SCHEMA DI MONITORAGGIO
PER IL VIRUS DELLA TRISTEZZA DEGLI AGRUMI
A) METODOLOGIA DI CAMPIONAMENTO.
La metodologia di campionamento di seguito proposta e' mirata ad
accertamenti individuali nel caso di piante madri e ad accertamenti a
campione nel caso di vivai e di impianti commerciali.
Le indagini sistematiche dovranno riguardare le collezioni
scientifiche e i giardini pubblici e privati; i vivai di piante di
agrumi da frutto e ornamentali; gli impianti commerciali.
1. Collezioni scientifiche, giardini pubblici, privati.
* Redigere una mappa che consenta la rapida individuazione delle
piante di agrumi esistenti, specificandone la specie e la cultivar.
Nel caso di specie esotiche accertarne la provenienza.
* Prelevare dalle quattro esposizioni di ciascuna pianta un
campione costituito da quattro rametti con corteccia verde (cm. 10
circa) e conservare a 4 C fino al momento del saggio.
* Ciascun campione dovra' essere saggiato singolarmente in due
pozzetti ELISA.
* Nel caso di infezioni da CTV:
a) estirpare e bruciare le piante infette;
b) sospendere il prelievo di marze delle altre piante presenti
nel campo per un periodo di almeno tre anni ripetendo i saggi ogni
anno;
c) controllare le altre piante di agrumi presenti nei campi
adiacenti;
d) individuare eventuali distribuzioni di materiale di
propagazione prelevato da piante infette a vivaisti, privati, ecc.
2. Vivai di piante da frutto e ornamentali.
2.1. Piante madri.
* Redigere una mappa e saggiare individualmente tutte le piante,
prelevando campioni costituiti da quattro rametti/pianta (vedi punto
1).
* Nel caso si rinvenissero piante madri infette:
a) estirpare e bruciare le piante infette;
b) sospendere il prelievo di marze delle altre piante presenti
nel campo per un periodo di almeno tre anni ripetendo i saggi ogni
anno;
c) saggiare i semenzali di portinnesti e le piante in piantonaio
e in nestaio ottenute per propagazione (diretta o indiretta) da
piante risultate infette. Allo scopo, operare su campioni compositi
costituiti da cinque rametti (un rametto/pianta). Saggiare ciascun
campione in un pozzetto ELISA. Nel caso di campioni infetti,
estirpare e bruciare le cinque piante che costituiscono il campione;
d) individuare le aziende che hanno acquistato piante della
stessa specie, cultivar e partita rinvenute infette e saggiare almeno
il 10% delle piante.
2.2 Piante destinate alla vendita.
* Effettuare controlli a campione iniziando dai lotti di piante di
cui non sono identificate le piante madri.
* Per ciascun lotto omogeneo di 2.500 piante prelevare, in modo
ordinato, 25 campioni (un rametto/pianta), riunire i rametti in
gruppi di cinque e saggiare i 5 campioni ottenuti, ciascuno in un
pozzetto ELISA (5 pozzetti ELISA per ciascun lotto di 2.500 piante).
* Nel caso si dovessero accertare infezioni da CTV:
a) estirpare e distruggere l'intero lotto;
b) estendere i saggi ai lotti vicini, per accertare un'eventuale
diffusione naturale.
3. Agrumeti commerciali.
* Su una carta delle coltivazioni agrumicole individuare gli
appezzamenti da saggiare (due ettari circa ogni dieci ettari di
superficie).
* Prelevare ordinatamente un rametto/pianta da 100 piante ubicate
sul confine dell'appezzamento prescelto.
* Riunire i rametti a gruppi di cinque in modo da costituire venti
campioni/appezzamento, saggiare i campioni in pozzetti singoli (venti
pozzetti per ciascun appezzamento di due ettari).
* Nel caso di infezioni da CTV:
a) saggiare individualmente le cinque piante comprese nel
campione infetto;
b) estirpare e bruciare le piante infette;
c) intensificare le indagini nell'appezzamento prelevando altri
50 campioni (due rametti/campione). Se le piante infette superano il
30% estirpare l'intero appezzamento.
B) DIAGNOSI DI CITRUS TRISTEZA VIRUS MEDIANTE TEST DAS-ELISA
(double antibody sandwich Enzyme Linked Immunosorbent
Assay).
Il monitoraggio per il virus della tristezza degli agrumi (CTV)
andra' eseguito sottoponendo a test immunoenzimatici (ELISA) campioni
di corteccia di giovani rametti ancora verdi, prelevati nel periodi
maggio-giugno e settembre-ottobre, allorche' le temperature medie
sono comprese fra 18 e 22 C. I saggi immunoenzimatici saranno
confermati, ove occorra, dai saggi biologici.
Per le finalita' dell'indagine si raccomanda di utilizzare
antisieri policlonali di provata affidabilita'.
- Diluire l'anticorpo nel tampone (coating buffer) alla
diluizione raccomandata.
- Disporre 200 (Micron(l di questa preparazione per pozzetto.
- Coprire la piastra e porla ad incubare per 4 ore a 37 C.
- Lavare la piastra con tampone di lavaggio (PBS-T) per 3 volte.
- Preparare gli estratti vegetali di ciascun campione da
saggiare, piu' un campione di controllo negativo ed uno di controllo
positivo come di seguito descritto:
- prelevare la corteccia verde dai giovani rametti;
- ridurre i tessuti in pezzetti minuti mediante un bisturi e
porli in una provetta;
- aggiungere tampone di estrazione nel rapporto 1/10 w/v (1 g di
tessuto/10 ml di tampone;
- estrarre il succo vegetale mediante un omogeneizzatore
cinematico (tipo Ultraturrax);
- filtrare il succo attraverso garza.
