All. sub A)
TITOLO
PIANO PER L'INNOVAZIONE DEL SISTEMA SANITARIO BASATA SULLE SCIENZE
OMICHE
INDICE
PARTE PRIMA
1. Introduzione: perche' questo Piano?
a. Il contesto programmatorio
b. Vision, principi, struttura e obiettivi generali
2. Basi scientifiche e concettuali delle tecniche omiche
PARTE SECONDA
3. La genomica nella diagnosi
a. Malattie Mendeliane
b. Malattie Complesse e multifattoriali
c. Tumori
i. Mutazioni germinali
ii. Mutazioni somatiche
4. La prevenzione personalizzata
a. Test Pre-concezionali
b. Test Prenatali
1. NIPT
2. La diagnosi prenatale genomica (NGPD)
c. Screening Neonatale ed Approcci genomici
d. Test postnatali per:
1. Malattie Mendeliane
2. Malattie Complesse
i. Concetti generali
ii. Malattie cardiovascolari multifattoriali
3. Tumori
i. Mutazioni germinali per tumori ereditari
1. Tumore della mammella
2. Sindrome di Lynch
ii. Mutazioni germinali per suscettibilita' a
tumori
1. Cancro alla Prostata
iii. Mutazioni somatiche
5. La genomica nella terapia
a. Risposta ai farmaci e farmaco genomica
b. Terapia personalizzata dei tumori
6. Funzione di governo centrale e azioni di supporto alla
implementazione del piano
7. Indicazioni per la ricerca e l'innovazione
8. Approfondimenti
a. Aspetti etici degli approcci genomici
b. Test genetici diretti al consumatore
c. L'omica batterica
d. Test post-natali per le malattie cardiache mendeliane
e. Valutazioni economiche
9. Obiettivi e Raccomandazioni
10. Glossario ed acronimi
PARTE PRIMA
CAPITOLO 1
Introduzione: perche' questo Piano?
- La finalita'. I progressi nell'ambito della genomica hanno
implicazioni evidenti e cruciali per la salute pubblica; tali
conoscenze permettono infatti di riconoscere piu' facilmente le basi
genetiche delle malattie ereditarie ed offrono l'opportunita' di
differenziare, all'interno delle popolazioni, individui e gruppi
maggiormente suscettibili di sviluppare determinate condizioni, e
questo con modalita' nuove rispetto a quelle tradizionalmente usate
dai professionisti di sanita' pubblica. Nonostante la genomica abbia
visto uno sviluppo notevole nell'ultimo decennio, ed un progresso
ancora piu' rapido sia atteso nel prossimo futuro, fino ad oggi il
suo impatto sulle politiche sanitarie e' stato limitato. Questo atto
di pianificazione nasce quindi dalla esigenza di integrare la sempre
maggiore disponibilita' di strumenti sofisticati nel settore delle
scienze genomiche con le pratiche correnti di sanita' pubblica. Nello
specifico, la finalita' del piano e' delineare le modalita' con cui
l'innovazione nel settore della genomica si debba innestare nel SSN
negli ambiti della prevenzione, diagnosi e cura, in un'ottica di
efficacia (evidence-based) e di sostenibilita' (cost-effectiveness)
del SSN ai fini del miglioramento della salute dell'individuo e della
popolazione.
Il Piano si inserisce in una strutturazione di "governance" e
"capacita' di sistema" che da un lato si basa su e valorizza
iniziative gia' in corso (es. progetti supportati dal Ministero della
Salute ed altri Enti Finanziatori), e dall'altro necessita di una
pianificazione adeguata a livello nazionale (interventi legislativi).
- Lo scenario. I sistemi sanitari di tutto il mondo stanno
affrontando una fase cruciale e delicata, caratterizzata da
un'elevata pressione finanziaria che rischia di minare la
sostenibilita' di tali sistemi. Per affrontare la sfida di questo
scenario in evoluzione, i sistemi sanitari dovranno gestire tre nodi
cruciali: ridare centralita' al cittadino nel contesto del sistema;
dare maggiore enfasi alle attivita' di prevenzione; riorganizzare
radicalmente il servizio spostando le cure dall'ospedale al
territorio. Tuttavia, nei report piu' recenti ne' la genomica ne' le
scienze della vita sono state considerate e discusse come settori
importanti per lo scioglimento di questi nodi. Si suggerisce quindi,
in linea con recenti report di esperti, che questi punti critici
vengano affrontati anche con l'ausilio delle conoscenze e dei
principi della genomica, in virtu' di una consapevolezza che negli
ultimi anni sta maturando sempre di piu' su queste tematiche tra i
professionisti di sanita' pubblica. Nello specifico, la genomica ed
altre innovazioni scientifiche possono inserirsi in un trend sociale
gia' in atto, cioe' la sempre maggiore centralita' dell'individuo,
per rendere la salute pubblica e l'assistenza sanitaria piu' efficaci
ed efficienti. La presente proposta quindi si focalizza su un nuovo
paradigma che guarda oltre la genomica di sanita' pubblica, e che sia
indirizzato ai mutevoli bisogni sanitari delle popolazioni. Questo
nuovo paradigma dovrebbe fondarsi sui seguenti pilastri: la
personalizzazione dell'assistenza sanitaria; l'adozione di nuove
tecnologie, accanto a quelle genomiche, al fine di incrementare la
conoscenza degli individui, del loro stato di salute e di malattia -
includendo in particolare nuove tecnologie biomediche e digitali come
l'imaging ed i sensori wireless -; lo sviluppo e l'integrazione di
una prevenzione personalizzata, come approccio complementare alle
classiche pratiche esistenti in sanita' pubblica; l'uso della
connettivita' mobile e delle crescenti capacita' computazionali al
fine di generare grandi quantita' di dati (big data) da utilizzare
per il progresso della sanita' e di altri settori. Questo nuovo
approccio supera esplicitamente quello della genomica classica, e
unisce quelli che possono apparire campi totalmente distanti tra loro
al fine di fornire un approccio piu' olistico all'assistenza
sanitaria.
- La sfida. Sara' essenziale affrontare alcune sfide, man mano
che i progressi nel campo della genomica aprono nuove opportunita'
per il miglioramento della salute attraverso l'uso di applicazioni
genomiche e strumenti per la valutazione della storia di salute delle
famiglie. E' infatti sempre piu' difficile per i comitati di esperti
valutare in tempo reale e meticolosamente i benefici ed i possibili
danni derivanti delle applicazioni genomiche e degli strumenti di
valutazione del rischio, visto il loro rapido aumento. Sono quindi
necessari dati nazionali validi ed affidabili per stabilire le misure
di riferimento e per monitorare i progressi. Le classiche fonti di
dati amministrativi dei sistemi sanitari probabilmente non sono
ancora adeguate a questo scopo. Lo sviluppo di un programma sulla
stregua di Healthy People potrebbe pertanto essere ostacolato dalla
limitata disponibilita' sia di raccomandazioni basate sull'evidenza
sia di dati nazionali per monitorare i progressi.
- Lo sviluppo della genomica (e delle scienze "omiche" in
generale) non comporta solo conseguenze sul piano della salute e
della medicina. Per sua stessa natura la genomica contribuisce alla
(e si alimenta della) innovazione della IT, tanto che e' considerata
componente e "funzione" dei Big Data. Questo comporta delle
conseguenze almeno nelle seguenti tre dimensioni, che quindi entrano
per tale motivo in questo Piano come garanzia di governabilita' per
il sistema Paese dell'innovazione basata sulle scienze omiche:
- Norme e regole: l'innovativita' degli scenari generati dalla
ricerca omica, il carattere dei problemi posti, le esigenze nuove che
scaturiscono dall'impetuoso sviluppo in questo campo, impongono un
adeguamento del quadro di riferimento normativo. Cio' e' evidente per
la valutazione della conoscenza fruibile (con un ruolo per l'Health
Technology Assessment) oppure per il governo della vendita direct to
consumer, oppure per il data sharing (per rendere fattibile e
governare tale cruciale fenomeno sia in Italia che nel contesto
internazionale).
- Logistica: le esigenze poste dalla "interrogazione dei Big
Data" definiscono la necessita' di costruire una capacita' di sistema
che riesca a integrare le capacita' super-computazionali disponibili
in Italia ma anche a farle interagire con risorse di questo tipo in
altri Paesi. Il networking in questo campo assume quindi la
caratteristica di una soluzione logistica automa ma non autarchica
che, a sua volta, e' conditio sine qua non per produrre nuova
conoscenza rispetto alle esigenze "di scala" peculiari delle scienze
omiche.
- Innovazione: da un lato questo Piano intende acquisire
all'interno del SSN le innovazioni culturali, scientifiche,
tecnologiche ed erogative gia' in qualche modo acquisite dalla
ricerca nelle scienze omiche. Intende anche promuovere le necessarie
innovazioni congeniali alle caratteristiche di questo campo (per
esempio tecnologie per rendere fruibili ai "medici di prossimita'" il
corpus delle evidenze scientifiche effettivamente utilizzabili nel
rapporto col singolo paziente). Ma bisogna anche riconoscere una
fondamentale questione che riguarda la necessita' di assicurare al
nostro Paese una dimensione di "innovazione continua"; in questo
senso si deve riconoscere il legame specifico che lo sviluppo delle
scienze omiche ha con la crescita economica. Pertanto, si tratta di
attivare una capacita' sistemica di "Ricerca e sviluppo" che
garantisca tale prospettiva di crescita mediante un uso sistematico
di concorsi di idee e bandi di start-up.
Considerazioni riguardo l'implementazione
- L'applicazione della genomica nell'assistenza sanitaria ha il
potenziale di ridurre l'impatto delle malattie sulla salute della
popolazione. Il successo sara' tanto maggiore quanto questa
applicazione avverra' come naturale ampliamento e complemento dei
tradizionali approcci di sanita' pubblica.
- I professionisti che lavorano nel campo della salute pubblica e
coloro che hanno ruoli di responsabilita' nell'organizzazione del
sistema sanitario hanno il compito di iniziare e facilitare il
processo di implementazione al fine di assicurare un giusto
equilibrio e di favorire la consapevolezza nei decisori politici.
- Per una corretta implementazione della medicina genomica e' di
importanza centrale l'educazione di professionisti, cittadini,
decisori politici ed altri portatori di interesse.
