ALLEGATO G
Capitolo I
ALLEVAMENTI, STATI MEMBRI O REGIONI INDENNI DA LEUCOSI BOVINA
ENZOOTICA
A. Allevamento indenne da leucosi bovina enzootica.
1) Un allevamento nel quale:
i) nessun caso di leucosi bovina enzootica sia stato constatato,
clinicamente oppure come risultato degli esami effettuati
conformemente al capitolo II, ne' confermato nel corso degli ultimi
due anni; e
ii) tutti gli animali di eta' superiore ai ventiquattro mesi
abbiano, nel corso dei precedenti dodici mesi, reagito negativamente
a due esami praticati conformemente al presente allegato ad un
intervallo di almeno quattro mesi; e
iii) al termine degli esami di cui al sottopunto ii), si trovino
unicamente gli animali nati in detto allevamento o che provengano da
un allevamento indenne da leucosi bovina enzootica; e nel quale, dopo
la sua qualifica, gli animali di piu' di ventiquattro mesi abbiano
continuato a reagire negativamente ad uno degli esami praticati
conformemente al capitolo II ad un intervallo di tre anni e le
condizioni previste ai punti i) e iii) continuino ad essere
soddisfatte.
2) Un allevamento situato in uno Stato membro o in una regione
indenne da leucosi bovina enzootica.
B. Stato membro o regione indenne da leucosi bovina enzootica.
Uno Stato membro o una regione ai sensi dell'art. 2, lettera o),
di tale Stato membro:
1) nel quale o nella quale:
a) almeno il 99,8% degli allevamenti bovini siano indenni da
leucosi bovina enzootica ai sensi della lettera s), oppure
b) da un lato, durante gli ultimi cinque anni precedenti la
data di notifica della presente direttiva o durante gli ultimi tre
anni successivi a tale data, non sia stato notificato ne' confermato
in alcun modo un caso di leucosi bovina enzootica e, dall'altro, nel
corso degli ultimi due anni,
i) i controlli estemporanei praticati in tutto il territorio
conformemente al capitolo II, effettuati per un periodo di due anni
su tutti gli animali di eta' superiore ai ventiquattro mesi in almeno
il 10% degli allevamenti abbiano dato risultati negativi; e
ii) tutti gli animali di eta' superiore ai ventiquattro mesi
abbiano reagito negativamente almeno una volta ad uno degli esami di
cui al capitolo II;
2) nel quale o nella quale, dopo aver soddisfatto le condizioni
di cui al punto 1):
i) ogni anno, un campione a caso con un tasso di certezza del
99% abbia dimostrato che meno dello 0,2% degli allevamenti era stato
infettato, oppure almeno il 20% di bovini di eta' superiore ai due
anni abbia reagito negativamente ad uno degli esami praticati in
conformita' del capitolo II, e
ii) siano sempre soddisfatti i requisiti di cui al punto A 1).
C. Sospensione della qualifica di indennita' dopo l'insorgere della
leucosi.
1. Se in un allevamento indenne da leucosi bovina enzootica un
animale ha reagito positivamente ad uno degli esami di cui al punto
ii) viene sospesa la qualifica di tale allevamento fino a quando
non vengano adottate le seguenti misure:
i) l'animale che ha reagito positivamente e, se si tratta di una
vacca, l'eventuale vitello debbono abbandonare l'allevamento ed
essere macellati sotto il controllo delle autorita' veterinarie;
ii) gli altri animali debbono essere sottoposti ad un esame
sierologico individuale, che deve dare un risultato negativo,
effettuato conformemente al capitolo II almeno tre mesi dopo
l'eliminazione dell'animale positivo e della sua eventuale
discendenza;
iii) un'indagine epidemiologica deve essere svolta e gli
allevamenti epidemiologicamente collegati all'allevamento infetto
debbono essere sottoposti alle misure di cui al punto ii).
Tuttavia, l'autorita' competente puo' concedere una deroga
all'obbligo della macellazione del vitello di una vacca infetta,
qualora il vitello sia stato separato dalla madre dopo il parto. In
questo caso il vitello e' sottoposto ai requisiti di cui al punto 2)
ii).
