ALLEGATO 1
(previsto dall'art. 1, comma 1, lettera g))
METODI DIAGNOSTICI PER LA CONFERMA DELLA DIAGNOSI DIFFERENZIALE DELLA
PESTE SUINA CLASSICA.
A prescindere dal periodo necessario per lo sviluppo degli
anticorpi, per quanto riguarda i metodi diagnostici della peste suina
classica (CSF) sono stabiliti le linee direttrici, gli standard ed i
criteri minimi seguenti.
A. RACCOLTA DEI MATERIALI DIAGNOSTICI.
1. Per isolare il virus ed evidenziare l'antigene si considerano
essenziali i tessuti delle tonsille e della milza. E' meglio
prelevare almeno altri due campioni di tessuti linfatici, quali i
linfonodi retrofaringei, parotidei, mandibolari o mesenterici nonche'
l'ileo e il rene. Ogni campione di tessuto e' posto in una busta di
plastica separata, sigillata ed etichettata. I campioni sono
trasportati e conservati in contenitori ermetici. Essi non sono
congelati, bensi' tenuti freschi a temperatura di frigorifero e
saggiati sollecitamente.
2. Per l'isolamento del virus dai leucociti devono esser prelevati
campioni di sangue da suini con sintomi febbrili o di altro tipo.
Come anticoagulanti si usano EDTA o eparina. I campioni sono
mantenuti freschi a temperatura di frigorifero e sottoposti agli
esami di laboratorio senza indugio.
3. I campioni di sangue per evidenziare gli anticorpi quale
supporto diagnostico di focolai clinici ed a scopo di sorveglianza
sono prelevati da animali che siano guariti da sospetta infezione e
da suini noti per essere stati in contatto con casi infetti o
sospetti. In tali allevamenti sospetti devono essere presi come
campione tutti i primi 20 animali sospetti o in contatto ed il 25%
degli altri animali. Per individuare con molta probabilita' gli
anticorpi si prelevano contemporaneamente campioni da ogni unita'
dell'allevamento.
B. DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLA PESTE SUINA CLASSICA.
Il punto di partenza nella diagnosi di CSF di laboratorio e'
l'individuazione dell'antigene virale, del virus e degli anticorpi
negli organi o nei fluidi tissutali.
In caso di risultati non probanti, si ripetono gli esami sugli
stessi campioni. Se continuano ad esserci sospetti clinici, si devono
prelevare ulteriori campioni della stessa origine.
In casi di sospetta CSF si possono usare, come supporto
diagnostico, esami sierologici per evidenziare gli anticorpi. Se non
si e' riusciti a individuare l'antigene virale od isolare il virus
del materiale prelevato da animali sospetti di CSF o proveniente da
allevamenti che hanno avuto contatto con casi di CSF, si fanno esami
per evidenziare anticorpi sui campioni di sangue degli animali
guariti da sospetta malattia di quelli noti per essere stati in
contatto con la malattia stessa.
1. Ricerca dell'antigene virale.
Per la ricerca dell'antigene virale in tessuti d'organo si deve
impiegare la tecnica di immunomarcatura diretta su sezioni al
criostato (sino a cinque micron) delle tonsille e degli altri organi
specificati in A 1. Il reagente per la diagnosi deve essere in
antisiero pestivirus-specifico policlonale del virus CSF, marcato con
un fluorocromo, un enzima, o biotina, secondo i criteri seguenti:
a) il siero iperimmune e' preparato da suini esenti da infezione
il siero dei quali e' privo di anticorpi che possano influire sulla
specificita' o qualita' della reazione;
b) l'immunoglobulina marcata preparata dal siero suino
iperimmune dalla CSF come specificato sotto a) deve avere un titolo
minimo di 1/20 determinato in colture cellulari infettate con il
virus CSF e confermato da esami di controllo su sezioni di tessuto.
La diluizione d'uso del coniugato deve combinare un massimo di
segnale con un minimo di colorazione di fondo.