1.a Il contesto programmatorio
I contenuti del presente Piano tengono conto in primo luogo e in
senso generale degli assetti specifici del SSN ed in secondo luogo
dei seguenti atti di pianificazione strategica internazionale e
nazionale:
- WHO Global action plan for the prevention and control of
non-communicable diseases 2013-2020.
L'Italia ha sottoscritto l'obiettivo di ridurre, per il 2010, del
25% il rischio di mortalita' prematura per malattie cardiovascolari,
cancro, diabete e malattie respiratorie croniche. Come e' evidente,
questo obiettivo solleva potenzialmente il nostro sistema paese da un
carico prevenibile di eventi morbosi e mortali, rafforzando il
contributo da parte del servizio sanitario al sistema di welfare e
rendendo questo piu' sostenibile, anche in relazione agli andamenti
demografici tipici del nostro Paese. Questa caratteristica e', in
modo particolare, attribuibile all'obiettivo sulla riduzione della
mortalita' prematura da malattie croniche non trasmissibili, pur
essendo valorizzabili in tal senso anche gli obiettivi sulla
riduzione degli effetti dell'inquinamento, delle alterazioni
epigenetiche e delle malattie infettive.
- WHO The Human Genetic Programme.
La WHO ha definito una propria policy di indirizzo in questo campo.
Essa e' basata sulla necessita' di utilizzare le potenzialita' della
genomica (e delle biotecnologie correlate) identificando interventi
innovativi per raggiungere gli obiettivi di salute e mezzi
costo-efficaci per la prevenzione, diagnosi e cura delle malattie.
Nello stesso tempo, e' identificato come fondamentale considerare le
implicazioni etiche, legali e sociali nonche' potenziare la ricerca.
- European Union Council conclusions on personalized medicine for
patients.
Riguarda la medicina personalizzata come "modello che utilizza la
caratterizzazione del fenotipo e del genotipo degli individui per
personalizzare la strategia terapeutica per la persona giusta al
momento giusto, e/o per determinare la predisposizione alla malattia
e/o per erogare tempestivamente interventi di prevenzione mirati".
Invita gli Stati membri a sviluppare politiche centrate sul
paziente e basate sull'uso delle informazioni genomiche, integrandole
nei programmi di sanita' pubblica e di ricerca e, nel contempo,
assicurando l'adeguata valutazione delle nuove conoscenze e la
sostenibilita' del sistema sanitario nazionale. Le conclusioni, tra
l'altro (v.), forniscono indicazioni sull'equita' di accesso ai
servizi, sull'approccio multidisciplinare, sul coinvolgimento degli
stakeholders, sulla comunicazione, sulla formazione dei
professionisti, sull'importanza dell'acquisizione di nuove conoscenze
(biobanche ecc.) per lo sviluppo di nuove tecnologie.
- Intesa Stato Regioni e PPAA del 13/3/13 recante "Linee di
indirizzo sulla genomica in sanita' pubblica".
L'Intesa ha lo scopo di fornire, in modo sistematico e organico,
indirizzi generali che consentano il governo di questa tematica -
fortemente innovativa e strategica per il futuro del SSN -
nell'ambito della sanita' pubblica. A tale scopo vengono identificate
le azioni finalizzate a definire una "capacita' di sistema" adeguata
all'entita' delle sfide che i progressi nelle scienze genomiche
offrono e pongono al sistema sanitario.
- Intesa Stato Regioni e PPAA del 30/10/14 recante "Documento
Tecnico di indirizzo per ridurre il carico di malattia del cancro"
L'intesa, nel quadro delle azioni necessarie alla lotta contro il
cancro, sottolinea l'importanza di sviluppare pienamente le
potenzialita' della genomica e della proteomica come definizione
della suscettibilita' individuale; ribadisce inoltre che, in
relazione alla grande crescita di conoscenze genetiche nella ricerca
di base e nell'applicazione agli individui, e' emergente la
necessita' di governare lo sviluppo di tale ricerca, la valutazione
della sua applicabilita' nell'ambito del sistema sanitario, in
particolare della prevenzione, e la costruzione di una rete per
promuovere gli obiettivi della genomica a livello di popolazione.
- Piano Nazionale della Prevenzione 2014-18 (di cui all'intesa
Stato regioni e PPAA del 13/11/14).
Il PNP, nell'ambito della lotta alle malattie croniche non
trasmissibili, identifica uno specifico obiettivo riguardante la
prevenzione secondaria del tumore della mammella dovuto a rischio
genetico (Definizione di percorsi diagnostico-terapeutici integrati
con i programmi di screening).
- DM 13/2/16 Documento di indirizzo per l'attuazione delle linee di
supporto centrali al Piano Nazionale della Prevenzione 2014-2018.
Il DM definisce due linee strategiche:
- una pianificazione finalizzata all'innovazione
dell'erogazione dei servizi: si tratta di promuovere sistematicamente
l'adeguamento dell'erogazione dei servizi con le acquisizioni della
genomica soprattutto rispetto agli obiettivi gia' identificati dal
PNP 2014-18 come maggiormente sfidanti per il sistema paese
(innanzitutto, le malattie croniche non trasmissibili-macro-obiettivo
1). Tale linea strategica e' sostanzialmente imperniata sul Consiglio
Superiore della Sanita' e in particolare sull'obiettivo assegnato al
"Tavolo per la genomica" di proporre uno specifico atto di
pianificazione;
- la promozione di una capacita' di sistema, secondo le
seguenti priorita': promuovere una autonoma ma non autarchica
capacita' di analisi dei Big data; rendere normativamente agevole il
data-sharing, comprensivamente della normazione per la privacy;
regolamentare l'acquisto on-line dei test genetici (in collaborazione
con gli altri Paesi europei); definire un assetto di sistema delle
valutazioni HTA applicate a questo campo; promuovere la literacy e il
capacity building del mondo professionale e degli utilizzatori
finali.
In definitiva, oltre allo scopo di valorizzare le acquisizioni
della genomica innanzitutto a sostegno degli e in coerenza con gli
obiettivi del PNP, si definisce quello di promuovere un complessivo
innalzamento delle capacita' di sistema di promuovere, governare e
gestire il previsto impetuoso sviluppo delle conoscenze genomiche.
- "Linee guida per le attivita' di Genetica Medica" approvate dalla
Conferenza Permanente per i Rapporti fra Stato e Regioni e le
Province Autonome di Trento e Bolzano (G.U. n. 224 del 23.09.2004),
che forniscono le indicazione per la corretta organizzazione e
sviluppo delle attivita' di genetica medica. Successivamente, con
proprio Decreto il Ministero della Salute (D.M. 8 Maggio 2007) ha
costituito un'apposita Commissione Nazionale con il compito di dare
attuazione alle suddette linee guida definendo i servizi di Genetica
Medica e il loro ruolo nell'ambito del Servizio Sanitario Regionale,
fissare i criteri per la certificazione e l'accreditamento
istituzionale delle strutture di Genetica Medica, pianificarne le
attivita' per l'utilizzo ottimale delle risorse del SSN e SSR da
destinarvi, fornire indicazioni sul corretto utilizzo dei test
genetici, determinare le forme di collegamento con la rete delle
malattie rare, definire indicatori di valutazione economica, fissare
regole sulla pubblicizzazione e sulla promozione dei test genetici e
sulla consulenza genetica, procedere alla divulgazione di
raccomandazioni basate sull'evidenza scientifica in tema di Genetica
medica.
Nel successivo Accordo sull'"Attuazione delle linee guida per le
attivita' di genetica medica" n. 241 del 26-11-2009, si sottolinea
come i test genetici costituiscano un importante strumento
diagnostico che prevede una valutazione clinica preliminare delle
indicazioni ed una successiva interpretazione con il coinvolgimento
non solo dell'individuo ma anche dei familiari, e si invitano le
Regioni ad impegnarsi a promuovere ed adottare percorsi
diagnostico-assistenziali aderenti alle linee guida nazionali.
1.b Vision, principi, struttura e obiettivi generali
Vision
Il presente Piano postula, all'interno dell'assetto istituzionale
attuale e relativamente alle materie trattate, un SSN che vuole:
- essere pienamente consapevole della profonda, copernicana
innovativita' delle scienze 'omiche' per gli effetti possibili sulla
salute degli individui e delle popolazioni, sull'innovazione
tecnologica, sulla spinta propulsiva allo sviluppo dell'intero
sistema Paese;
- esprimere una strategia di 'governo dell'innovazione' della
genomica ma anche inserirla nell'attuale contesto pianificatorio /
programmatorio;
- cogliere con prudenza e saggezza le opportunita' attualmente
gia' offerte dalla genomica come contributo alle sfide gia' in atto e
al raggiungimento degli obiettivi di salute gia' definiti.
Principi
- Il Piano recepisce gli obiettivi sottoscritti a livello
internazionale e incorpora gli obiettivi gia' decisi all'interno di
Piani nazionali di settore. Nel fare cio' intende promuovere
l'armonizzazione degli obiettivi formalizzati in tali atti garantendo
un approccio complessivo di sanita' pubblica.
- Il Piano fissa obiettivi supportati da strategie ed azioni
evidence based, in grado nel medio-lungo termine di produrre un
impatto sia di salute sia di sistema e quindi di essere realizzati
attraverso interventi sostenibili e "ordinari".
- Il Piano nel definire i propri obiettivi riconosce che e' in
corso (e che esso stesso contribuira' a) un rapido evolversi delle
conoscenze basate sulla genomica (e su scienze affini) e quindi
incorpora elementi di sviluppo e prevede un processo continuo e per
quanto possibile tempestivo di aggiornamento.
- Il Piano riconosce l'importanza fondamentale della genesi e
fruizione della conoscenza e pertanto riconosce la genesi di
informazioni e la loro valutazione come elementi infrastrutturali
indispensabili per il raggiungimento degli obiettivi di salute.
- Le azioni previste come attuative degli obiettivi di questo
Piano tengono in conto:
- il carattere universalistico del nostro sistema sanitario e
la garanzia dell'equita'
- le implicazioni etiche, legali e sociali
- un approccio Life-course
- l'empowerment degli individui e delle comunita'
- l'importanza della responsabilita' nella produzione,
condivisone e uso dei dati.