2) Se piu' di un animale di un allevamento indenne da leucosi
bovina enzootica ha reagito positivamente, viene sospesa la qualifica
di tale allevamento fino a quando non vengano adottate le seguenti
misure:
i) gli animali infetti e, se si tratta di vacche infette - salvo
deroga concessa dall'autorita' competente a norma del punto 1) iii),
secondo comma -, i loro eventuali vitelli devono abbandonare
l'allevamento ed essere macellati sotto il controllo delle autorita'
veterinarie;
ii) gli altri animali - compresi eventualmente i vitelli degli
animali infetti - di eta' inferiore a sei mesi debbono, previa
identificazione, restare nell'azienda fino a quando non siano
soddisfatte le condizioni relative agli esami di cui al punto A 1)
ii);
iii) l'allevamento deve restare sotto controllo ufficiale fino a
quando non siano nuovamente soddisfatte le condizioni di cui ai punti
A 1) ii) e iii);
iv) d'evessere effettuata un'indagine epidemiologica e gli
allevamenti epidemiologicamente collegati all'allevamento infetto
debbono essere sottoposti alle misure di cui al punto A 1) ii).
3) Se la leucosi bovina enzootica e' stata constatata e
confermata su piu' dello 0,2% degli allevamenti della regione o dello
Stato membro, viene sospesa la loro qualifica e, oltre alle misure di
cui al punto 1) o 2), il 20% degli altri allevamenti della regione o
dello Stato membro deve essere soggetto ad uno degli esami di cui al
capitolo II, entro i termini fissati al punto A 1) ii).
La qualifica viene ripristinata in caso di risultato negativo di
tali esami.
Capitolo II
ESAMI PER LA RICERCA DELLA LEUCOSI BOVINA ENZOOTICA
La ricerca della leucosi bovina enzootica e' effettuata mediante
un'esame di immunodiffusione come descritto nelle lettere A e B o
meidante un saggio di immunoassorbimento anzimatico (ELISA) come
descritto nella lettera C.
L'esame di immunodiffusione e' effettuato solo in esami
individuali.
In caso di contestazione debitamente motivata del risultato degli
esami, si effettua un controllo complementare mediante un esame di
immunodiffusione.
A. Reazione di immunodiffusione su gel di agar.
1. L'antigene da impiegare nella prova deve contenere
glicoproteine del virus della leucosi bovina. Esso va standardizzato
rispetto a un siero di riferimento (siero E 1) fornito dal
laboratorio sierologico veterinario statale danese di Copenaghen.
2. La responsabilita' della standardizzazione degli antigeni di
laboratorio rispetto al siero ufficiale CEE di riferimento (siero E
1) fornito dal laboratorio sierologico veterinario di Stato di
Copenaghen e' affidata ai seguenti istituti:
a) Germania: Bundesforschungsanstaltfur Viruskrankheiten der
Tiere - Tubingen;
b) Belgio: Institut national de recherches veterinaires,
Bruxelles;
c) Francia: Laboratoire national des medicamentes veterinaires,
Fouge'res;
d) Granducato di Lussemburgo;
e) Italia: Istituto zooprofilattico sperimentale, Perugia;
f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling
Rotterdam;
g) Danimarca: Statens Veterinare Serumlaboratorium, Kobenhavn;
h) Irlanda: Veterinary Research Laboratory, Abborstown, Dublin;
i) Regno Unito;
1) Gran Bretagna: The Central Veterinary Laboratory, Weybridge,
England;
2) Irlanda del Nord: The Veterinary Research Laboratory,
Stormont, Belfast;
j) Spagna: Subdireccion general de sanidad animal. Laboratorio
de sanidad i produce animal Algete (Madrid).
k) Portogallo: Laboratorio Nacional de Investigacao Veterinaria,
Lisboa.
3. Gli antigeni standard di laboratorio devono essere presentati
almeno una volta all'anno ai laboratori di riferimento CEE elencati
al paragrafo 2 per essere esaminati in rapporto al siero CEE.
Indipendentemente da detta standardizzazione, l'antigene in uso puo'
essere standardizzato secondo la tecnica descritta alla lettera B.
4. I reattivi da impiegare sono i seguenti:
a) antigene: esso dovra' contenere le glicoproteine specifiche
del virus della leucosi bovina enzootica standardizzato rispetto al
siero ufficiale CEE;
b) siero in esame;
c) siero di controllo riconosciuto positivo;
d) gel di agar
0,8% di agar
8,5 di NaCl
tampone Tris 0,05 M a pH 7,2;
versare 15 ml di questo terreno in una scatola Petri del diametro di
85 mm, in modo da ottenere uno strato dello spessore di 2,6 mm.
