 0,050 ml di ogni siero
in esame. Le mescolanze vengono agitate per 30 secondi.
b) Diluizioni scalari dei sieri: per ogni siero preparare almeno
tre diluizioni. A tale scopo a partire dalle prediluizioni (1:2,5) si
prelevano 0,025 ml di ciascun siero e si trasferiscono su una piastra
contenente 0,025 ml di diluizione. In tal modo la prima diluizione
viene portata dal valore di 1:5 e le successive vengono eseguite per
raddoppio.
c) Aggiunta dell'antigene: nei singoli pozzetti contenenti le diverse
diluizioni dei sieri in esame si aggiunge antigene in volume di 0,025
ml. Previa agitazione per 30 secondi le piastre vengono chiuse con i
rispettivi coperchi e poste a 37 C per 20-24 ore in
atmosfera umidificata.
d) Lettura dei risultati: si valuta il quadro della
sedimentazione dell'antigene mediante esame del fondo del pozzetto
riflesso da uno specchio concavo posto al di sotto di esso. Nel caso
di prova negativa l'antigene sedimenta sotto forma di un bottone
compatto, a margini netti e di colore rosso intenso. In caso di
positivita' si forma invece un velo diffuso, di colorito rosa ed
uniformemente distribuito. Le diverse percentuali di agglutinazione
vengono determinate per raffronto con controlli dell'antigene
indicanti 0,25, 50, 75 e 100% di agglutinazione. Il titolo di ciascun
siero viene espresso in UIA/ml. Nella prova e' opportuno inserire
controlli costituiti da siero negativo e siero positivo diluito in
modo da contenere 30 UIA/ml.
H. Il saggio ELISA per la brucellosi bovina come descritto
all'allegato G.