Struttura del piano
La struttura del piano e' finalizzata a identificare obiettivi
specifici per le strutture del sistema sanitario, in riferimento
quindi alla attuale tripartizione dei macrolivelli di assistenza di
cui al DPCM 29/11/2001 (assistenza sanitaria collettiva, assistenza
distrettuale, assistenza ospedaliera).
In particolare, i contenuti saranno articolati tenendo conto
dell'apporto della genomica rispetto a: prevenzione, diagnosi e
terapia.
Nell'affrontare i contenuti, sara' applicata la seguente struttura
logica (che diventa il 'quadro logico centrale' del presente Piano):
a) Genesi della conoscenza: quale e' la conoscenza disponibile?
Questo primo 'aspetto' nella scrittura riguarda il fatto che la
produzione e la sintesi della nuova conoscenza alla base del presente
atto di pianificazione assume alcuni caratteri innovativi. Quindi,
oltre al 'razionale' scientifico di merito sembra opportuno
evidenziare le 'innovazioni' possibili e sostenibili nel SSN. Tra
questi emerge, sia sul piano epistemologico che organizzativo, il
problema di "Interrogare i Big Data".
b) Fruibilita' della conoscenza: quali conoscenze sono
utilizzabili e mediante quali strumenti?
Questo aspetto definisce innanzitutto il campo delle nuove
conoscenze basate sulla genomica che hanno, secondo i criteri HTA,
sufficiente forza di evidenza da potere essere implementati (nonche'
in generale di "utilizzabilita'" secondo i principi ELSI), e le
relative modalita' di erogazione degli stessi (v. anche dopo).
c) Definizione del processo sanitario: quale sequenza di atti
tecnico-professionali e' evidence-based per raggiungere l'obiettivo
di salute?
Questo aspetto ambisce a identificare quali siano sul piano delle
evidenze scientifiche le 'conseguenze' operative (finalizzate ad un
radicale riorganizzazione dei servizi) per la gestione dei cittadini
e dei pazienti (mediante produzione di linee-guida ecc).
d) Erogazione dei servizi: sulla base degli aspetti trattati nei
paragrafi precedenti, quali strumenti sono necessari per innovare
l'erogazione dei servizi?
Questo aspetto riguarda gli strumenti (protocolli, percorsi
diagnostico-terapeutici, sistemi d accreditamento) che dovranno
essere messi a disposizione delle Regioni per l'organizzazione
innovativa dei propri sistemi sanitari.
e) Valutazione: quali sistemi sono utilizzabili/devono essere
progettati per valutare l'innovazione pianificata?
Questo aspetto riguarda il disegno e l'implementazione di sistemi
di valutazione di processo e di impatto (a carattere ricorsivo) e la
definizione di indicatori.
Gli obiettivi generali del Piano
Questo Piano identifica i seguenti obiettivi generali:
1) Traferire le conoscenze genomiche nella pratica dei servizi
sanitari, in un approccio che metta al centro l'individuo.
2) Aumentare l'efficacia degli interventi di prevenzione,
diagnosi e cura delle malattie a piu' alto burden tenendo in conto le
differenze individuali relativamente a patrimonio genetico, stili di
vita e ambiente e fornendo ai professionisti le risorse necessarie
alla personalizzazione degli interventi.
3) Promuovere l'innovazione culturale, scientifica e tecnologica
del sistema sanitario.
Bibliografia
1. Healthy People U.S. Department for Health and Human Services
Offices of Disease Prevention and Health promotion
https://www.healthypeople.gov/
2. Global Action Plan for the Prevention and Control of NCDs
2013-2020. http://www.who.int/nmh/events/ncd_action_plan/en/
3. Boccia S. Why is personalized medicine relevant to public
health? Eur J Public Health 2014;24:349-50
4. Healthcare, E.S.G.o.S., Acting Together: A roadmap for
sustainable healthcare, in White Paper. 2014
5. Beyond Public Health Genomics A Framework for Future
Personalised Healthcare
6.
http://www.healthypeople.gov/2020/topics-objectives/topic/genomics
7. Floridi L The 4th Revolution Oxford University Press 2014
8. Council conclusions on personalized medicine for patients
adopted by the Council at its 3434th meeting held on 7 December 2015;
http://data.consilium.europa.eu/doc/document/ST-15054-2015-INIT/en/pd
f
CAPITOLO 2
Basi scientifiche e concettuali delle tecniche omiche.
- Origine del suffisso -oma. Il suffisso "-oma/omica" assume
significati diversi a seconda del campo di applicazione. In biologia
cellulare e molecolare viene in genere utilizzato per caratterizzare
e quantificare insiemi di molecole biologiche rappresentative della
struttura, funzione e dinamica di uno o piu' organismi. Le prime
utilizzazioni di questo suffisso risalgono all'800 quando vennero
coniati i termini "rizoma" (1832; modificazione del fusto di una
pianta, di solito a decorso orizzontale, con funzioni di riserva) e
"scleroma/rinoscleroma" (1870; una malattia batterica, cronica,
granulomatosa), seguite, a distanza di diversi anni, dai termini
"mitoma" (1913; la parte piu' densa del protoplasma di una cellula),
"bioma" (1916; complesso delle comunita' climax mantenuto dalle
condizioni ambientali di una regione e distinto dalle altre
comunita') e "genoma", un sostantivo coniato da Hans Winkler nel
1920, correntemente utilizzato per indicare la totalita' aploide del
DNA contenuto nella cellula di un organismo.
I bioinformatici ed i biologi molecolari sono stati tra i primi ad
utilizzare su larga scala il suffisso "-oma", che oggi annovera oltre
1000 neologismi.
- Dalla Citogenetica alla citogenomica. L'analisi citogenetica ha
rappresentato, dal punto di vista storico, il primo esempio
traslazionale di analisi del genoma, sia pure a bassissima
risoluzione. Infatti, le tecniche citogenetiche standard, ad una
risoluzione media di 320 bande, consentono di identificare
riarrangiamenti (patologie cromosomiche) di dimensioni di poco
inferiori alle 10 megabasi (Mb), ovvero 10 milioni di basi, mentre le
tecniche molecolari hanno livelli risolutivi significativamente piu'
elevati, da svariate chilobasi (una kb = 1000 coppie di basi), alle
singole basi.
Negli anni '80 la citogenetica ha sviluppato alcuni protocolli in
grado di analizzare le piastre cromosomiche decondensate, allo stadio
prometafasico o profasico, permettendo di ottenere risoluzioni
crescenti del genoma e di standardizzare ideogrammi contenenti fino a
850 bande per assetto cromosomico aploide, riuscendo cioe' a
raddoppiare il livello di definizione, rispetto ai preparati
metafasici standard (cosiddette tecniche ad alta risoluzione).
Una parte del significativo divario esistente tra l'analisi del
cromosoma visibile al microscopio ottico ed il gene e' stato colmato
dalle tecniche di citogenetica molecolare. La prima applicazione di
questo tipo sui vetrini dei preparati cromosomici, l'ibridazione in
situ, permetteva di riconoscere sulle cellule o sui cromosomi
specifiche sequenze di acidi nucleici. Questa tecnica si basava sulla
ibridizzazione, sui cromosomi acrocentrici, dell'RNA ribosomiale
marcato con isotopi radioattivi e forniva una nuova dimensione allo
studio dei cromosomi, in quando facilitava la visualizzazione, sui
preparati, di sequenze complementari di DNA o di RNA. L'uso di
molecole fluorescenti degli anni '80 ha consentito di sviluppare e
standardizzare l'ibridazione in situ fluorescente (FISH), basata sul
legame diretto (combinato con un fluorocromo) o indiretto (attraverso
una molecola intermedia incorporata nella sonda) con le basi del DNA.
In questo modo e' stato possibile elevare significativamente la
risoluzione dell'analisi ed identificare riarrangiamenti cromosomici
submicroscopici, creando una vera e propria rivoluzione citogenetica
(la seconda dopo l'introduzione delle tecniche di bandeggiamento).
Negli anni sono state messe a punto varie tecniche di crescente
sensibilita', basate sulla FISH, e sono stati sviluppati strumenti
sempre piu' sofisticati per l'acquisizione digitale, il
pre-processamento e l'analisi digitale delle immagini. Queste
tecniche hanno consentito di utilizzare simultaneamente una o piu'
sonde di DNA.
L'ibridizzazione genomica comparativa (CGH) e' una tecnica che, con
un singolo esperimento, analizza sui cromosomi le variazioni del
numero delle copie (CNV), in termini di guadagno/duplicazione o
perdita/delezione. Sviluppata all'inizio degli anni '90, si basa su
una FISH quantitativa a due colori, che analizza direttamente il DNA.
Sebbene questa tecnica abbia segnato un sostanziale progresso nella
risoluzione degli sbilanciamenti genomici, il guadagno di
informazione risultava ancora relativamente limitato (<3Mb) rispetto
a quella dei preparati cromosomici bandeggiati. In questo contesto ha
rappresentato un significativo progresso, alla fine degli anni '90,
lo sviluppo di strumenti di CGH basati sugli array (array-CGH), nei
quali i cromosomi metafasici sono stati sostituiti da sequenze di DNA
adese ad un vetrino di supporto. L'array-CGH ha percio' sostituito in
larga misura l'analisi citogenetica nella pratica clinica. Il suo
principio e' sostanzialmente quello della CGH e si basa su
un'ibridizzazione genomica comparativa che utilizza come substrato un
array anziche' le metafasi.
Con gli SNP-array, basati sui polimorfismi dei singoli nucleotidi,
e' stata ottenuta una risoluzione fino a 5-10 kb. In questi casi non
e' necessaria la co-ibridizzazione del DNA di riferimento e del
campione in esame, in quanto quest'ultimo puo' essere ibridizzato
direttamente sull'array. Oltre a fornire informazioni sulle
variazioni nel numero delle copie (CNV), queste piattaforme
consentono di identificare le regioni di omozigosi e percio' i geni
potenzialmente correlati alle malattie recessive, le aneuploidie in
mosaico e le disomie uniparentali. La capacita' diagnostica di queste
tecniche puo' essere ulteriormente ottimizzata dalla associazione,
sulla stessa piattaforma, dell'array-CGH e dello SNP-array.