Ogni campione che mostri una reazione citoplasmica specifica e'
considerato positivo per pestivirus; in tali casi si devono
effettuare ulteriori esami come descritto in B3.
2. Isolamento ed identificazione del virus in colture cellulari.
a) L'isolamento del virus da campioni di tessuto si effettua su
colture cellulari sensibili di PK 15 o su altre linee cellulari
parimenti sensibili. Le sospensioni d'organo di un animale sospetto
devono essere inoculate ad una diluizione di 1/10.
b) L'isolamento del virus da campioni di sangue, raccolti e
trattati come indicato nel paragrafo A2, si effettua inoculando sulle
colture cellulari la sospensione del "buffy coat" ricostituita sino
al volume ematico originale.
c) Per evidenziare l'antigene virale nel citoplasma dei
monostrati, si devono trattare la colture cellulari con antisiero
policlonale marcato. Si deve applicare il colorante ad intervalli da
24 a 72 ore dal momento dell'inoculazione.
d) Le colture cellulari positive devono essere sottoposte agli
esami di diagnosi differenziale come specificato in B3. Risultati
negativi dopo il primo passaggio su coltura cellulare possono
richiedere un secondo od anche piu' passaggi per l'isolamento del
virus.
3. Tipizzazione dei virus pestosi isolati, con anticorpi
monoclonali.
a) Si devono esaminare ulteriormente, mediante anticorpi
monoclonali marcati, i duplicati delle sezioni al criostato di
tessuti o le colture cellulari che danno reazioni positive
all'antisiero policlonale, come descritto in B 1 e 2, al fine di
differenziare tra il virus CSF ed i virus diarrea virale del bovino
(BVD)/border disease (Bd).
b) Si devono usare solo i monoclonali ufficialmente raccomandati
dal laboratorio di riferimento CE per la peste suina classica.
c) I monoclonali devono essere suddivisi in quattro gruppi
secondo i criteri seguenti:
Numero del gruppo Reattivita'
1 Tutti i virus pestosi
2 Tutti i virus CSE
3 Ceppi vaccinali CSF
4 Tutti i virus BVD/BD
Ogni gruppo puo' essere rappresentato o da un singolo monoclonale
o da una miscela di anticorpi monoclonali, a condizione che lo
spettro di reattivita' corrisponda a quello di cui sopra.
d) L'interpretazione degli schemi di reazione e' cosi' riassunta:
Gruppi Interpretazione
1 2 3 4
+ + - - CSF confermata
+ + + - CSF ceppo vaccinale
+ - - + virus BVD/BD
+ - - -
+ + - + virus non classificato, necessitano
ulteriori esami
+ + + +
- - - -
C. RICERCA DEGLI ANTICORPI DEL VIRUS DELLA PESTE SUINA CLASSICA.
La ricerca degli anticorpi del virus CSF in campioni di sangue
viene effettuata per agevolare la diagnosi di peste suina in
allevamenti comprendenti suini con sintomi clinici di malattia o su
suini sospetti di aver avuto contatti con suini infetti. Puo' essere
effettuata anche a scopo di sorveglianza o per indagini in
allevamenti il cui stato sanitario non e' noto.
Per questi scopi, i campioni di sangue devono essere sottoposti ad
un test approvato.
I test seguenti sono approvati per l'uso e devono essere
effettuati congiuntamente a controlli con sieri positivi e negativi.
I ceppi virali da usare per i test sierologici devono essere
autorizzati in una riunione dei laboratori nazionali per la peste
suiina (NSFL) e rilasciati a questi ultimi, dietro loro richiesta,
secondo quanto disposto dal laboratorio di riferimento CE per la
peste suina classica.
Tutti i test utilizzati devono dare risultati soddisfacenti con i
sieri CSF di riferimento, forniti dal laboratorio di riferimento CE
per la peste suina classica.
