ALLEGATO
IDENTIFICAZIONE E DETERMINAZIONE DEL 2-FENOSSIETANOLO, 1-FENOSSI-
PROPAN-2-OLO, METILE, ETILE, PROPILE, BUTILE E BENZILE
4-IDROSSIBENZOATO NEI PRODOTTI COSMETICI
A. IDENTIFICAZIONE
1. Oggetto e campo di applicazione
Il metodo consiste in un'analisi cromatografica su strato sottile
(TLC) che, in combinazione con
il metodo di determinazione descritto nella parte B di questo
documento, consente l'identificazione delle seguenti sostanze:
2-fenossietanolo, 1-fenossipropan-2-olo, metile 4-idrossibenzoato,
etile 4-idrossibenzoato, propile 4-idrossibenzoato, butile
4-idrossibenzoato e benzile 4-idrossibenzoato nei prodotti cosmetici.
2. Principio
I conservanti sono estratti dal campione di prodotto cosmetico
acidificato con acetone. Dopo filtrazione, la soluzione di acetone e'
diluita in acqua e gli acidi grassi sono fatti precipitare in un
mezzo alcalino, sotto forma dei loro sali di calcio. La miscela
alcalina acetone/acqua e' estratta con dietiletere per asportare le
sostanze lipofile. Dopo acidificazione, i conservanti sono estratti
con dietiletere e una parte della soluzione cosi' ottenuta e'
depositata su una lastra per cromatografia rivestita di gel di
silice. Dopo aver sviluppato la lastra, il cromatogramma ottenuto e'
osservato alla luce UV ed e' visualizzato mediante il reagente di
Millon.
3. Reagenti
3.1. Aspetti generali.
Tutti i reagenti impiegati devono essere della purezza richiesta per
analisi. Si dovra' impiegare acqua distillata, oppure acqua di
purezza almeno equivalente.
3.2. Acetone.
3.3. Dietiletere.
3.4. n-Pentano.
3.5. Metanolo.
3.6. Acido acetico glaciale.
3.7. Soluzione di acido cloridrico, c(HCL) = 4mol/l.
3.8. Soluzione di idrossido di potassio, c(KOH) = 4mol/1.
39. Cloruro di calcio di idrato (CaCl22H2O).
3.10. Reagente di evidenziazione: reagente di Millon
Il reagente di Millon (nitrato di mercurio II) e' una soluzione
pronta all'uso, disponibile in commercio (Fluka 69820).
3.11. 2-Fenossietanolo.
3.12. 1-Fenossipropan-2-olo.
3.13. Metile 4-Idrossibenzoato (metilparaben).
3.14. Etile 4-Idrossibenzoato (etilparaben).
3.15. n-Propile 4-Idrossibenzoato (propilparaben).
3.16. n-Butile 4-Idrossibenzoato (butilparaben).
3.17. Benzile 4-Idrossibenzoato (benzilparaben).
3.18. Soluzioni di riferimento
Preparare soluzioni allo 0,1 % (m/V) in metanolo di ciascuna delle
sostanze di riferimento di cui ai punti: 3.11, 3.12, 3.13, 3.14,
3.15, 3.16 e 3.17.
3.19. Solvente di sviluppo
Mescolare 88 volumi di n-pentano con 12 volumi di acido acetico
glaciale.
4. Apparecchiature
Attrezzatura comune di laboratorio e
4.1. Bagno (ad acqua) in grado di mantenere una temperatura di
60gradi C.
4.2. Vaschetta di sviluppo (non rivestita di carta da filtro).
4 3. Sorgente di luce ultravioletta, 254 nm.
4.4. Lastre a strato sottile 20 cm x 20 cm, prerivestite con gel di
silice dello spessore di 0,25 mm del tipo 60 F254, con zona di
concentrazione (Merck, n. 11798, Darmstadt, o equivalenti).
4.5. Forno in grado di mantenere temperature fino a 105gradi C.
4.6. Asciugacapelli ad aria calda.
4.7. Rullo da pittura in lana della lunghezza di circa 10 cm e con
diametro esterno di circa 3,5 cm. Lo spessore della lana dovra'
essere pari a 2-3 mm. Ridurre lo spessore originario di lana, se
necessario.