La risoluzione degli array viene definita dal numero, dalle
dimensioni e dalla distribuzione dei frammenti di DNA sul vetrino e
correla con il numero dei frammenti fissati. Il loro limite resta
l'impossibilita' di identificare i riarrangiamenti cromosomici
bilanciati.
In conclusione, le analisi citogenetiche e le tecniche di
citogenetica molecolare offrono la possibilita' di indagare il genoma
umano a diversi livelli di risoluzione, per finalita' diagnostiche e
di ricerca. Sebbene le tecniche di citogenetica standard e
molecolare, basate sulla FISH, siano state progressivamente
sostituite dagli array, l'analisi dei cromosomi bandeggiati resta
ancora la tecnica maggiormente utilizzata a livello mondiale per
l'analisi genomica.
In parallelo con il progressivo aumento del numero delle malattie
genomiche e cromosomiche diagnosticate con le analisi citogenetiche e
citogenomiche, e' diventato sempre piu' difficile riconoscere, in
base al solo fenotipo clinico, la specifica condizione presente in un
paziente. Anche se l'array-CGH e' diventato uno strumento consolidato
di diagnosi e da tempo sono disponibili algoritmi in grado di
definire il numero delle copie, la risoluzione delle piattaforme e'
in continuo sviluppo. I dati clinici e citogenetici raccolti nei
database a libero accesso contribuiscono a conoscere le combinazioni
delle varianti ad effetto patogenetico, ma al momento resta ancora
spesso problematico differenziare le perdite e le acquisizioni di
significato patogenetico. Per questo, nella pratica corrente, le CNV
vengono ancora classificate come "benigne" o varianti genomiche
normali, "patogenetiche" o di potenziale rilevanza clinica, e di
"incerto" significato clinico (o VUS - Variant of Unknown
Significance). Il numero delle tecnologie applicate allo studio del
genoma umano e' in continua trasformazione. L'uso di piattaforme per
il sequenziamento di seconda generazione si e' progressivamente
trasferito dalla ricerca nella pratica clinica. Si tratta di tecniche
per molti aspetti alternative ai microarray, anche se, analogamente
ad essi, al momento non risolvono tutti i problemi di tipo
interpretativo.
- Dal sequenziamento di un gene a quello dell'intero genoma. Le
prime metodologie di sequenziamento del DNA risalgono agli anni '70.
Tra queste, la strategia sviluppata da Sanger, basata sul metodo
enzimatico dei terminatori di catena e sulla migrazione
elettroforetica dei prodotti della reazione di sequenziamento, e'
ancora oggi ampiamente utilizzata per il sequenziamento di singoli
frammenti di DNA, Questo metodo, che consente di ottenere prodotti di
sequenziamento lunghi fino a 800-1000 basi, e' stato automatizzato
per aumentarne la processivita'. Tuttavia, le limitazioni intrinseche
alla metodologia (alto costo di esecuzione e bassa efficienza) non
permettono la sua applicazione nel sequenziamento su larga scala.
Piu' recentemente, sono state sviluppate nuove metodologie, riunite
sotto il nome di sequenziamento ad elevato parallelismo o
sequenziamento di seconda generazione (cosiddetto Next Generation
Sequencing - NGS), che hanno la capacita' di sequenziare molti
frammenti di DNA contemporaneamente, anche se con efficienza minore
in termini di numero di basi sequenziate per frammento. Queste nuove
tecnologie possono fornire, a prezzo contenuto, milioni di sequenze
di DNA per singolo esperimento e, grazie alla loro alta
processivita', consentono di acquisire un'enorme quantita' di
informazioni sul patrimonio genetico individuale. Il loro uso rende
possibile, ad esempio, il sequenziamento di un intero genoma in pochi
giorni, un'analisi che richiederebbe anni per essere completata con
le tecniche tradizionali di sequenziamento. Queste tecnologie, anche
grazie allo sviluppo degli strumenti bioinformatici richiesti per la
gestione e l'analisi dei dati di sequenziamento, consentono di
raggiungere obiettivi impensabili fino a pochi anni fa, sia sul piano
della ricerca, rendendo piu' facile l'individuazione di nuovi geni
implicati nelle malattie rare e ultra-rare, sia sul piano clinico,
favorendo lo sviluppo di test diagnostici piu' rapidi ed efficienti.
La maggior parte delle malattie geniche sono eterogenee, cioe'
possono essere causate dalle mutazioni di geni diversi. La loro
diagnosi molecolare ha utilizzato in prevalenza, per alcuni lustri,
il sequenziamento secondo un approccio gene per gene. Tuttavia, nelle
malattie causate dalla mutazione di molti geni, potenzialmente
diversi nei singoli pazienti, questo approccio e' costoso e richiede
molto tempo, addirittura mesi o anni. Le tecniche di sequenziamento
di seconda generazione consentono di superare tali limiti e molti
laboratori le utilizzano oggi correntemente per caratterizzare il
difetto molecolare delle malattie rare. Queste tecniche consentono di
arricchire specifiche regioni genomiche (geni-malattia), sequenziare
massivamente e in parallelo ampi tratti di DNA delle regioni
selezionate ed analizzare diversi pazienti contemporaneamente.
Utilizzando le tecniche NGS e' possibile analizzare fino a 96
campioni contemporaneamente, ciascuno per il pannello dei
geni-malattia responsabili della condizione sospettata a livello
clinico, ed ottenere dati analizzabili in circa 10-15 giorni. Le NGS
hanno percio' rivoluzionato i protocolli dei test genetici, in quanto
consentono di ottenere diagnosi molecolari in tempi brevi, ad un
costo ridotto, mantenendo elevata la qualita' dei risultati. Inoltre,
hanno portato notevoli vantaggi a livello clinico, sia nel caso delle
malattie ad elevata eterogeneita', sia in quelle associate ad un
fenotipo sfumato, in cui puo' risultare maggiormente problematico
ipotizzare il gene causativo coinvolto. Infatti, l'analisi simultanea
di tutti i geni potenzialmente associati alla malattia in esame,
riduce i tempi necessari ad identificare il difetto molecolare,
migliorando la presa in carico e la consulenza genetica.
L'elevata potenzialita' delle tecniche NGS ne ha determinato l'uso
routinario nella diagnostica molecolare, in particolare nello studio
delle malattie che condividono segni clinici, come ad esempio le
Rasopatie (malattie collegate alle mutazioni dei geni della cascata
di RAS). E' stato dimostrato che, in questi pazienti, l'uso di un
pannello NGS contenente i geni-malattia noti riduce di circa otto
volte i tempi necessari ad identificare il difetto molecolare e di
circa sei volte i costi dell'analisi, rispetto al tradizionale
sequenziamento Sanger. Inoltre permette, nei casi dubbi, di
identificare il difetto molecolare prima dell'inquadramento clinico.
L'applicazione delle tecniche NGS, oltre ad essere utile nello
studio delle malattie ad elevata eterogeneita', e' importante anche
nella diagnosi molecolare delle patologie causate dalla mutazione di
geni di grosse dimensioni e delle malattie spesso causate da
mutazioni in mosaico, ad esempio la sclerosi tuberosa, una malattia
rara caratterizzata dallo sviluppo di tumori benigni, in particolare
sulla pelle, nel cervello e nei reni.
L'analisi basata sulle tecniche NGS ha prodotto una significativa
accelerazione nello studio delle malattie genetiche e spesso e'
risolutiva nell'inquadramento dei pazienti. Tuttavia, considerato
l'elevato numero di regioni genomiche analizzate nel singolo
paziente, identifica varianti di incerto significato, che possono
creare problemi interpretativi, con ricadute negative sulla gestione
clinica del paziente e sulla strutturazione della consulenza
genetica. E' percio' indispensabile che i pazienti analizzati
mediante NGS siano correttamente informati attraverso una consulenza
genetica pre-test delle potenzialita' e dei limiti della tecnica e
che i risultati del test siano spiegati e commentati attraverso una
consulenza successiva all'analisi.
- Analisi esomica. Sebbene il sequenziamento dell'intero genoma
sia la strategia d'eccellenza per lo studio della variabilita'
genetica interindividuale, esso presenta ancora alcune problematiche
che ne limitano l'applicazione su larga scala, in particolare le
capacita' computazionali richieste per l'analisi e l'archiviazione
dell'enorme massa di dati prodotta. Per queste ragioni, le tecniche
di sequenziamento di seconda generazione vengono oggi spesso
utilizzate per sequenziare l'esoma, cioe' la porzione codificante del
genoma. Con questo approccio, basato sull'arricchimento dei frammenti
genomici che si riferiscono alle sequenze geniche codificanti per
proteine e per sottoclassi selezionate di RNA che hanno una funzione
regolatoria (cioe' microRNA), e' possibile esaminare solo una piccola
porzione del genoma (1-2%). Questa analisi non prende in
considerazione le regioni non codificanti del genoma, che peraltro
possono avere un impatto sull'espressione genica. Tuttavia, in base
alle attuali conoscenze sulle cause genetiche delle malattie
mendeliane, e' largamente accettato che la maggior parte delle
mutazioni responsabili delle malattie mendeliane causi cambiamenti
nella sequenza codificante di un gene o determini un processamento
aberrante del trascritto. Per questo motivo, l'esoma rappresenta un
sottoinsieme particolarmente arricchito del genoma nel quale e' utile
cercare eventuali mutazioni di potenziale impatto funzionale. In
accordo con questa nozione, il sequenziamento mirato della porzione
codificante del genoma si e' dimostrato un approccio particolarmente
efficiente per comprendere le basi molecolari delle malattie
mendeliane, al punto che negli ultimi anni ha consentito di
identificare oltre 500 geni-malattia.