1. Test di virus-neutralizzazione.
Questo test si basa sulla determinazione della soglia 50%. Miscele
di diluizione di siero e quantita' costanti di virus, dopo uno
specificato periodo d'incubazione a 37 C, vengono inoculate nelle
colture. I risultati si basano sull'assenza di replicazione del
virus, ricercata con un sistema di immunomarcatura. Si possono usare
sia la prova di immunofluorescenza-neutralizzazione (NIF), sia quella
degli anticorpi neutralizzanti perossidasi-coniugati. Il laboratorio
di riferimento CE per la CSE fornira', su richiesta, protocolli
dettagliati.
A scopi di screening i sieri vengono inizialmente diluiti a 1/10.
Quando e' necessaria una titolazione completa, si preparano
diluizioni doppie del siero partendo da 1/10. Ogni diluizione viene
miscelata con ugual volume di una soluzione virale contenente 100
(+/- 0,5 logfB01210) dosi infettanti (TCID 50).
Per ogni livello di diluizione si utilizzano almeno due colture.
Dopo un appropriato periodo di incubazione le colture cellulari
vengono fissate e si ricerca l'antigene virale con un sistema di
immunomarcatura. I risultati vengono espressi come reciproco della
diluizione iniziale di siero, a cui corrisponde assenza di marcatura
specifica nella meta' delle colture cellulari inoculate. Il punto di
estinzione viene calcolato a meta' tra due livelli di diluizione.
2. Prova di immunoassorbimento enzima-coniugato (ELISA).
Si possono usare prove di competizione, di blocco ed indirette su
ogni supporto idoneo.
Si raccomanda che i test usati minimizzano le reazioni crociate
con il virus BVD ed altri pestivirus. Tuttavia i test devono
garantire l'identificazione di tutte le infezioni da CSF, ed a tutti
gli stadi di risposta immunitaria all'infezione.
Antigene.
L'antigene deve essere ricavato o corrispondere alle proteine
virali di uno dei ceppi virali CSF raccomandati. Le cellule usate per
preparare l'antigene devono essere idenni da ogni infezione da
pestivirus.
Antisieri.
I sieri policlonali per le prove di competizione o di blocco
devono essere ottenuti da suino o conigli infettati con uno dei cippi
di virus CSF raccomandati o con il ceppo lapinizzato C. Gli anticorpi
monoclonali devono essere attivi contro o corrispondere ad una
proteina virale immunodominante del virus CSF. Le prove indirette
devono utilizzare un reattivo immunoglobulinico anti-suino che rivela
sia le IgG che le IgM.
La sensibilita' dell'ELISA deve essere tale da registrare come
positivo ogni siero che reagisce al test di neutralizzazione, nonche'
i sieri positivi di riferimento forniti dal laboratorio di
riferimento CE per la CSF.
L'ELISA puo' essere usato solo con siero ottenuto da campioni di
plasma presi da singoli suini.
Se la procedura ELISA usata non e' specifica per la CSF, i
campioni positivi devono essere esaminati ulteriormente con i test
differenziali specificati nella sezione E.
D. VALUTAZIONE DEI RISULTATI DEGLI ESAMI DI LABORATORIO
1. L'individuazione dell'antigene virale CSF nei tessuti d'organo
o nelle colture di cellule, dopo isolamento del virus dai campioni di
tessuto con le tecniche definite un B 1, 2 e 3, costituisce la base
della conferma della presenza della malattia, eccettuato nei casi di
reazione dimostrate come dovuta a virus vaccinale, come specificato
in B 3. La dimostrazione di antigene BVD/BD, secondo B 3, elimina il
sospetto di CSF, purche' non sussistano altre base per tale sospetto.
A seguito di risultati inusuali o inaspettati della tipizzazione
monoclonale secondo B 3, i pestivirus isolati devono essere
considerati come inclassificati, e l'allevamento di origine deve
essere ritenuto sospetto fino ad ulteriori esami. Questi possono
comprendere la trasmissione del virus ad un laboratorio di
riferimento per la caratterizzazione e ricerche sierologiche
sull'allevamento di origine.