(Cfr. la nota al punto 5.2).
4.8. Provette in vetro da 50 ml con tappo a vite.
4.9. Piastra elettrica con regolatore termostatico della temperatura.
Regolare la temperatura a circa 80gradi C. Porre sulla piastra
elettrica una piastra di alluminio da 20 cm x 20 cm e dello spessore
di circa 6 mm per ottenere una distribuzione uniforme del calore.
5. Procedura
5.1. Preparazione del campione
Pesare circa 1 g di campione in una provetta in vetro da 50 ml con
tappo a vite. Aggiungere 4 gocce della soluzione di acido cloridrico
(3.7) e 40 ml di acetone.
Se si tratta di prodotti cosmetici fortemente basici, quali i saponi
da toilette, aggiungere 20 gocce di soluzione di acido cloridrico.
Chiudere la protetta, riscaldare gradatamente la miscela fino a
portarla a circa 60gradi C per facilitare l'estrazione dei
conservanti nella fase contenente acetone e agitare vigorosamente per
un minuto.
Misurare il pH della soluzione con una cartina di tornasole e
aggiustare il pH della soluzione ad un valore minore o uguale 3, con
la soluzione di acido cloridrico. Agitare di nuovo, vigorosamente per
un minuto.
Lasciare che la soluzione si raffreddi a temperatura ambiente e
filtrarla su filtro di carta in una beuta conica. Trasferire 20 ml
del filtrato in una beuta conica da 200 ml, aggiungere 60 ml di acqua
e mescolare. Aggiustare il pH della miscela a circa 10, con la
soluzione di idrossido di potassio (3.8), utilizzando sempre una
cartina al tornasole.
Aggiungere 1 g di cloruro di calcio diidrato (3.9) e agitare
vigorosamente. Filtrare la soluzione su filtro di carta in un imbuto
separatore da 250 ml, contenente 75 ml di dietiletere e agitare
vigorosamente per un minuto. Lasciare che le fasi si separino e
raccogliere lo strato acquoso in una beuta conica da 200 ml.
Aggiustare il pH della soluzione a circa 2, con la soluzione di acido
cloridrico, usando la cartina di tornasole. In seguito, aggiungere 10
ml di dietiletere e agitare vigorosamente per un minuto. Lasciare
che le fasi si separino e trasferire circa 2 ml della fase contenente
dietiletere in una provetta da 5 ml.
5.2. Cromatografia su strato sottile
Porre la piastra per TLC (4.4) sulla piastra di alluminio riscaldata
(4.9). Depositare 100 microl di ciascuna delle soluzioni di
riferimento (3.18) e 100 microl della/delle soluzione/i (5.1) sulla
linea di partenza, nella zona di concentrazione della piastra per
TLC. Se lo si ritiene opportuno, si puo' impiegare una corrente
d'aria per facilitare l'evaporazione del solvente. Togliere la
piastra per TLC dalla piastra riscaldante e lasciarla raffreddare a
temperatura ambiente. Trasferire 100 ml del solvente di sviluppo
(3.19) in una vaschetta per sviluppo (4.2).
Porre la piastra TLC immediatamente nella camera insatura e
sviluppare a temperatura ambiente fino a quando il fronte del
solvente si e' spostato di circa 15 cm dalla linea di partenza.
Togliere la piastra dalla vaschetta di sviluppo e asciugare sotto
corrente d'aria calda, servendosi di un asciugacapelli.
Esaminare la lastra sotto luce UV (4.3) e segnare la posizione delle
macchie. Riscaldare la piastra per 30 minuti in forno (4.5) a
100gradi C per rimuovere l'acido acetico in eccpsso. Visualizzare i
conservanti nel cromatogramma con il reagente di Millon (3.10),
intingendo il ruolo da pittura (4.7) nel reagente e facendolo
scorrere sulla piastra TLC fino a che essa sia bagnata in modo
uniforme.
Nota: Alternativamente, le macchie possono essere visualizzate
applicando con attenzione una goccia di reagente di Millon su
ciascuna delle macchie rilevate sotto luce UV.