Nonostante che i dati prodotti dal sequenziamento di un esoma siano
maggiormente maneggevoli rispetto a quelli ottenuti dal
sequenziamento dell'intero genoma, la fase di analisi e di
interpretazione delle varianti rappresenta una sfida piuttosto
complessa. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati numerosi
strumenti bioinformatici per il processamento, l'analisi e
l'annotazione dell'informazione contenuta in un esoma. In generale,
le piattaforme di sequenziamento generano un'enorme quantita' di dati
grezzi, che vengono convertiti in sequenze nucleotidiche mediante
strumenti computazionali. I file cosi' generati di solito si trovano
in un formato che contiene, oltre alla lettura delle sequenze
nucleotidiche, score di qualita' associati ad ogni base letta. La
risoluzione a singola base di un esoma richiede l'analisi di questi
file mediante l'uso di un complesso flusso di lavoro bioinformatico
che permette, in una prima fase, di allineare le sequenze prodotte al
genoma di riferimento e, successivamente, di identificare e annotare
funzionalmente le varianti che lo caratterizzano. La fase di
allineamento viene eseguita con sistemi computazionali che
confrontano ciascuna delle sequenze prodotte con il genoma di
riferimento, permettendone il loro corretto posizionamento. Per
garantire l'affidabilita' di questi sistemi ed ottenere una
valutazione globale dell'efficienza di sequenziamento, si applicano
di solito diversi parametri di qualita'. Tra essi, particolarmente
rilevanti sono la copertura (coverage), cioe' la percentuale di
sequenze genomiche bersaglio coperte dal sequenziamento, e la
profondita' (depth), ossia il numero di letture riferite ad una
specifica base della sequenza genomica d'interesse. La fase
successiva dell'approccio bioinformatico e' la "chiamata delle
varianti ", che identifica i siti varianti in cui le sequenze
allineate differiscono dalle sequenze note nella posizione di
riferimento. Le varianti cosi' ottenute, possono essere processate
con metodi euristici di prioritizzazione e filtraggio, al fine di
ridurre l'alto numero di varianti annotate e selezionare quelle con
significato funzionale. Generalmente, nella prima fase di questo
approccio vengono eliminate le varianti polimorfiche che si suppone
non abbiano un impatto patologico su un fenotipo assunto come "raro".
A tale scopo, si utilizzano di solito banche-dati pubbliche come
dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) e ExAC
(http://exac.broadinstitute.org/), che permettono di identificare le
varianti di bassa frequenza nella popolazione o non annotate. In una
seconda fase, si raccolgono e valutano le informazioni disponibili su
ciascuna variante e sul relativo gene, in modo da ordinare, per
priorita', le prime in base al loro effetto predetto, ed i geni in
base alla loro rilevanza biologica (ad es. espressione, funzione),
rispetto al fenotipo d'interesse. Per l'annotazione e la predizione
funzionale delle varianti si utilizzano diversi strumenti, ognuno dei
quali ha punti di forza e debolezza. Per questa ragione, in genere si
consiglia di attuare una strategia di prioritizzazione in grado di
sfruttare piu' strumenti di predizione. Ad esempio, in questo
contesto, un metodo recente, dbNSFPv.2.0 (database for Nonsynonymous
SNPs' Functional Predictions), facilita questo processo perche'
integra gli score di previsione e di conservazione derivati da alcuni
dei piu' comuni algoritmi in uso. Data la sua potenzialita', questo
strumento bioinformatico e' facilmente applicabile al filtraggio ed
alla prioritizzazione delle varianti ottenute per lo studio delle
malattie mendeliane. Analogamente, sono stati sviluppati diversi
strumenti per integrare l'informazione disponibile nelle banche-dati
e facilitare approcci di prioritizzazione basati su criteri
oggettivi.
Il sequenziamento dell'esoma si e' dimostrato particolarmente
efficiente in ambito diagnostico. Recenti studi concordano per una
detection rate del 40% circa per le patologie senza nome o con
diagnosi non accertata. Occorre tuttavia precisare che il successo
nel raggiungere una diagnosi su base molecolare attraverso il
sequenziamento dell'esoma puo' variare considerevolmente in base al
tipo di patologia in esame ed alla strategia di sequenziamento
utilizzata (analisi del solo probando vs analisi del nucleo
familiare). L'uso del sequenziamento dell'esoma nella pratica clinica
ha confermato le grandi potenzialita', ma anche la difficolta' di
interpretazione dei dati ottenuti, particolarmente nel caso delle
varianti in precedenza non annotate. Si deve anche considerare
l'aspetto relativo all'identificazione delle variazioni di sequenza
nei geni implicati in malattie non correlate con il quadro clinico
che ha motivato l'accertamento molecolare. Questo problema e'
particolarmente rilevante per il maggior potere risolutivo
dell'analisi esomica e per l'attuale scarsa conoscenza sulla ricaduta
fenotipica della maggior parte delle varianti genetiche.
Occorre infine sottolineare che i dati attualmente disponibili
indicano che il tasso di errore del sequenziamento di seconda
generazione e' basso, ma non trascurabile, ed e' strettamente
dipendente dal tipo di variazione (singolo cambiamento nucleotidico
vs inserzione/delezione di piu' basi) e dal suo contesto di sequenza.
Di conseguenza, e' sempre necessario validare la variante selezionata
con il sequenziamento Sanger che rappresenta, ancora oggi, il metodo
di sequenziamento di riferimento.
- Sequenziamento dell'intero genoma. Le tecniche di
sequenziamento di seconda generazione hanno reso possibile l'analisi
dell'intero genoma a costi e tempi stimati oggi oltre 100mila volte
piu' bassi rispetto a quelli necessari nel 2000, quando e' stata
prodotta la prima mappa del genoma umano. In pratica si e' passati
dagli oltre 100 milioni di dollari e dai tempi allora necessari, che
venivano misurati in anni, ad un migliaio di dollari e a pochi giorni
per il completamento di questi studi. Di conseguenza, oggi sono
diventati in proporzione significativamente piu' elevati i costi
dell'analisi bioinformatica, necessaria ad interpretare i milioni di
dati prodotti, rispetto a quelli della genotipizzazione.
Le analisi genome wide hanno avuto un grande impatto nella
comprensione delle differenze e percio' della variabilita'
interindividuale e hanno dato un senso ad una celebre affermazione di
Sir William Osler, risalente al 1892, che asseriva "se non esistesse
la variabilita' tra le persone la medicina sarebbe una scienza e non
un'arte", a sottolineare che "esistono i malati, non le malattie".
Per lungo tempo il senso di questa variabilita' non e' apparso
chiaro, anche se, proprio in quel periodo, una scuola di pensiero,
quella del determinismo, tendeva a ricondurla alle caratteristiche
ereditate al momento del concepimento, in un momento in cui si era
ancora ben lontani dal comprenderne le basi biologiche. Nel secolo
scorso, di pari passo con la scoperta della struttura e della
funzione del DNA, si e' affermato il concetto che lo stato di salute
e di malattia sono il risultato dell'interazione tra le
caratteristiche genetiche e l'ambiente. E' diventato contestualmente
chiaro che, mentre alcune malattie sono prioritariamente
riconducibili ai fattori genetici (patologie cromosomiche, genomiche,
mendeliane, mitocondriali) ed altre all'ambiente (traumi, ustioni,
ecc.), altre ancora, in particolare molte malattie comuni
(cardiovascolari, diabete, ipertensione, osteoporosi, ecc.) e diversi
difetti congeniti (cardiopatie congenite, difetti del tubo neurale,
labio-platoschisi, ecc.), originano dall'effetto additivo tra la
suscettibilita' geneticamente determinata e l'ambiente. La componente
genetica di questo sistema complesso e' definita "ereditabilita'"
(h2) ed e' percio' riconducibile alle caratteristiche del genoma,
mentre la componente ambientale, intesa come alimentazione, farmaci,
microbioma, stili di vita, e' sintetizzabile nell' "esposoma",
letteralmente tutto cio' a cui siamo esposti e con cui veniamo a
contatto nel corso della nostra esistenza.
La rivoluzione genetica e' stata trainata dalla rivoluzione
tecnologica, che ha permesso di indagare per la prima volta i
meccanismi biologici della variabilita' interindividuale, nonche'
dell'ereditabilita'. E' stato cosi' scoperto che le persone
differiscono tra loro di circa 4 milioni di basi, che circa una base
ogni 200 basi e' diversa e che ogni persona possiede oltre 1500
variazioni che la rendono diversa rispetto alle mappe di riferimento.
L'unicita' dell'individuo e' ulteriormente definita dalle variazioni
funzionali dei geni (il trascrittoma) e dei loro prodotti (proteoma e
metaboloma), che variano nel tempo a livello tessutale e cellulare.
Questo aspetto e' bene illustrato dallo studio dei gemelli identici
che, pur condividendo lo stesso patrimonio genetico, negli anni
tendono a divergere sempre piu' a livello del loro fenotipo clinico,
in particolare per l'effetto modulante dell'esposoma sul genoma,
nonche' delle mutazioni somatiche.
A partire dal 2005, sono stati eseguiti oltre 2000 studi genome
wide che hanno reclutato individualmente migliaia o diverse decine di
migliaia di pazienti affetti da oltre 250 malattie complesse ed un
numero analogo di soggetti non affetti, con lo scopo di identificare
eventuali variazioni (mutazioni comuni o polimorfismi)
differentemente rappresentati nei due gruppi. Le differenze osservate
tra gli affetti ed i controlli sono riuscite a definire geni e
regioni genomiche potenzialmente associate alla malattia in esame,
che concorrono percio' alla sua ereditabilita'. Complessivamente sono
state identificate oltre 12.000 variazioni. Tuttavia, il potere
predittivo dei singoli polimorfismi e' basso, con un rischio
aggiuntivo medio di 1,1-1,5; inoltre al momento, fatto salve alcune
eccezioni, questi studi hanno definito solo il 15% o meno
dell'ereditabilita' delle singole malattie; infine, l'impatto
traslazionale di queste ricerche rimane molto limitato, anche perche'
la frequenza di molti polimorfismi varia in maniera spesso molto
significativa nelle diverse popolazioni e gli studi effettuati in una
determinata area geografica necessitano di essere verificati e
validati sulle altre popolazioni, prima di essere utilizzati a
livello clinico. Pur con queste cautele, che rendono problematico il
trasferimento delle ricerche nella consulenza genetica, non va
ignorato che questo limitato potere predittivo non e' in certi casi
inferiore a quello in base al quale oggi viene calcolato il rischio
mediante test non-genetici, utilizzati nella clinica, come ad esempio
quelli relativi ai livelli del colesterolo LDL o agli antigeni
prostata-specifici.
