ALLEGATO III
METODI DIAGNOSTICI PER LA CONFERMA E LA DIAGNOSI DIFFERENZIALE
DELLA MALATTIA DI NEWCASTLE
I metodi per isolare e individuare i virus della malattia di
Newcastle, descritti qui di seguito, devono essere considerati come
orientamenti e criteri minimi da applicare nella suddetta diagnosi.
Il virus responsabile della malattia di Newcastle e' il virus
prototipo appartenente alla famiglia della Paramyxoviridae.
Attualmente vi sono nove gruppi sierologicamente distinguibili di
Paramixovirus aviare, designati con le sigle PMV-1 fino a PMV-9.
Tutti i virus della malattia di Newcastle sono stati assegnati al
gruppo PMV-1. Ai fini delle procedure diagnostiche per la conferma e
la diagnosi differenziale della malattia di Newcastle si applica la
seguente definizione:
per malattia di Newcastle si intende un'infezione dei volatili
causata da un ceppo aviare del Paramixovirus 1 con un indice di
patogenicita' intracerebrale (ICPI) superiore a 0,7 nei pulcini di un
giorno.
Capitolo 1
Campionatura e trattamento dei campioni
1. CAMPIONI
Frammenti prelevati mediante tampone nell'intestino (o feci) e
nella trachea di volatili malati; feci o contenuti degli organi
(intestino, tessuti cerebrali, trachea, polmoni, fegato, milza e
altri) dell'animale malato, prelevati da volatili morti di recente.
2. TRATTAMENTO DEI CAMPIONI
Gli organi e i tessuti menzionati al paragrafo 1 sopra elencati
possono essere trattati insieme, salvo per quanto riguarda le feci,
per le quali e' essenziale un trattamento separato. I materiali
prelevati devono essere immersi completamente in un quantitativo
sufficiente di antibiotico. I campioni di feci e gli organi devono
essere omogeneizzati (in un miscelatore chiuso o in un mortaio con
pestello e sabbia sterile) in un mezzo antibiotico e portati in
sospensione in tale mezzo al 10-20% p/v. Le sospensioni devono essere
lasciate riposare per circa due ore a temperatura ambiente (o per un
intervallo superiore a 4 C) e successivamente chiarificati mediante
centrifugazione (ad esempio da 800 a 1000 g per 10 minuti).
3. MEZZO ANTIBIOTICO
Numerosi laboratori hanno utilizzato con successo mezzi antibiotici
di varia composizione e i laboratori di cui all'allegato II potranno
essere consultati in proposito nei rispettivi paesi. Per i campioni
di feci occorre una elevata concentrazione di antibiotici; una
miscela tipica e' la seguente: 10.000 unita'/ml di penicillina, 10
mg/ml di streptomicina, 0,25 mg/ml di gentamicina e 5.000 unita'/ml
di micostatina in una soluzione salina tampone di fosfato. Queste
dosi possono essere ridotte fino a cinque volte per i tessuti e per i
prelievi di trachea. Per l'accertamento della Clamidia, si possono
aggiungere 50 mg/ml di ossitetraciclina. Nella preparazione del mezzo
antibiotico, occorre assolutamente controllare il pH dopo l'aggiunta
degli antibiotici e portarlo ad un valore compreso tra 7,0 e 7,4.
Capitolo 2
Isolamento del virus
ISOLAMENTO DEL VIRUS NELLE UOVA EMBRIONATE DI GALLINA
Inoculare 0,1-0,2 ml del liquido sopranatante chiarificato nella
cavita' allantoica di almeno quattro uova embrionate di gallina
previamente sottoposte a incubazione per otto-dieci giorni.