2. A seguito di rinvenimento di anticorpi reagenti con il virus
CSF, l'allevamento di origine e' ritenuto sospetto:
a) al fine di escludere il sospetto di CSF originatosi dal
rinvenimento di anticorpi, si usa il test descritto nel successivo
capitolo E per distinguere tra anticorpi reagenti alla CSF che
possono essere stati indotti da altri pestivirus ed anticorpi dovuti
realmente al virus CSF. si devono risaggiare con il test
differenziale tutti i campioni originali;
b) se al primo test differenziale non si puo' escludere il
sospetto, si deve effettuare un ulteriore test almeno 30 giorni dopo,
per eseguire la possibile diffusione dell'infezione. Nell'azienda
sospetta occorre prelevare campioni da tutti i primi 20 animali e dal
25% dei rimanenti.
3. Interpretazione dei risultati sierologici.
Un titolo neutralizzante 10 in tutti i suini unito ad aspetti
clinici o epizootologici originanti sospetto di malattia costituisce
una diagnosi positiva. Un titolo 1/10 in tutti i suini senza aspetti
clinici ed epizootologici da' origine al sospetto di malattia e deve
essere seguito da procedimenti diagnostici differenziali.
Gli stessi criteri devono essere applicati ad ogni suino positivo
all'ELISA.
E. PROCEDURE SIEROLOGICHE PER LA DIAGNOSI DIFFERENZIALE TRA PESTE
SUINA CLASSICA ED ALTRI PESTIVIRUS.
1. I test per la diagnosi differenziale tra CSF ed altre infezioni
da pestivirus si basano sull'esame in parallelo dei sieri con ceppi
virali sia di CSF sia di BVD/BD, usando metodi totalmente
compatibili.
I ceppi virali CSF e BVD/BD da usare devono essere stati
ufficialmente approvati (vedi sopra sub C). Per escludere il sospetto
di CSF originatosi dalla scoperta di anticorpi, i campioni di sangue
devono essere esaminati mediante titolazioni comparative delle soglie
degli anticorpi neutralizzanti anti virus CSF e virus BVD/BD.
Nell'ELISA di blocco, si deve utilizzare il confronto tra le
percentuali di blocco con antigeni CSF e con antigeni BVD/BD.
2. I risultati dei test sierologici comparativi, usando ceppi di
riferimento di CSF e di altri pestivirus, devono essere interpretati
come segue:
a) se i test comparativi mostrano che piu' di un suino possiede
anticorpi del virus CSF senza anticorpi degli altri pestivirus, il
risultato viene considerato positivo per CSF;
b) se i test comparativi mostrano che i titoli per il virus CSF
sono uguali o maggiori dei titoli per gli altri pestivirus in piu' di
un suino, allora c'e' sospetto di CSF e la differenziazione e'
eseguita come segue:
- i suini aventi titoli neutralizzanti antivirus CSF maggiori o
uguali ai titoli anti altri pestivirus sono macellati. I loro tessuti
e, se del caso, i loro feti, sono esaminati per la ricerca di
antigene o virus della CSF, secondo la procedura definita in B 1, 2 o
3;
- se si rinviene antigene virale o virus della CSF, la CSF sara'
confermata;
- se la ricerca definita nel soprastante secondo trattino non
rileva la presenza di antigene o virus della CSF, l'azienda e'
considerata come sospetta finche' un ulteriore gruppo di campioni di
sangue, prelevati almeno 30 giorni dopo, non sia stato sottoposto a
nuovi test comparativi;
- se questi successivi test comparativi mostrano che tutti gli
animali hanno titoli significativamente piu' alti (quattro volte o
piu') contro il virus BVD/BD rispetto al virus CSF, il sospetto e'
eliminato;
- se uno o piu' animali mostrano un titolo contro il virus CSF
uguale o maggiore del titolo contro il virus BVD/BD, il risultato
viene considerato positivo per CSF;
c) se i titoli BVD/BD sono tali da non escludere la possibilita'
di CSF, l'azienda e' considerata come sospetta e nuovamente esaminata
dopo almeno 30 giorni.