Non vi e' dubbio che le analisi genomiche stiano comunque
contribuendo alla comprensione delle basi biologiche delle malattie e
dei caratteri poligenici. Cosi', ad esempio, alcuni studi hanno
riscoperto una serie di geni indiziati da tempo per essere implicati
in queste condizioni, oppure che erano gia' noti per essere mutati in
alcune malattie mendeliane correlate; inoltre hanno evidenziato
l'importanza di certi geni che codificano per i siti di azione di
alcuni farmaci, come la sulfonilurea (negli studi del diabete tipo
2), le statine (negli studi che indagano i meccanismi di controllo
dei livelli lipidici), gli estrogeni (negli studi sulla densitometria
dell'osso), suggerendo potenziali strategie per la terapia delle
malattie comuni. Infine, alcuni studi hanno messo in correlazione
certe malattie complesse con nuove vie metaboliche. Ad esempio, le
variazioni geniche associate alla degenerazione maculare senile hanno
dimostrato la criticita' di alcune componenti del sistema del
complemento, mentre gli studi sulle malattie infiammatorie croniche
dell'intestino, in particolare la malattia di Crohn, hanno
evidenziato l'importanza dell'autofagia e dell'interleukina-23, e
quelli sulla statura il ruolo dei geni che codificano proteine della
cromatina e della via di hedgehog (una famiglia di geni che
codificano segnali induttivi durante l'embriogenesi), in particolare
una proteina secreta che stabilisce il destino delle cellule durante
lo sviluppo.
L'eventuale uso clinico di queste analisi dovrebbe tuttavia tenere
conto di una serie di cautele:
1. le persone non dovrebbero sottoporsi a questi test senza
conoscere a priori come utilizzare i risultati;
2. almeno un test ogni 20, tra quelli con una dichiarata
specificita' del 95%, fornisce un risultato falso positivo e quindi
il sequenziamento completo del genoma di una persona produce un
risultato che contiene non meno di 6000 errori;
3. all'interno dei dati ottenuti, alcuni non hanno un chiaro
significato clinico (i cosiddetti VUS - Variations of Unknown
Significance), il che limita ulteriormente il potere predittivo di
queste analisi;
4. il valore clinico di queste indagini dipende dalla
possibilita' di collegare specifiche varianti ad un miglioramento
dell'esito clinico
Sebbene le indagini sulla suscettibilita' appaiano al momento
premature per quasi tutte le malattie complesse, questo scenario
potrebbe cambiare nei prossimi anni. Ad oggi, comunque, le analisi
sull'ereditabilita' dei caratteri complessi restano essenzialmente
oggetto di studio e di ricerca.
Quanto sopra raccomanda interventi di formazione e di informazione
sulle potenzialita' ed i limiti della cosiddetta medicina predittiva
rivolta alle malattie complesse, basata sulle analisi genomiche,
nonche' di contrasto alla pubblicita' ingannevole, al fine di
limitare l'uso dei test rivolti direttamente ai consumatori che una
commercializzazione spesso spregiudicata reclamizza con il miraggio
di acquisire informazioni utili a cambiare il destino delle persone.
Uno studio, che ha intervistato un campione rappresentativo di
persone che si sono sottoposte alle analisi genome wide con finalita'
predittive, ha indicato che, dopo il test, il 34% ha cambiato la
dieta, il 14% ha aumentato l'attivita' fisica, il 43% si e' informato
sulla patologia per la quale era stato ipotizzato un aumento della
suscettibilita', il 28% ha condiviso i risultati con il medico di
famiglia, il 9% ha effettuato ulteriori approfondimenti di
laboratorio. Un risultato che complessivamente non giustifica i costi
di un test cosi' sofisticato!
Al momento stenta a decollare la promessa di Francis Collins
formulta in occasione della conferenza di presentazione della prima
bozza della mappa del genoma umano, il 26 giugno 2000: "La medicina
personalizzata sara' disponibile dall'anno 2010: avremo test in grado
di identificare il rischio individuale di sviluppare malattie comuni
e subito dopo disporremo di protocolli individualizzati di
prevenzione e terapia". Tuttavia il divario, tra quanto anticipato e
lo stato dell'arte, puo' costituire il volano per aiutare la ricerca
a completare il processo di integrazione delle analisi -omiche nella
pratica clinica.
Bibliografia
1. Monia Baker. Nature 2013; 494:416-419
2. ISCN 2013: An International System for Human Chromosome
Nomeclature, Karger, Basel
3. Lepri et al. BMC Med Genet. 2014; 23;15:14
4. Kaufman et al. J Genet Couns, 2012; 21:413-22
PARTE SECONDA
CAPITOLO 3
La genomica nella diagnosi.
3.a Malattie mendeliane: impatto clinico del sequenziamento di
seconda generazione
Dal sequenziamento Sanger al sequenziamento di seconda generazione.
Fino alla recente introduzione nella pratica clinica del
sequenziamento di seconda generazione, l'analisi molecolare
utilizzata per confermare la diagnosi clinica di una malattia
potenzialmente genica, era il sequenziamento del gene o di un gruppo
di geni d'interesse, utilizzando la tecnica sviluppata da Sanger.
Questa metodologia, basata sull'analisi di frammenti di DNA della
lunghezza di 200-500 basi, ottenuti per amplificazione in vitro con
la reazione a catena della polimerasi (PCR), costituisce ancora oggi
la strategia analitica elettiva per le malattie caratterizzate da
bassa eterogeneita' genetica, cioe' causate da mutazioni in un
ristretto numero di geni, o dovute alla mutazione di geni di piccole
dimensioni. Nonostante le recenti implementazioni che ne hanno
aumentato la processivita', un limite principale di questa tecnologia
risiede nella necessita' di analizzare singolarmente i frammenti
genomici d'interesse. Cio' diventa particolarmente problematico per
le malattie causate dalle mutazioni di geni di grosse dimensioni e/o
contenenti numerosi esoni, oppure per le malattie geneticamente
eterogenee, cioe' causate dalle mutazioni di geni diversi. Inoltre,
l'elevato costo di esecuzione non consente di applicare questa
tecnologia al sequenziamento su larga scala. Questi limiti sono stati
oggi superati dall'uso, sempre piu' esteso, anche in ambito clinico,
delle tecnologie di sequenziamento di seconda generazione. Grazie al
loro basso costo, queste tecnologie consentono di analizzare un
elevato numero di frammenti di DNA in parallelo e di sequenziare
contemporaneamente molti geni, l'intera porzione del genoma che
codifica per proteine (esoma), o addirittura l'intero genoma di una
persona in pochi giorni. Queste tecniche permettono anche, in linea
di principio, di identificare le varianti strutturali, ad esempio, le
duplicazioni e le delezioni delle regioni genomiche. Per queste
caratteristiche, il sequenziamento di seconda generazione e i diversi
approcci diagnostici basati su questa tecnologia, rappresentano uno
strumento diagnostico innovativo, di elevato interesse clinico, in
quanto consentendo di effettuare indagini in precedenza tecnicamente
impraticabili oppure economicamente onerose, nonche' di abbattere
sensibilmente i tempi e i costi della diagnosi molecolare.
Attualmente l'applicazione del sequenziamento di seconda
generazione in ambito clinico si basa su tre principali strategie
diagnostiche: il sequenziamento mirato di pannelli di geni-malattia
(targeted resequencing), il sequenziamento dell'esoma e il
sequenziamento dell'insieme dei geni noti per essere implicati nelle
malattie. Una quarta strategia consiste nel sequenziamento
dell'intero genoma, che consente, tra l'altro, una piu' estesa e
omogenea copertura rispetto all'esoma. Tuttavia le criticita'
relative all'analisi, compresa l'interpretazione di tutte le
variazioni identificate, l'archiviazione della massa dei dati
prodotti ed i costi ancora troppo elevati, ne limitano il suo impiego
in campo clinico-diagnostico. L'uso appropriato di queste strategie
di sequenziamento e l'ulteriore evoluzione tecnologica, consentira'
di ridurre i costi e i tempi della diagnosi e di ottenere la conferma
molecolare di un'ipotesi diagnostica formulata attraverso una
valutazione puramente clinica.
- Targeted resequencing. Il sequenziamento selettivo di un
pannello di geni-malattia scelti sulla base della loro associazione
con la malattia in esame costituisce la strategia d'eccellenza per la
diagnosi molecolare delle malattie causate dalle mutazioni in geni di
grandi dimensioni o di malattie geneticamente eterogenee. In
quest'ultimo caso, l'analisi e' indicata quando le mutazioni nei
genimalattia inseriti nel pannello spiegano una percentuale
significativa dei casi o quando si sospetti la presenza di un
mosaicismo. Considerato l'elevato beneficio in termini di costi,
sensibilita' e velocita' dell'analisi, questa strategia di
sequenziamento e' gia' ampiamente utilizzata nella pratica clinica,
ed e' destinata a diventare l'approccio di prima scelta nell'analisi
delle malattie geneticamente eterogenee (ad esempio le
cardiomiopatie, le distrofie muscolari, le malattie metaboliche, la
retinite pigmentosa, ecc.); delle malattie dovute a mutazioni di
famiglie di geni (condizioni nosologicamente distinte che condividono
una serie di segni clinici, ad esempio le RASopatie, le ciliopatie,
ecc.); dello screening di geni di grandi dimensioni (e.g., DMD, ATM,
FBN1, MLL2, NF1, ecc.).
Il sequenziamento di pannelli di geni consente anche di analizzare
contemporaneamente decine di campioni. Questa maggiore efficienza e'
essenzialmente legata alla elevata profondita' di lettura dei geni
sequenziati, nettamente superiore a quella mediamente ottenuta con il
sequenziamento dell'esoma. Tuttavia questo test non rileva le
varianti strutturali e, ovviamente, non puo' rilevare varianti che
interessano le regioni non codificanti dei geni esaminati. Lo
svantaggio del sequenziamento mirato di pannelli di geni-malattia e'
legato essenzialmente alla necessita' di un loro continuo
aggiornamento, man mano che nuovi geni vengono associati alla
malattia d'interesse e alla necessita', nel caso di esito negativo
dello screening, di analizzare i pazienti attraverso sequenziamento
dell'esoma.
- Sequenziamento dell'esoma. Il sequenziamento dell'esoma
rappresenta, in linea di principio, la migliore strategia per
arrivare alla diagnosi molecolare nel caso di una condizione per la
quale i dati disponibili suggeriscono una base genetica non associata
ad anomalie strutturali del genoma (ipotesi verificabile attraverso
l'uso di approcci complementari quali l'ibridazione genomica
comparativa e la genotipizzazione ad alta risoluzione), e quando il
quadro clinico non e' riconducibile ad una malattia nota, oppure sono
stati in precedenza esclusi i geni associati ad una malattia nota.