Gli esteri dellacido 4-idrossibenzoico si evidenziano come macchie
rosse, quelli del 2-fenossietanolo e del 1-fenossipropan-2-olo come
macchie gialle. Si noti, pero', che anche l'acido 4-idrossibenzoico,
che puo' essere presente nei campioni sia come conservante che come
prodotto di decomposizione dei parabeni, potra' apparire anch'esso
sotto forma di macchia rossa. (Cfr. 7.3 e 7.4).
6. Identificazione
Calcolare il valore R, per ciascuna macchia. Paragonare le macchie
ottenute dalla soluzione campione con quelle delle soluzioni di
riferimento, rispetto ai loro valori di Rf al loro comportamento
sotto luce UV e al loro colore dopo visualizzazione. Trarre
conclusioni preliminari riguardo all'identita' dei conservanti.
Se si rileva la presenza di parabeni, si dovra' porre in atto la
procedura di HPLC descritta nella parte B. Combinare i risultati
ottenuti con TLC e HPLC per confermare la presenza del
2-fenossietanolo, del 1-fenossipropan-2-olo e dei parabeni.
7. Osservazioni
7.1. Data la tossicita' del reagente di Millon, e' opportuno
applicarlo secondo uno dei metodi sopra descritti. E' invece da
evitare di applicarlo a spruzzo.
7.2. Anche altri composti contenenti gruppi idrossilici possono
combinarsi con il reagente di Millon e formare macchie colorate. Una
tabella di colori e di valori R, ottenuti per vari conservanti
seguendo questa procedura di TLC sono presentati in: N. de Kruijf,
M.A.H. Rijk, LA. Pranoto-Soetardhi e A. Schouten (1987):
Determination of preservatives in cosmetic products I: Thin layer
chromatographic procedure for the identification of preservatives in
cosmetic product (J. Cromatogr. 410, 395-411).
Nella tabella seguente si riportano, a solo titolo indicativo i
valori di Rf:
Composto hR, Colore
Acido 4-idrossibenzoico 11 rosso
metilparaben 12 rosso
etilparaben 17 rosso
propilparaben 21 rosso
butilparaben 26 rosso
benzilparaben 16 rosso
2-fenossietanolo 29 giallo
1 -fenossipropan-2-olo 50 giallo
7.4. Non si ottiene alcuna separazione per l'acido 4-idrossibenzoico,
il metilparaben, il benzilparaben e l'etilparaben. L'identificazione
di questi composti deve essere confermata eseguendo l'indagine con il
metodo di cromatografia liquida alta risoluzione (HPLC) descritto
nella parte B e paragonando i tempi di ritenzione ottenuti dal
campione con quelli standard.
B. DETERMINAZIONE
1. Oggetto e campo di applicazione
Questo metodo ha per oggetto una procedura per la determinazione di:
2-fenossietanolo, l-fenossipropan-2-olo, metile 4-idrossibenzoato,
etile 4-idrossibenzoato, propile 4-idrossibenzoato, butile
4-idrossibenzoato e benzile 4-idrossibenzoato nei prodotti cosmetici.
2. Definizione
Le quantita' di conservanti determinate con questo metodo sono
espresse come percentuale rispetto alla massa.
3. Principio
Il campione e' acidificato mediante aggiunta di acido solforico ed e'
successivamente sospeso in una miscela di etanolo ed acqua. Dopo aver
riscaldato gradatamente la miscela fino ad ottenere la dissoluzione
della fase lipidica per facilitarne l'estrazione, si procede al
filtraggio della miscela stessa.
I conservanti nel filtrato sono determinati mediante HPLC in fase
inversa, con l'impiego di isopropile 4-idrossibenzoato come standard
interno.
4. Reagenti
4.1. Generalita'
Tutti i reagenti devono avere il grado di purezza richiesto per
analisi e devono essere adatti alla HPLC, se del caso. Si dovra'
impiegare acqua distillata, oppure acqua di purezza almeno
equivalente.
4.2. Etanolo assoluto.
4.3. 2-Fenossietanolo.
4.4. 1-Fenossipropan-2-olo.