5. Nell'agar sul fondo della scatola ricavare sette pozzetti,
esenti da umidita' e distribuiti come segue: un pozzetto centrale e 6
pozzetti disposti in cerchio attorno ad esso; diametro del pozzetto
centrale: 4 mm, diametro dei pozzetti periferici: 6 mm, distanza fra
il pozzetto centrale e i pozzetti periferici: 3 mm.
6. Riempire il pozzetto centrale con l'antigene standard, i
pozzetti periferici 1 e 4 (vedi lo schema) con un siero riconosciuto
come positivo e i pozzetti 2, 3, 5 e 6 con i sieri in esame. Il
riempimento va effettuato fino a scomparsa del menisco.
Parte di provvedimento in formato grafico
7. Le quantita' di reattivi da impiegare sono dunque le seguenti:
antigene: 32 microlitri,
siero di controllo: 73 microlitri,
sieri in esame: 73 microlitri.
8. Incubare per 72 ore a temperatura ambiente (20-27 C), in
atmosfera confinata ed umida.
9. La lettura puo' essere effettuata dopo 24 e 48 ore, ma non e'
possibile ottenere il risultato finale prima di 72 ore.
a) Il siero in esame e' positivo se forma una linea specifica di
precipitine con l'antigine del virus della LBE e una linea completa
di identita' con il siero di riferimento;
b) il siero in esame e' negativo se non forma una linea
specifica di precipitazione con l'antigene della LBE e se non provoca
l'incurvamento della linea del siero di riferimento;
c) la reazione e' considerata non conclusiva:
i) se la linea del siero di riferimento si incurva verso
l'antigene della LBE senza formare con l'antigene una linea di
precipitine visibile, ovvero
ii) se non puo' essere, interpretata come negativa o positiva.
Quando la reazione non e' conclusiva, la prova puo' essere ripetuta e
puo' essere impiegato siero concentrato.
B. Metodo per la standardizzazione dell'antigene.
Soluzioni e materiali necessari:
1. 40 ml di agarosio all'1,6% in tampone Tris/HC1 0,05m a pH 7,2,
contenente l'8,5% di NaCl;
2. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle
sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:10 in
tampone Tris/HCl 0,05m a pH 7,2 contenente l'8,5% di NaCl;
3. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle
sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:5 in
tampone Tris/HCl 0,05m a pH 7,2 contenente l'8,5% di NaCl;
4. 4 scatole Petri in plastica, del diametro di 85 mm;
5. un punzone del diametro di 4-6 mm;
6. antigene di riferimento;
7. antigene da standardizzare;
8. bagnomaria (56 C).
Modo da operare:
Sciogliere l'agarosio (1,6%) nel tampone Tris/HCI, riscaldando
cautamente a 100 C. Mettere in bagnomaria a 56 C per circa 1 ora.
Porre in bagnomaria a 56 C anche le deluizioni di siero della
leucosi bovina.
Mescolare 15 ml della soluzione di agarosio a 56 C con 15 ml di
siero della leucosi bovina (1:10), agitare rapidamente e versare due
porzioni da 15 ml della miscela in due scatole Petri. Ripetere il
procedimento con il siero della leucosi bovina diluito 1:5.
Quando l'agarosio si e' solidificato, praticare i pozzetti secondo
il seguente schema:
Parte di provvedimento in formato grafico
Aggiunta di antigene
I. Scatole Petri 1 e 3:
pozzetto A - antigene di riferimento non diluito,
pozzetto B - antigene di riferimento, diluito 1:2,
pozzetto C + E - antigene di riferimento,
pozzetto D - antigene da controllare, non diluito.
II. Scatole Petri 2 e 4:
pozzetto A - antigene in esame, non diluito,
pozzetto B - antigene in esame, diluito 1:2,
pozzetto C - antigene in esame, diluito 1:4,
pozzetto D - antigene in esame, diluito 1:8.
Istruzioni complementari
1. Per realizzare una precipitazione ottimale, l'esperimento va
effettuato con due diluizioni di siero (1:5 e 1:10).
2. Se il diametro di precipitazione e' troppo piccolo ad ambedue
le diluizioni, il siero va ulteriormente diluito.
3. Se la precipitazione per ambedue le diluizioni e' indistinta e
il diametro e' troppo grande, per il siero va scelta una diluizione
inferiore.