L'analisi dell'esoma puo' essere utilizzata anche come valida
alternativa al targeted resequencing nel caso in cui la malattia
presenti elevata eterogeneita' genetica.
Numerosi studi finalizzati a stimare l'efficienza diagnostica
dell'analisi dell'esoma convergono nell'indicare un tasso di successo
superiore al 25% per le condizioni prive di un inquadramento
diagnostico. Tale percentuale varia tuttavia in rapporto al tipo di
malattia, alla selezione clinica, alla strategia di sequenziamento
utilizzata. In particolare, il sequenziamento del nucleo familiare,
anche se maggiormente costoso, e' di solito piu' informativo.
Tuttavia, il sequenziamento dell'esoma non e' sempre in grado di
rilevare le varianti strutturali e, come anticipato, neppure le
varianti presenti nelle regioni non codificanti del genoma (il 98-99%
del genoma non viene analizzato).
L'uso del sequenziamento dell'esoma nella pratica clinica ha
confermato le grandi potenzialita', ma anche la difficolta' di
interpretazione dei dati ottenuti, particolarmente nel caso di
varianti in precedenza non annotate. La variabilita' genetica inter-
e intra-popolazione puo' rendere maggiormente difficile l'analisi di
filtraggio e priorizzazione delle varianti identificate e rende
necessaria la creazione di banche-dati popolazione-specifiche per una
piu' precisa valutazione della ricorrenza delle varianti rare.
Nonostante il sostanziale miglioramento delle metodologie di cattura
e/o arricchimento delle regioni genomiche codificanti, e la sempre
piu' dettagliata caratterizzazione della topologia funzionale del
genoma, ancora oggi non sono disponibili kit in grado di coprire
omogeneamente il 100% dell'esoma, incluse le regioni particolarmente
ricche in GC, come il primo esone codificante di numerosi geni.
- Esoma clinico. Il cosidetto "esoma clinico" si pone tra
l'analisi di pannelli di geni-malattia e l'analisi dell'intero esoma.
Si basa sul sequenziamento dell'intera porzione codificante di tutti
i geni noti per la loro rilevanza clinica, cioe' in precedenza
associati alle malattie. Questa strategia, a differenza del
sequenziamento dell'esoma, per definizione non consente di
identificare nuovi geni-malattia, ma e' utile nel caso in cui la
malattia presenti un'elevata eterogeneita' genetica e i singoli
geni-malattia siano mutati solo in una bassa percentuale dei casi;
oppure, nel caso di malattie che, per la loro rarita', non sono state
sufficientemente caratterizzate dal punto di vista clinico.
Analogamente all'analisi dell'esoma, l'esoma clinico permette in
linea di principio di identificare la coesistenza in un paziente di
mutazioni responsabili di malattie genetiche distinte. Questa
situazione non deve essere sottovalutata, in quanto questo tipo di
associazione e' stato documentato nel 5% dei casi in coorti non
selezionate di pazienti analizzati utilizzando il sequenziamento
dell'esoma per finalita' diagnostiche.
La mole di dati acquisita con il sequenziamento dell'esoma puo'
eventualmente essere analizzata considerando esclusivamente
sottogruppi di geni di interesse. Questo approccio, noto come
targeted data analysis, consente di focalizzare l'analisi sui dati
genomici riguardanti pannelli selezionati "in silico" di
geni-malattia precedentemente implicati nella patologia in esame.
Questo approccio rende il sequenziamento dell'esoma particolarmente
vantaggioso, in quanto consente di acquisire il piu' elevato livello
di informazione in un singolo esame di laboratorio, e permette di
analizzare successivamente i dati prodotti, tenendo conto delle
conoscenze acquisite negli anni, o di formulare una diversa ipotesi
diagnostica dopo la rivalutazione clinica del paziente.
Impatto clinico delle tecnologie di sequenziamento di seconda
generazione
Le tecnologie di sequenziamento di seconda generazione trovano
applicazione in diversi ambiti della medicina. Accanto alla diagnosi
di malattie mendeliane, il loro uso trova impiego crescente in campo
oncologico, nella caratterizzazione molecolare dei tumori,
nell'identificazione di potenziali bersagli molecolari di terapia o
di varianti di predisposizione all'insorgenza di tumori. Un'altra
importante applicazione riguarda lo screening prenatale non invasivo
sul sangue materno (Non Invasive Prenatal Testing - NIPT). Nonostante
le difficolta' interpretative dovute all'alta densita' dei dati
prodotti, le informazioni generate dall'applicazione delle tecnologie
di sequenziamento di seconda generazione, in particolare dall'analisi
dell'esoma, offrono importanti opportunita' per diagnosi piu' rapide
e corrette, con enormi ricadute a livello clinico, consentendo una
piu' rapida ed efficace presa in carico del paziente affetto da
malattia genetica.
Anche se il tasso di errore del sequenziamento di seconda
generazione e' basso, esso non e' trascurabile ed e' strettamente
dipendente dal tipo di variazione (singolo cambiamento nucleotidico
vs inserzione/delezione di piu' basi) e dal suo contesto di sequenza.
Di conseguenza, e' sempre necessario validare le varianti
identificate con il sequenziamento Sanger, che rappresenta ancora
oggi il metodo di sequenziamento di riferimento, e, con la stessa
metodica, verificarne la co-segregazione con la malattia nel nucleo
familiare.
Un aspetto non marginale riguarda la gestione dei cosiddetti
"risultati inattesi" (incidental findings), cioe' l'identificazione
di varianti di potenziale significato patogenetico all'interno di
geni-malattia, ma non correlati con il quadro clinico che ha
determinato l'indicazione all'accertamento molecolare. Alcuni di
questi risultati potrebbero essere clinicamente rilevanti, come ad
esempio le varianti d'interesse farmacogenetico, di predisposizione
alle neoplasie o relativi alle malattie per le quali sono disponibili
approcci terapeutici o di prevenzione. Questo problema e'
particolarmente rilevante stante l'elevato potere risolutivo
dell'analisi esomica, ma anche per l'attuale scarsa conoscenza del
significato funzionale e della rilevanza clinica della maggior parte
delle varianti genetiche. Le conseguenti implicazioni sanitarie ed
etiche devono essere gestite nel corso della consulenza genetica.
Obiettivi e Raccomandazioni
Da quanto esposto emergono le seguenti priorita', rispetto alle
quali sono identificabili i relativi interventi (Tabella 1):
- Programmazione dell'Implementazione delle tecniche di
sequenziamento di seconda generazione. E' necessaria un'accorta
programmazione, che parta dal censimento delle piattaforme gia'
implementate e delle competenze gia' disponibili. Tale indagine e' di
interesse nazionale e puo' essere condotta utilizzando il
questionario prodotto, ai sensi dell'Intesa 13/3/13 con il relativo
progetto CCM (Definizione e promozione di programmi per il sostegno
all'attuazione del Piano d'Intesa del13/3/13 recante Linee di
indirizzo su "La Genomica in Sanita' Pubblica). Il successivo piano
di potenziamento, anche in relazione ai costi connessi, dovra' essere
oggetto di uno specifico accordo Stato - Regioni.
- Produrre, a partire dai documenti delle societa' scientifiche
gia' disponibili e dalle indicazioni internazionali, linee-guida per
l'utilizzo del sequenziamento. L'implementazione di una capacita' di
sequenziamento evidentemente postula anche un suo appropriato
utilizzo. Il Sistema Nazionale Linee Guida (SNLG) elabora
raccomandazioni di comportamento clinico basate sugli studi
scientifici piu' aggiornati, secondo il proprio metodo; e'
riconducibile a tale processo anche la collaborazione con societa'
scientifiche ed esperti di settore. In tale framework di livello
nazionale potra' essere prodotta una linea-guida per l'uso
appropriato del sequenziamento; la successiva fase di implementazione
e' riconducibile alle responsabilita' e metodi della programmazione e
management dei servizi sanitari regionali e richiede un processo
esplicito di recepimento e applicazione.
Raccomandazioni.
In accordo con le linee guida che la Societa' Italiana di Genetica
Umana (SIGU) ha prodotto per dare elementi di indirizzo circa
l'utilizzo dei test di sequenziamento di nuova generazione
nell'ambito della Genetica Medica, si forniscono le seguenti
raccomandazioni:
- La caratterizzazione fenotipica e' fondamentale per la scelta
della tecnica di diagnosi molecolare (sequenziamento Sanger, Targeted
resequencing, WES) e per la successiva analisi delle varianti
identificate.
- Nel caso di fenotipi specifici, caratterizzati da bassa
eterogeneita' genetica e coinvolgenti geni di piccole dimensioni,
puo' essere opportuno ricorrere ad analisi con metodiche molecolari
convenzionali (ad esempio: sequenziamento Sanger, PCR mirata per
mutazioni dinamiche). Anche la lunghezza del gene puo' influenzare la
scelta della tecnica analitica da utilizzare. In generale, e'
auspicabile che l'analisi molecolare di geni molto grandi (numerosi
esoni; per esempio NF1, CFTR, etc.) sia trasferita su piattaforme NGS
per l'abbattimento dei costi e dei tempi di refertazione.
- Nel caso di condizioni con elevata eterogeneita' genetica nelle
quali mutazioni in un numero ridotto di geni sono responsabili della
maggioranza dei casi e' auspicabile l'uso di un targeted resequencing
(pannelli di geni noti). Tale strategia e' indicata anche in caso di
sospetto mosaicismo.
- Nel caso di condizioni con eterogeneita' genetica
particolarmente marcata dove e' coinvolto un numero sempre crescente
di geni, ognuno dei quali e' responsabile di una bassa percentuale di
casi (per esempio paraparesi spastiche ereditarie, retiniti
pigmentose, etc.) e' indicata l'esecuzione di un WES con un filtro
limitato all'analisi di un pannello di geni noti (pannello "in
silico"). In caso di negativita' dell'analisi di un pannello di geni,
i dati esomici restano quindi a disposizione per le eventuali
indagini successive indirizzate alla ricerca di nuovi geni candidati
o per l'analisi di geni causativi identificati in un secondo tempo.