Idealmente si dovrebbero utilizzare uova provenienti da un branco
indenne da organismi patogeni specifici, ma, in caso di
impossibilita', si possono utilizzare uova provenienti da un branco
in cui sia comprovata l'assenza di anticorpi del virus della malattia
di Newcastle. Le uova inoculate sono mantenute alla temperatura di 37
C ed esaminate ogni giorno in controluce. Le uova in cui si constata
che l'embrione e' morto o e' morente, nonche' tutte le uova restanti
sei giorni dopo l'inoculazione, vengono refrigerate a 4 C e il
liquido allantoico-amniotico sottoposto alla prova dell'attivita'
emoagglutinante. Qualora non si constati emoagglutinazione, il
procedimento sopra descritto deve essere ripetuto inoculando nelle
uova liquido allantoico-amniotico non diluito.
Quando viene constatata emoagglutinazione, la presenza di batteri
deve essere esclusa mediante coltura. In caso di presenza di batteri,
far passare i liquidi attraverso un filtro a membrana di 450 nm,
quindi aggiungere altri antibiotici e procedere nuovamente, come
indicato sopra, alla inoculazione in uova embrionate.
Capitolo 3
Diagnosi differenziale
1. DIFFERENZIAZIONE PRELIMINARE
Tutti i virus che provocano emoagglutinazione devono essere
trasmessi al laboratorio nazionale per esservi sottoposti ad una
gamma completa di prove di identificazione, caratterizzazione e
patogenicita'. Tuttavia, e' importante ricorrere al piu' presto a
misure provvisorie di contenimento della malattia di Newcastle, allo
scopo di limitare la diffusione del virus, e occorre che i laboratori
regionali ne identifichino la presenza. Occorre pertanto utilizzare i
liquidi emoagglutinanti eseguendo una prova di inibizione
dell'emoagglutinazione come descritto ai capitoli 5 e 6. Una
inibizione positiva, cioe' pari a 2 elevato a 4 o piu', con
l'antisiero policlonale specifico del virus della malattia di
Newcastle e avente un titolo noto, pari almeno a 29, potra' servire
per una identificazione preliminare sulla cui base istituire misure
provvisorie di contenimento.
2. IDENTIFICAZIONE DI CONFERMA
Il laboratorio nazionale procede ad una diagnosi differenziale
completa di tutti gli agenti emoagglutinanti. La conferma della
presenza dei virus della malattia di Newcastle e' nuovamente fornita
mediante prove di inibizione dell'emoagglutinazione con antisieri
monospecifici dei polli. Vanno inoltre eseguite le prove descritte al
capitolo 7 sull'indice di patogenicita' intracerebrale in tutti i
casi positivi isolati. Indici di patogenicita' superiori a 0,7
indicano la presenza dei virus, con la conseguente applicazione
integrale delle misure di contenimento.
Recenti progressi nell'individuazione dei tipi di virus della
malattia di Newcastle, soprattutto nelle tecniche concernenti
anticorpi monoclonali, hanno permesso il raggruppamento di ceppi e di
isolati. In particolare, sono ora disponibili anticorpi monoclonali
specifici per i ceppi vaccinici utilizzati nella Comunita', i quali
possono essere utilizzati in prove di inibizione
dell'emoagglutinazione di tipo semplice.
Dal momento che ceppi di vaccino possono essere isolati in campioni
di volatili, e' evidente il vantaggio di poter provvedere ad una loro
rapida identificazione presso il laboratorio nazionale. Questi
anticorpi monoclonali potrebbero essere ricavati dal laboratorio
comunitario di riferimento e distribuito ai laboratori nazionali per
la conferma dell'isolamento di virus vaccinici.
I laboratori nazionali dovrebbero trasmettere al laboratorio
comunitario di riferimento tutti gli agenti emoagglutinanti.
3. ALTRE PROVE DI INDIBIDUAZIONE DEL TIPO E DELLE CARATTERISTICHE
DEGLI ISOLATI
I laboratori nazionali dovrebero trasmettere al laboratorio
comunitario di riferimento tutti i virus emoagglutinanti, da
sottoporre ad ulteriori esami antigenici e genetici, ai fini di una
maggiore comprensione dell'epidemiologia della o delle malattie
all'interno della Comunita', conformemente alle competenze ed ai
compiti del laboratorio comunitario di riferimento.