4. La concentrazione finale dell'agarosio deve essere dello 0,8%;
quella dei sieri deve essere rispettivamente del 5% e del 10%.
5. Riportare i diametri misurati sull'accluso sistema di assi
coordinati. La diluzione di lavoro deve corrispondere alla diluzione
dell'antigene sotto prova che ha lo stesso diametro dell'antigene di
riferimento.
Parte di provvedimento in formato grafico
Diluizioni dell'antigene
C. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la ricerca
della leucosi bovina enzootica.
1. Per procedere al saggio ELISA occorrono le attrezzature e i
reattivi qui indicati:
a) micropiastre, cuvette o qualsiasi altro recipiente per la
fase solida;
b) l'antigene e' fissato sulla fase solida con o senza l'ausilio
di anticorpi leganti policlonali o monoclonali. Se la fase solida e'
rivestita direttamente dall'antigene, tutti i campioni in esame che
presentano reazione positiva devono essere riesaminati facendo
riferimento all'antigene di controllo. Nel caso dell'E.B.L.
l'antigene di controllo dovrebbe essere identico all'antigene in
questione, fatta eccezione per gli antigeni del virus della leucosi
bovina. Se gli anticorpi leganti sono distribuiti sulla fase solida,
gli anticorpi non devono reagire ad antigeni diversi da quelli del
virus della leucosi bovina;
c) il fluido biologico da esaminare;
d) controlli positivi e controlli negativi corrispondenti;
e) il coniugato;
f) un substrato adatto all'enzima impiegato;
g) una soluzione di arresto, se necessario;
h) soluzioni per la diluizione dei campioni per la preparazione
dei reattivi e per il lavaggio;
i) un sistema di lettura corrispondente al substrato impiegato.
2. Standardizzazione e sensibilita' della prova:
a) Per la leucosi bovina enzootica la sensibilita' del saggio
ELISA deve essere di livello tale che il siero E4 risulti positivo
quando e' diluito 10 volte (campioni di siero) o 250 volte (campioni
di latte) piu' della diluizione ottenuta da singoli campioni presi
congiuntamente.
Nelle prove in cui i campioni (siero e latte) sono esaminati
individualmente, il siero E4 diluito nella proporzione di 1:10: (nel
siero negativo) o di 1:250 (nel latte negativo) deve presentare una
reazione positiva quando e' esaminato in una diluizione di prova
uguale a quella impiegata per le prove individuali. Gli istituti
ufficiali indicati nel punto A.2 sono responsabili del controllo di
qualita' del metodo ELISA, in particolare per determinare, per ogni
lotto di produzione, il numero di campioni da mettere in comune in
funzione del titolo ottenuto per il siero E4.
Il siero E4 e' fornito dal laboratorio veterinario nazionale di
Copenaghen.
b) Per la brucellosi:
1) i campioni di latte sfuso vengono classificati negativi se
danno una reazione inferiore al 50% di quella data da una diluizione
1:10.000 del secondo siero standard internazionale della brucellosi
diluito in latte negativo;
2) i campioni singoli di siero vengono classificati negativi se
danno una reazione inferiore al 10% di quella data da una diluizione
di 1:200 del secondo siero standard internazionale della brucellosi
diluito in soluzione salina o qualsiasi altra soluzione riconosciuta
secondo la procedura prevista all'articolo 12 previo parere del
Comitato scientifico veterinario. Gli standard ELISA della brucellosi
devono essere quelli specificati nell'allegato C, punti A.1 e A.2 (da
usare alle diluizioni indicate sull'etichetta).
3. Condizioni di impiego del saggio ELISA per la ricerca della
leucosi bovina enzootica e della brucellosi bovina:
Il metodo ELISA puo' esser utilizzato su un campione di latte o
di siero prelevato dal latte proveniente da un'azienda in cui almeno
il 30% delle vacche da latte sono in lattazione.
In caso di ricorso alla facolta' precitata devono essere prese
misure per assicurare una corrispondenza tra i campioi prelevati e
gli animali da cui provengono il latte o i sieri esaminati.
In caso di risultato positivo su uno dei campioni, sono
applicabili le disposizioni previste nell'allegato A, capitolo II,
punto A1 c) i) per quanto concerne la brucellosi bovina e nel
presente all'allegato, capitolo I, punto A1 per quanto concerne la
EBL.