F. DIAGNOSI DIFFERENZIALE DELLA PESTE SUINA AFRICANA.
La ASF non puo' essere differenziata dalla peste suina classica
mediante esami clinici o esami post mortem e nella diagnosi
differenziale di ogni sindrome acuta febbrile emorragica dei suini
devono essere prese in considerazione entrambe queste malattie.
Gli esami di laboratorio sono essenziali per la distinzione tra le
due malattie. Una diagnosi positiva in una paese indenne da ASF deve
essere basata sull'isolamento e sull'identificazione del virus ASF.
Il punto di partenza nella diagnosi di laboratorio di ASF deve
essere l'individuazione del virus, dell'antigene virale o degli
anticorpi negli organi e nei fluidi tissutali.
In caso di risultati non probanti o negativi due esami su campioni
provenienti da animali sospetti di ASF o con materiale proveniente da
allevamenti che hanno avuto contatti con casi di ASF, deve essere
prelevato ulteriore materiale nello stesso allevamento e dagli
animali che sono stati in contatto con suini infetti.
1. Ricerca dell'antigene virale.
Per la ricerca dell'antigene virale si applicano la tecnica
dell'immunofluorescenza diretta o altre tecniche utili, su sezioni
sottili di criostato di tessuti d'organo, su strisci o su sedimenti
da colture di leucociti. Le procedure sono simili a quelle descritte
per la CSF, tranne il fatto che si usano reagenti specifici per la
ASF.
2. Isolamento ed identificazione del virus:
a) test di emoassorbimento (HAD).
Lo HAD test viene effettuato inoculando in colture primarie di
leucociti suini le sospensioni al 10% di tessuti o il sangue
prelevato sul campo da suini sospetti, oppure allestendo colture di
leucociti da sangue di suini febbricitanti inoculato in laboratorio o
da sangue prelevato sul campo. L'emoassorbimento consiste
nell'adesione di un gran numero di eritrociti suini sulla superficie
delle cellule infette e conferma la diagnosi di ASF;
b) inoculazione del suino.
Si fa un pool con aliquote di ogni sospensione di tessuto al 10% e
se ne inoculano intramuscolo 2 ml a capo in quattro suini; due di
questi debbono essere stati vaccinati contro la CSF e due non
vaccinati. I suini dovranno essere esaminati giornalmente per 21
giorni, per valutare un eventuale innalzamento della temperatura
rettale e l'insorgenza di sintomi clinici. Se si sviluppa febbre
devono essere prelevati campioni di sangue onde allestire colture di
leucociti per lo HAD test ("autorosette" ed inoculazione di colture
primarie di leucociti suini). Se non si sviluppano sintomi clinici,
si deve prelevare del sangue per la ricerca di anticorpi dopo un
periodo di osservazione di 21 giorni.
G. RICERCA DI ANTICORPI INDOTTI DAL VIRUS ASF IN CAMPIONI DI SANGUE
E NEI FLUIDI TISSUTALI.
La ricerca di anticorpi in campioni di siero o di fluidi tissutali
viene effettuata per agevolare la diagnosi di ASF in allevamenti
comprendenti suini con sintomi clinici che fanno sospettare la
malattia o sui suini sospetti di aver avuto contatto con suini
infetti da ASF. Puo' essere effettuata anche a scopo di sorveglianza
o per indagini in allevamenti il cui stato sanitario non e' noto.
Per questi scopi, i campioni devono essere sottoposti ad un test
approvato.
I test che seguono sono approvati e debbono essere effettuati
congiuntamente ad appropriati controlli con sieri positivi e
negativi:
a) test di immunofluorescenza indiretta (ILF);
b) ELISA.