ALLEGATO D 
 
                            PESTE EQUINA 
                              DIAGNOSI 
                     Fissazione del complemento 
 
L'antigene si ottiene dalle cervella di una cavia di un mese di eta',
sottoposta ad inoculazione intracerebrale di un ceppo neurotropo  del
virus, secondo il metodo di Bourdin qui descritto: 
  congelare le cervella e frantumarle in uno  stabilizzatore  Veronal
nella proporzione  di  10  cervella  per  12  ml  di  stabilizzatore.
Centrifugare la  sospensione  cosi'  ottenuta  per  un'ora  a  10.000
giri/min, ad una temperatura  di  4°C.  Il  supernatante  costituisce
l'antigene.  Viene   preferibilmente   utilizzato   senza   ulteriori
modificazioni  ma  puo'  essere  inattivato  con  beta-propiolattone.
L'inattivazione puo'  essere  ottenuta  aggiungendo  0,1  ml  di  una
soluzione al 3 % di beta-propiolattone in acqua distillata per 0,9 ml
di antigene ed agitando la miscela per 3 ore a  temperatura  ambiente
in una cappa ventilata e per 18 ore a 4°C.  E'  ugualmente  possibile
utilizzare il metodo Casals [(Casals J. (1949)]. 
In mancanza di un siero standard  internazionale,  l'antigene  dovra'
essere  titolato  nei  confronti  di  un  siero  campione   positivo,
preparato localmente. 
I sieri debbono essere riscaldati per 30 minuti a 60°C.  Per  evitare
effetti anticomplementari, il siero dovra' essere separato dal sangue
non appena possibile, in particolare il siero di asino. Per  il  test
si dovranno utilizzare sieri campione positivi e negativi. 
E' possibile utilizzare sia una macrotecnica che una microtecnica, in
entrambi i casi, il punto finale sara' un'emolisi del 50 %. 
Ad un volume di doppie diluizioni di siero, si aggiunga un volume  di
antigene, come indicato dalla titolatura  in  modo  da  ottenere  due
unita'. Miscelare e lasciare per 15 minuti a temperatura ambiente. 
Aggiungere  due  volumi  di  complemento  contenenti  cinque  unita',
miscelare, coprire i  piatti  e  lasciarli  per  18  ore  a  4°C.  Il
complemento dovra' essere titolato in presenza di  un  antigene,  per
tener  conto  di  tutti  gli  effetti  anticomplementari.  Dopo  aver
lasciato i  piatti  per  altri  15  minuti  a  temperatura  ambiente,
aggiungere un volume di eritrociti ovini sensibilizzati, diluiti al 3
%. Miscelare e mantenere  in  incubazione  a  37  C  per  30  minuti,
miscelando di nuovo ogni 15 minuti di incubazione. Se  si  utilizzano
piatti, centrifugarli per 5 minuti a 1500 giri/min a 4°C.