Capitolo 4
Prove rapide per individuare gli anticorpi dei virus della malattia
di Newcastle
Prove rapide per individuare il virus della malattia di Newcastle
in volatili vaccinati e anticorpi in volatili non vaccinati:
1. INDIVIDUAZIONE DEL VIRUS DELLA MALATTIA DI NEWCASTLE
Nella diagnosi di infezioni nei volatili vaccinati sono state
impiegate parecchie prove rapide che consentono di individuare
direttamente gli antigeni della malattia di Newcastle. Quelle
attualmente piu' usate sono le prove di fluorescenza degli anticorpi
su sezioni longitudinali della trachea e le prove degli anticorpi
della perossidasi nel cervello. Sembra indubbio che altre prove per
l'individuazione diretta degli antigeni possano essere applicate alle
infezioni da virus della malattia di Newcastle.
L'inconveniente di queste prove risiede nell'impossibilita' pratica
di esaminare tutti i punti potenziali di replicazione del virus della
malattia di Newcastle nei volatili vaccinati. Ad esempio, il fatto
che non si riscontri il virus nella trachea non ne esclude la
replicazione nell'intestino. Non vi sono metodi diretti di
individuazione "di rinunce" che possono essere raccomandati nella
diagnosi della malattia di Newcastle; in circostanze specifiche,
queste prove possono tuttavia essere utili.
2. INDIVIDUAZIONE DI ANTICORPI IN VOLATILI NON VACCINATI
La maggior parte dei laboratori che si occupano della diagnosi
della malattia Newcastle di conosce perfettamente la prova di
inibizione dell'emoagglutinazione; le raccomandazioni riportate in
appresso riguardano appunto tale prova per la misurazione degli
anticorpi del virus. Tuttavia per l'individuazione degli anticorpi
del virus si puo' ricorrere, con molte probabilita' di riuscita, alla
prova di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Qualora si intenda
usare questa tecnica a livello di laboratori regionali, si suggerisce
che la prova in questione sia controllata dal laboratorio nazionale
di cui all'allegato II.
a) Campioni.
Prelevare campioni di sangue da tutti i volatili, se il branco e'
costituito da meno di venti capi, e da venti esemplari in caso di
branchi piu' numerosi (si ha, in tal modo, una probabilita' superiore
al 99% di individuare almeno un caso sieropositivo se almeno il 25%
degli individui del branco e' positivo, indipendentemente dalle
dimensioni del branco stesso). Lasciar coagulare il sangue e
asportare il siero da sottoporre alla prova. b) Ricerca degli
anticorpi.
Verificare la capacita' di singoli campioni di siero di inibire
l'antigene emoagglutinante del virus della malattia di Newcastle,
mediante prove standard di inibizione dell'emoagglutinazione come
indicato nel capitolo 6.
Un aspetto discusso e se nella prova di inibizione
dell'emoagglutinante occorra usare 4 o 8 unita' di emoagglutinina.
Entrambe le ipotesi sembrano valide; la scelta deve essere quindi
lasciata a discrezione dei laboratori nazionali. Tuttavia l'antigene
usato incide sul livello al quale un siero e' considerato positivo:
usando 4 unita' di emoagglutinina, un siero e' considerato positivo
se rivela un titolo uguale o superiore a 2 elevato a 4; usando 8
unita' di emoagglutinina, un siero e' considerato positivo se rivela
un titolo uguale o superiore a 2 elevato a 3.
Capitolo 5
Prova di emoagglutinazione (HA)
REAGENTI
1. Soluzione salina isotonica tamponata con fosfato (SPT) (0,05 M)
al pH compreso tra 7,0 e 7,4.