4.5. Metile 4-idrossibenzoato (metilparaben).
4.6. Etile 4-idrossibenzoato (etilparaben).
4.7. n-Propile 4-idrossibenzoato (propilparaben).
4.8. Isopropile 4-idrossibenzoato (isopropilparaben).
4.9. n-Butile 4-idrossibenzoato (butilparaben).
4.10. Benzile 4-idrossibenzoato (benzilparaben).
4.1 1. Tetraidrofurano.
4.1 2. Metanolo.
4.13. Acetonitrile.
4.14. Soluzione di acido solforico, c(H2SO4) = 2mol/l
4.15. Miscela etanolo/acqua
Mescolare 9 volumi di etanolo (4.2) e 1 volume di acqua.
4.16. Soluzione standard interno
Pesare accuratamente circa 0,25 g di isopropilparaben (4.8),
trasferirlo in un matraccio da 500 ml, sciogliere e completare a
volume con la miscela etanolo/acqua (4.15).
4.17. Fase mobile: miscela
tetraidrofurano/acqua/metanolo/acetonitrile
Mescolare 5 volumi di tetraidrofurano, 60 volumi d'acqua, 10 volumi
di metanolo e 25 volumi di acetonitrile.
4.18. Soluzione di riferimento dei conservanti
Pesare con cura circa 0,2 g di 2-fenossietanolo, 0,2 g di
1-fenossipropan-2-olo, 0,05 g di metilpara- ben, 0,05 g di
etilparaben, 0,05 g di propilparaben, 0,05 g di butilparaben e 0,025
g di benzilpa- raben in una beuta da 100 ml, sciogliere e completare
a volume con la miscela etanolo/acqua.
La soluzione e' stabile per una settimana se conservata in
frigorifero.
4.19. Soluzioni standard di conservanti
Dalla soluzione di riferimento (4.18) trasferire rispettivamente
20,00 ml, 10,00 ml, 5,00 ml, 2,00 ml e 1,00 ml in protette graduate
da 50 ml. Aggiungere a ciascuna di esse 10,00 ml di soluzione
standard interno (4.16) e 1,0 ml di soluzione di acido solforico
(4.14), indi completare a volume con la miscela etanolo/acqua. Queste
soluzioni devono essere preparate al momento.
5. Apparecchiature
Attrezzature per uso normale di laboratorio.
5.1. Bagno (ad acqua) in grado di mantenere una temperatura di
60gradi C + o - 1grado C.
5.2. Apparecchio per cromatografia liquida ad alta risoluzione
rilevatore a luce UV, fissato alla lunghezza d'onda di 280 mm.
5.3. Colonna per analisi:
Acciaio inossidabile 250 mm x 4,6 mm d.i. (o 125 mm x 4,6 mm d.i. )
riempita di fase stazionaria Nucleosil 5C18, o equivalente (cfr.
10.1).
5.4. Provette in vetro da 100 ml, con tappo a vite.
5.5. Granuli ebullioscopici in carborundum, dimensione 2-4 mm, o
equivalenti.
6. Procedura
6.1. Preparazioni dei campioni
6.1.1. Preparazione dei campioni senza aggiunta dello standard
interno
Pesare circa 1,0 g di campione in una provetta da 100 ml con tappo a
vite. Pipettare 1,0 ml di soluzione di acido solforico (4.14) e 50,0
ml di miscela etanolo/acqua (4.15) nelle provette.
Aggiungere circa 1 g di granuli ebullioscopici (5.5), tappare la
provetta e agitare vigorosamente fino ad ottenere una sospensione
omogenea.
Agitare per almeno un minuto. Porre la provetta per cinque minuti in
bagno d'acqua calda (5.1) mantenuto a 60gradi C + 1grado C per
facilitare l'estrazione dei conservanti nella fase etanolica.
Raffreddare immediatamente la provetta sotto acqua fredda e riporre
l'estratto in frigorifero per un'ora. Filtrare l'estratto su filtro
in carta. Trasferire circa 2 ml di filtrato in una provetta da 5 ml.
Conservare gli estratti in frigorifero ed eseguire la determinazione
mediante HPLC entro 24 ore.