- Disporre 200 (Micron(l di estratto vegetale per ciascun
pozzetto.
- Incubare per una notte a 4 C.
- Lavare la piastra con tampone di lavaggio (PBS-T) per 3 volte.
- Diluire l'anticorpo coniugato con fosfatasi alcalina nel
tampone (Conjugate buffer) alla diluizione raccomandata.
- Disporre 200 (Micron(l della preparazione in ciascun pozzetto
- Coprire la piastra e porla ad incubare per 2-4 ore a 37 C.
- Lavare la piastra con tampone di lavaggio (PBS-T) per 3 volte.
- Sciogliere il substrato PNP (para-nitro-fenilfosfato) nel
tampone (substrate buffer) alla diluizione di 1 mg/1 ml.
- Disporre 200 (Micron(l di questa preparazione per ciascun
pozzetto
- Incubare a temperatura ambiente per 30-60 minuti.
- Aggiungere in ciascun pozzetto 50 (Micron(l di NaOH 3 M.
- La valutazione dei risultati puo' essere fatta:
a) visivamente: entro 60 minuti dalla distribuzione della
soluzione di substrato i pozzetti corrispondenti al testimone infetto
assumono progressivamente una colorazione gialla, mentre quelle del
testimone sano rimangono incolori;
b) allo spettrofotometro: entro 60 minuti dalla distribuzione
del substrato si confrontano i valori di assorbanza a 405 nm.
Si considerano positivi tutti i campioni che hanno un valore di
assorbanza pari al doppio del valore medio di assorbanza dei
controlli sani.
Tampone di lavaggio (PBS-T).
Sciogliere in 1000 ml di acqua distillata:
Sodio cloruro (NaC1) 8 g;
Sodio fosfato bibasico anidro (Na2HPO4) 1,15 g;
Sodio fosfato monobasico (KH2PO4) 0,2 g;
Potassio cloruro (KC1) 0,2 g;
Sodio azotidrato (NaN3) 0,2 g;
Tween - 20 0,5 g;
Correggere il pH a 7,4.
Tampone per anticorpo (coating Buffer).
Sciogliere in 1000 ml di acqua distillata:
Sodio carbonato (Na2CO3) 1,59 g;
Sodio bicarbonato (NaHCO3) 2,93 g;
Sodio azotidrato (NaN3) 0,2 g.
Correggere il pH a 9,6.
Conservare a 4 C.
Tampone di estrazione.
Sciogliere in 1000 ml di tampone di lavaggio (PBS-T):
polivinilpirrolidone (PVP) MW 24-40.000 20 g.
Conservare a 4 C.
Tampone per coniugato (conjugate buffer).
Sciogliere in 1000 ml di tampone di lavaggio (PBS-T):
polivinilpirrolidone (PVP) MW 24-40.000 20 g;
albumina bovina da siero (BSA) 2 g.
Conservare a 4 C.
Tampone per substrato (Substrate buffer).
Dietanolammina 97,0 ml.
Acqua distillata 800,0 ml.
Sodio azotidrato (NaN3) 0,2 g.
Correggere il pH a 9,8 con HC1 concentrato.
Portare il volume finale a 1000 ml con acqua distillata.
Conservare a 4 C.
C) SAGGIO BIOLOGICO.
1. Piante indicatrici.
* Semenzali di limetta messicana (Citrus aurantifolia (Christm.
Swing) per la diagnosi di tutti i componenti di CTV.
* Semenzali di arancio amaro (Citrus aurantium L.) per la
caratterizzazione di isolati di giallume dei semenzali (seedling
yellows).
* Semenzali di pompelmo (Citrus paradisi Macf.) o di arancio dolce
(Citrus sinensis) (L. Osbeck) cv. Madame Vinous per la
caratterizzazione di isolati di butteratura del legno (stem pitting).
2. Modalita' di inoculazione.
* Innestare nella parte basale della pianta indicatrice 2-3
porzioni di corteccia prive di gemme prelevate dalla pianta da
saggiare.
* Eliminare la maggior parte delle foglie basali.
* Capitozzare l'indicatrice a 25-30 cm di altezza dal suolo.
* Dopo 3 settimane dall'inoculazione accertarsi che le gemme
innestate siano vive.
3. Condizioni di allevamento.
* Le piante devono essere allevate in un terriccio idoneo ad
assicurare una crescita vigorosa e continua ed essere prive di
carenze e di infezioni dell'apparato radicale che potrebbero
mascherare i sintomi.
* Per tutta la durata del saggio le piante devono essere allevate
in serra termocondizionata opportunamente chiusa con rete a prova di
insetto.
* La temperatura max diurna deve essere compresa fra 24 e 28 C.
* La temperatura min notturna deve essere compresa fra 17
e 21 C.
4. Manifestazione dei sintomi.
* Sull'indicatrice limetta messicana i primi sintomi compaiono
dopo 3-5 settimane dall'inoculazione; la malattia si manifesta sulle
foglie con aree decolorate delle nervature (vein clearing) e nei casi
di isolati molto virulenti con suberificazione delle nervature (vein
corking); dopo 2-3 mesi asportando la corteccia dai rametti della
nuova vegetazione si osserva la butteratura del legno (stem pitting).
* Su arancio amaro i sintomi di giallume dei semenzali si
manifestano dopo 10 settimane dall'inoculazione; la malattia induce
riduzione di sviluppo, nanismo, le foglie sono piu' piccole del
normale e di colore giallo.
* Su pompelmo o arancio dolce Madame Vinous la butteratura del
legno si manifesta entro quattro mesi dall'inoculazione, la gravita'
delle scanalature e' da correlare alla virulenza del ceppo.