2. Prelevare globuli rossi da almeno tre volatili esenti da
organismi patogeni specifici (in caso di impossibilita', il sangue
puo' essere prelevato da volatili che sono regolarmente sottoposti a
controllo e che non presentano anticorpi del virus della malattia di
Newcastle), raggrupparli e aggiungerli ad un volume uguale di
soluzione di Alsever. Prima dell'uso, i globuli rossi devono essere
lavati tre volte in soluzione salina tamponante con fosfato. Per
l'esecuzione della prova si raccomanda una sospensione all'1%
(globuli confezionati v/v) in soluzione salina tamponata.
3. Si raccomanda di usare, come antigene standard, il ceppo di
virus della malattia di Newcastle Ulster 2C.
PROCEDIMENTO
a) porre 0,025 ml di soluzione in ciascuno dei pozzetti di una
piastra di microtitolazione in materiale plastico (usare pozzetti a
V);
b) versare 0,025 ml di sospensione del virus (ad esempio liquido
allantoico) nel primo pozzetto;
c) usare un diluente da microtitolazione per raddoppiare la
diluzione (da 1 : 2 a 1 : 4096) di virus nella piastra;
d) aggiungere altri 0,025 ml di soluzione salina in ogni pozzetto;
e) aggiungere 0,025 ml di globuli rossi all'1% in ogni pozzetto;
f) mescolare agitando leggermente e porre a riposo alla temperatura
di 4 C;
g) la lettura viene effettuata 30-40 minuti dopo, una volta
stabilizzati i globuli rossi di controllo. La lettura si effettua
inclinando la piastra ed osservando la presenza o l'assenza di
globuli rossi raggruppati a forma di goccia. Il flusso nei pozzetti
che non presentano emoagglutinazione deve essere identico a quello
constatato presso i globuli rossi di controllo esenti dal virus;
h) il titolo di emoagglutinazione e' costituito dalla diluizione
piu' elevata che provoca aggglutinazione dei globuli rossi. Tale
diluizione puo' essere considerata come contenente una unita'
emoagglutinante (HAU). Un metodo piu' accurato per la determinazione
del titolo di emoagglutinazione consiste nell'effettuare prove di
agglutinazione sul virus in una serie di diluizioni iniziali
progressive, ad esempio 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 6, ecc. Si
raccomanda questa procedura per una preparazione accurata
dell'antigene per le prove di inibizione dell'emoagglutinazione
(capitolo 6).
Capitolo 6
Prova di inibizione dell'emoagglutinazione
REAGENTI
a) soluzione salina tamponata con fosfato (SPT);
b) liquido allantoico contenente il virus, diluito nella soluzione
salina in modo da avere un contenuto di 4 o 8 unita' di
emoagglutinazione per 0,025 ml;
c) globuli rossi di pollame: 1%;
d) siero di pollame negativo di controllo;
e) siero positivo di controllo.
PROCEDIMENTO
a) versare 0,025 ml di soluzione salina tamponata con fosfato in
tutti i pozzetti di una piastra di microtitolazione in materiale
plastico (i pozzetti devono avere una forma a V);
b) versare 0,025 ml di siero nel primo pozzetto della piastra;
c) usare un diluente da microtitolazione per ottenere una
diluizione di 1 : 2 di siero sulla piastra;
d) aggiungere 0,025 ml di liquido allantoico diluito contenente 4 o
8 unita' di emoagglutinazione;
e) mescolare picchiettando leggermente e conservare alla
temperatura di 4 C per almeno 60 minuti o a temperatura ambiente per
almeno trenta minuti;
f) aggiungere 0,025 ml di globuli rossi all'1% in tutti i pozzetti;
g) mescolare picchiettando leggermente e porre a riposo alla
temperatura di 4 C;
h) la lettura delle piastre e' effettuata dopo 30-40 minuti, dopo
che i globuli rossi di controllo si sono stabilizzati. La lettura
viene effettuata inclinando la piastra e osservando se nel flusso del
liquido vi e' o meno formazione di gocce in misura uguale a quelle
dei pozzetti di controllo che contengono unicamente globuli rossi
(0,025 ml) e soluzione salina (0,05 ml);
i) il titolo di inibizione dell'emoagglutinazione e' costituito
dalla diluizione massima di antisiero che comporta una unibizione
totale di 4 o 8 unita' di virus (ciascuna prova dovrebbe comprendere
una titolazione di emoagglutinazione a scopo di conferma della
presenza delle unita' di emoagglutinazione richieste);
l) i risultati sono validi se si ottiene un titolo inferiore a 2
elevato a 3 per 4 unita' di emoagglutinazione o 2 elevato a 2 per 8
unita' di emoagglutinazione con il siero negativo di controllo ed un
titolo avente una diluzione immediatamente superiore o inferiore al
titolo noto del siero di controllo positivo.