6.1.2. Preparazione del campione compresa aggiunta dello standard
interno
Pesare alla terza cifra decimale 1,0 g + o - 0,1 g di campione (a
grammi) in una provetta in vetro da 100 ml, con tappo a vite.
Pipettare 1,0 ml di soluzione di acido solforico c 40,0 ml di miscela
etanolo/acqua nella provetta.
Aggiungere circa 1 g di granuli ebullioscopici ed esattamente 10,00
ml di soluzione standard interno. Tappare la provetta e agitare
vigorosamente fino ad ottenere una sospensione omogenea.
Agitare per almeno un minuto. Porre la provetta per cinque minuti in
bagno d'acqua mantenuta a 60gradi C + o - 1grado C per facilitare
l'estrazione dei conservanti nella fase etanolica.
Raffreddare immediatamente la provetta sotto acqua fredda e riporre
l'estratto in frigorifero per un'ora. Filtrare l'estratto servendosi
di un filtro in carta.
Trasferire circa 2 ml del filtrato in una provetta da 5 ml (soluzione
test). Riporre l'estratto in frigorifero ed eseguire le
determinazioni mediante HPLC entro 24 ore.
6.2. Cromatografia liquida ad alta risoluzione
Condizioni per la cromatografia
- Fase mobile: miscela tetraidrofurano/acqua/metanolo/acetonitrile
(4.17)
- Flusso. 1,5 ml/minuto
- Lunghezza d'onda del rivelatore 280 nm.
6.2.2. Taratura
Iniettare 10 micorl di ciascuna delle soluzioni standard di
conservanti (4.19). In base ai cromatogrammi ottenuti determinare i
rapporti fra le altezze dei picchi delle soluzioni di conservanti in
analisi e l'altezza del picco della soluzione standard di riferimento
interno. Tracciare, per ciascun conservante, un grafico che metta in
relazione il valore di questi rapporti con le concentrazioni delle
soluzionl standard.
6.2.3. Determinazione
Iniettare 10 microl della soluzione campione senza standard interno
(6.1.1) nel cromatografo e registrare il cromatogramma.
Inettare 10 microl di una delle soluzioni standard di conservanti
(4.19) e registrare il cromatogramma. Paragonare i cromatogrammi
ottenuti. Se, nel cromatogramma dell'estratto del campione (6.1.1),
non e' presente alcun picco che abbia approssimativamente lo stesso
tempo di ritenzione dell'isopropilparaben (standard interno
raccomandato), continuare iniettando 10 microl di soluzione campione
con standard interno (6.1.2). Registrare il cromatogramma e misurare
le altezze dei picchi.
Se si rileva un picco interferente nel cromatogramma della soluzione
campione, avente all'incirca lo stesso tempo di ritenzione dell'
isopropilparaben, si dovra' scegliere un altro standard interno. Se
uno dei conservanti in esame e' assente nel cromatogramma del
campione, tale conservante puo' essere impiegato come standard
interno alternativo.
Calcolare i rapporti delle altezze dei picchi dei conservanti in
esame rispetto all'altezza di picco dello standard interno.
Accertare che si ottenga una risposta lineare per le soluzioni
standard impiegate nella procedura di taratura.
Accertare che i cromatogrammi ottenuti per una soluzione standard e
per la soluzione campione soddisfino le seguenti esigenze:
- la separazione dei picchi della coppia meno ben separata deve esse
pari ad almeno 0,90 (per la definizione di separazione dei picchi,
cfr. figura 1).
Separazione di picchi (p)
p=f/g
Figura 1: Separazione dei picchi
----> vedere figura a pag. 22 della G.U. <----
Se la separazione richiesta non e' ottenuta, sara' necessario
impiegare una colonna piu' efficiente, oppure si dovra' mettere a
punto la composizione della fase mobile fino ad ottenere i risultati
desiderati.
- Il fattore di asimmetria A , di tutti i picchi ottenuti deve
s
variare fra 0,9 e 1,5. (Per la definizione di "fattore di asimme-
tria di picco", cfr. figura 2). Per registrare il cromatogramma ai
fini della determinazione del fattore di asimmetria, si raccomanda
una velocita' della carta pari ad almeno 2 cm/minuto.
Fattore di asimmetria (A )
s
A =b/a
s
Figura 2: Fattore di asimmetria di picco
----> vedere figura a pag. 23 della G.U. <----
- Dovra' essere ottenuta una linea di base stabile.
7. Calcolo
Servirsi della curva di taratura (6.2.2) e dei rapporti fra le
altezze dei picchi dei conservanti in esame rispetto all'altezza di
picco dello standard interno per calcolare la concentrazione dei
conservanti presenti nella soluzione campione. Calcolare i contenuti
(wi) di: 2-fenossietanolo, 1-fenossipropan-2-olo, metile
4-idrossibenzoato, etile 4-idrossibenzoato, propile
4-idrossibenzoato, butile 4-idrossibenzoato e benzile
4-idrossibenzoato, come percentuale in peso (% m/m) in base alla
seguente formula:
b
i
% w (m/m) =
i 200 x a
dove:
b = concentrazione (microg/ml) del conservante i nella soluzione
i test, quale si desume mediante lettura dal grafico di taratura;
a = massa (g) prelevata per il test.
8. Ripetibilita' (|)
Cfr. osservazioni al punto 10.5.
9. Riproducibilita' (1)
Cfr. osservazioni al punto 10.5.
10. Osservazioni
10.1. Fase stazionaria
Il comportamento di ritenzione dei soluti nelle determinazioni
mediante HPLC dipende in forte misura dal tipo, dalla marca e dagli
impieghi precedenti della fase stazionaria. E' possibile stabilire
se una colonna puo' essere impiegata per la separazione dei
conservanti in esame, in base ai risultati ottenuti per le soluzioni
standard (cfr. osservazioni al punto 6.2.3). Oltre al materiale
proposto per il riempimento della colonna, puo' essere anche
impiegato il materiale dei tipi seguenti:
Hypersil ODS e Zorbax ODS.
In alternativa, la composizione raccomandata della fase mobile puo'
essere ottimizzata allo scopo di ottenere la separazione richiesta.
10.2. Lunghezza d'onda di rilevamento
Una ruggedness test eseguito in rapporto al metodo sopra descritto ha
consentito di stabilire che un leggero cambiamento della lunghezza
d'onda di rilevamento puo' avere effetti significativi sui risultati
della determinazione.
Sara' quindi importante controllare con la massima attenzione questo
parametro durante l'analisi.
(i) ISO 5725.
10.3. Interferenze
Nelle condizioni descritte in questo metodo ha luogo una eluizione
anche di molti altri composti, come i conservanti e gli additivi
presenti nei cosmetici. I tempi di ritenzione di un gran numero di
conservanti citati nell'allegato VI della direttiva del Consiglio
riguardante i prodotti cosmetici figurano in: N. de Kruijf. A.
Schouten, MA.H. Rijk, LA.Pranoto-Soetardhi (1989). Determination of
preservatives in cosmetic products II. High-performance liquid
chromatographic identification (J. Chromatogr. 469, 317-398)
10.4. Puo' essere opportuno impiegare una precolonna per
salvaguardare la colonna di analisi.
10.5. Il metodo e' stato sperimentato in una ricerca eseguita in
collaborazione fra nove laboratori. Sono stati analizzati tre
campioni. Nella seguente tabella figurano, per ciascuno dei tre
esempi, le medie in % m/m (m), la ripetibilita' (r), la
riproducibilita' (R), determinate per le sostanze prese in esame:
Campione | 2-fenossi- 1-fenossi- metilparaben etilparaben
| etanolo propan-2-olo
|
Crema alla m 4,124 0,250 0,0628
vitamine r 0,016 0,018 0,0035
R 0,176 0,030 0,0068
Crema m 1,196 0,266 0,076
evanescente r 0,040 0,003 0,002
R 0,147 0,022 0,004
Crema per
massaggi m 0,806
r 0,067
R 0,112
Campione propilparaben butilparaben benzilparaben
Crema alla m 0,031 0,0906
vitamine r 0,0028 0,0044
R 0,0111 0,0034
Crema m
evanescente r
R
Crema per
massaggi m 0,180 0,148 0,152
r 0,034 0,013 0,015
R 0,078 0,012 0,016