Capitolo 7
Prova dell'indice di patogenicita'
1. Diluire in una proporzione di 1:10, in una soluzione isotonica
salina sterile, un'aliquota di liquido allantoico infetto appena
prelevato: il titolo di emoagglutinazione deve essere superiore a 2
elevato a 4) (non usare antibiotici).
2. Iniettare nel cervello di dieci pulcini di un giorno (cioe'
aventi un'eta' compresa fra 24 e 40 ore alla schiusa) 0,05 ml di
virus diluito. I pulcini devono essere ottenuti da uova provenienti
da un branco esente da organismi patogeni specifici.
3. Esaminare i pulcini per otto giorni, ad intervalli di 24 ore.
4. Classificare ognuno dei pulcini ad ogni osservazione come segue:
0 = normale; 1 = malato; 3 = morto.
L'indice e' calcolato come nell'esempio che segue:
_____________________________________________________________________
|Giorni successivi all'inoculazione
| (numero di pulcini)
Sintomi clinici|_____________________________________________________
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Totale | Punteggio
_______________|___|___|___|___|___|___|___|___|________|____________
Normale |10 | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 14 x 0 | = 0
Malato | 0 | 6 |10 | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 20 x 1 | = 20
Morto | 0 | 0 | 0 | 6 |10 |10 |10 |10 | 46 x 2 | = 92
_______________|___|___|___|___|___|___|___|___|________|____________
| TOTALE = 112
_______________________________________________|_____________________
L'indice e' costituito dal punteggio medio per pulcino per ogni
osservazione, ossia 112/80 = 1,4
_____________________________________________________________________
Capitolo 8
Valutazione della capacita' di formazione di placca
1. Il procedimento migliore consiste nell'utilizzare tutta una
gamma di diluizioni di virus per essere certi di disporre sulla
piazza dei numeri ottimali di placche. Dieci diluizioni fino a 10
elevato a -7 in soluzione salina fosfatata dovrebbero essere
sufficienti.
2. Monostrati confluenti di cellule di embrione di volatile o una
linea cellulare adeguata (ad esempio rene bovino Madin-Darby) sono
preparati e disposti in scatole di Petri aventi 5 cm di diametro.
3. Aggiungere in due scatole di Petri 0,2 ml di ciascuna delle
diluizioni di virus e lasciar assorbire il virus per 30 minuti.
4. Lavare 3 volte con la soluzione salina le cellule infette, indi
ricoprirle di mezzo pertinente, contenente l'1% p/v di agar e 0,01
mg/ml di tripsina, oppure non contenente tripsina; e' importante non
aggiungere siero al mezzo di copertura.
5. Dopo una incubazione a 37 C per 72 ore, le placche dovrebbero
avere una dimensione sufficiente. Per una migliore osservazione delle
placche, asportare lo strato di agar di copertura e colorare il
monostrato cellulare con cristalvioletto (0,5% p/v) in metanolo al
25% v/v.
6. Tutti i virus dovrebbero fornire placche evidenti, se incubati
alla presenza di tripsina nello strato di copertura. Se nel mezzo di
copertura non vi e' tripsina, soltanto i virus virulenti per i
volatili producono placche.