- Infine in tutti i casi in cui non puo' essere formulata
un'ipotesi diagnostica su base clinica e' preferibile l'analisi
dell'intero esoma per l'individuazione del difetto genetico
responsabile, che puo' riguardare mutazioni/geni gia' noti (ambito
diagnostico) o nuovi geni candidati (ambito di ricerca) che
necessitano di ulteriori conferme. E' auspicabile che tali indagini
siano eseguite in centri con comprovata esperienza nell'ambito
dell'analisi di dati esomici per garantire la piu' alta probabilita'
di successo, che al momento, secondo la letteratura medica, si
attesta attorno al 25%.
- E' utile confermare sempre la mutazione identificata tramite
metodica NGS con sequenziamento Sanger e stabilirne la segregazione
nella famiglia quando possibile.
Tabella 1. Interventi identificabili
Parte di provvedimento in formato grafico
3.b Genomica nella diagnosi delle Malattie Complesse e
Multifattoriali
Lo studio della variabilita' interindividuale e' definito
dall'analisi della distribuzione e della frequenza dei geni nelle
popolazioni. Lo sviluppo di questi studi ha fornito risposte a
numerosi quesiti circa l'origine della nostra specie, le grandi
migrazioni che hanno caratterizzato l'evoluzione dell'uomo moderno,
il ruolo della selezione naturale nel mantenere le frequenze geniche
nelle popolazioni e, sul piano applicativo, la comprensione di parte
delle basi biologiche di molte malattie complesse e multifattoriali.
La variabilita' genica della nostra specie e' talmente elevata da
definire mappe geografiche basate sulla frequenza di particolari
alleli, ed e' misurata attraverso il polimorfismo, cioe' la
percentuale di loci per i quali e' presente piu' di un allele, e
l'eterozigosita', cioe' la percentuale di individui in una
popolazione che porta alleli diversi nello stesso gene. Il valore
medio di polimorfismo nei mammiferi e' circa 15%, mentre
l'eterozigosita' e' circa 4% se riferita alle proteine, ma e' molto
piu' elevata (>90%), se l'analisi e' basata sul DNA. L'esistenza di
questa straordinaria variabilita' ha permesso di dimostrare che nella
popolazione umana non esistono le razze. I polimorfismi sono
indicatori della variabilita' e percio' sono dei marcatori genetici.
Le categorie piu' importanti di questi marcatori sono i gruppi
sanguigni, le proteine del siero o dei globuli rossi, gli antigeni
linfocitari, i polimorfismi del DNA. La disponibilita' di questi
sistemi consente di ottenere informazioni sull'evoluzione delle
frequenze geniche, che cambiano nel tempo in rapporto all'effetto
delle mutazioni, della migrazioni, della selezione naturale e della
deriva genetica casuale.
La mutazione e' un elemento chiave dell'evoluzione e la sua assenza
determinerebbe l'arresto evolutivo di una specie. A meno che la quota
di radiazioni a cui siamo esposti non aumenti considerevolmente o che
un nuovo potente mutageno sia introdotto nella nostra dieta, e'
probabile che il tasso di mutazione per qualsiasi gene rimanga
abbastanza costante (tasso di mutazione medio: 10-5 - 10-9). Oggi si
stima che il tasso reale di mutazioni nell'uomo, stimato mediante il
sequenziamento completo dei genitori e dei figli, sia di circa 75
nuove mutazioni per generazione. Analogamente, la deriva genetica non
ha conseguenze in popolazioni estese, ma puo' invece, avere un
effetto notevole sulle frequenze geniche, nelle piccole popolazioni.
Nel secolo scorso, di pari passo con la scoperta della struttura e
della funzione del DNA, si e' affermato il concetto che lo stato di
salute e di malattia sono il risultato dell'interazione tra le
caratteristiche genetiche e l'ambiente. Le tecniche di sequenziamento
di seconda generazione stanno contribuendo a decodificare
l'ereditabilita' delle malattie complesse, anche se dopo una decina
di anni di ricerche hanno definito mediamente, fatte salve alcune
eccezioni, meno del 15% della loro componente genetica. Una possibile
spiegazione di questa "ereditabilita' mancante" e' da attribuire
certamente a valutazioni sovrastimate dell'ereditabilita' calcolata
su base empirica in quanto gli effetti ambientali intra-familiari non
sono stati inclusi nel modello di calcolo o perche' essi non potevano
essere stimati. Inoltre, la variabilita' della frequenza di molti
polimorfismi nelle popolazioni hanno contribuito a "diluire" il peso
dei singoli marcatori nel calcolo delle loro associazioni e, di
conseguenza, la loro utilizzazione clinica. E' stato chiarito da uno
studio effettuato sulla popolazione Islandese che una parte
sostanziale dell'ereditabilita' mancante e' dovuta a variazioni
polimorfiche rare, che non sono incluse nei pannelli di
genotipizzazione utilizzati.
Per queste ed analoghe considerazioni e' necessario utilizzare con
cautela i polimorfismi genetici associati alle malattie complesse,
valutare con attenzione la sensibilita' e la specificita' dei test
genetici e percio' l'accuratezza di predizione del rischio
utilizzando curve ROC (Receiver-Operating Characteristic) e definendo
le conseguenti aree AUC (Area Under the Curve), che costituiscono la
misura del potere discriminante del test. E' pero' importante
osservare che anche la predizione AUC puo' avere una scarsa utilita'
clinica se la malattia e' rara nella popolazione. Ad esempio,
l'allele HLAB27 e' fortemente associato al rischio di spondilite
anchilosante, una rara forma di artrite cronica che colpisce
mediamente 1-5% della popolazione. Nonostante il potere predittivo
del biomarcatore in termini di specificita' e sensibilita' (99%), con
una OR di circa 70, il rischio di sviluppare la malattia dopo un test
HLAB27 positivo, e' molto basso. Pur con queste limitazioni, non va
ignorato che questo limitato potere predittivo e' spesso assimilabile
a quello con il quale oggi si calcola un rischio utilizzando nella
clinica test non-genetici.
Sebbene le analisi della suscettibilita' alla maggior parte dei
fenotipi complessi appaiano al momento poco utilizzabili ai fini
clinici, molti polimorfismi associati a malattie complesse, trovano
interesse come biomarcatori genomici per definire la patogenesi delle
malattie complesse (ad esempio malattie infiammatorie intestinali) e
quali indicatori della risposta terapeutica. Ad esempio, l'allele C
del polimorfismo rs8192675 del gene SLC2A2, che codifica per un
trasportatore del glucosio, presenta una correlazione positiva con
l'efficacia della metformina nel ridurre i livelli di emoglobina
glicosilata, influenzando direttamente l'espressione del gene SLC2A
nel fegato. Per questo viene considerato un potenziale marcatore di
medicina personalizzata. Questo esempio illustra come, nel breve
periodo, le analisi genome wide (GWA), integrate con quelle di
espressione genica estesa (Genome-Wide Expression - GWE) e di
epigenomica (Epigenome-Wide Association Studies, EWAS) potrebbero
diventare uno strumento privilegiato per l'identificazione di una
serie di biomarcatori genomici fondamentali per la medicina
personalizzata o di precisione. Questi approcci integrativi e
convergenti consentono infatti di definire network biologici di geni
e proteine, che, attraverso l'analisi bioinformatica di banche-dati
disponibili, potrebbero modificare lo scenario diagnostico e
terapeutico delle patologie multifattoriali.
Obiettivi e Raccomandazioni
Da quanto esposto emergono le seguenti priorita', rispetto alle
quali sono identificabili i relativi interventi (Tabella 2):
- Garantire l'uso appropriato dei polimorfismi nella pratica
clinica. Poiche' bisogna utilizzare con cautela i polimorfismi
genetici associati a malattie complesse, e considerando, d'altra
parte, il grande potenziale di nuove conoscenze che caratterizza la
ricerca in questo campo, e' necessario che l'uso clinico delle
analisi genomiche applicato alle malattie complesse sia sostenuto da
chiare indicazioni basate sull'evidenza. E' quindi necessario
prevedere sia un'accurata valutazione del loro uso nella clinica, sia
un loro continuo aggiornamento in base alle evidenze scientifiche
prodotte; cio' e' conseguibile mediante la produzione di linee-guida
con una funzione di quick-review periodica della letteratura sia
primaria che secondaria; tale funzione dovrebbe essere assicurata dal
network HTA previsto nel Cap. 6.
Tabella 2. Interventi identificabili
Parte di provvedimento in formato grafico
3.c Tumori
3.c.i Mutazioni germinali
I tumori ereditari rappresentano solo una piccola frazione di tutti
i tumori (1-10%). La ricerca di mutazioni germinali e' funzionale
all'identificazione di un aumentato rischio familiare, e' un percorso
da sviluppare correttamente tramite la Consulenza Genetica Oncologica
(CGO) ed e' strettamente focalizzato alla prevenzione e all'analisi
precoce della malattia. La sua applicabilita' e' quindi
nell'individuazione preventiva di pazienti sani con un aumentato
rischio per patologie oncologiche quali ad esempio il carcinoma della
mammella e dell'ovaio, il carcinoma del colon, la sindrome di Lynch.
Il numero di geni responsabili di forme di predisposizione
ereditaria al cancro e' in continua crescita e attualmente se ne
conoscono quasi un centinaio, implicati in una cinquantina di diverse
sindromi, ciascuna delle quali presenta le sue specificita', legate
alla sede e tipologia dei tumori.
Nella maggior parte dei pazienti la predisposizione viene ereditata
con modalita' autosomica dominante con penetranza incompleta e
interessa un gene oncosoppressore. In questi casi la cancerogenesi
segue il modello two-hits, per cui la prima mutazione e' ereditata
mentre la seconda, somatica, disattiva l'altro allele. Viceversa
nelle forme tumorali sporadiche entrambe le mutazioni devono avvenire
a livello somatico. Noto anche come "ipotesi di Knudson", questo
modello e' stato formulato la prima volta piu' di 40 anni fa per
spiegare l'origine del Retinoblastoma, un raro tumore infantile della
retina, ma viene oggi esteso a moltissime altre forme tumorali
ereditarie (ad esempio geni APC, PTEN, p53, VHL, NF1, NF2).
Anche alcuni geni della riparazione del DNA trasmettono la
predisposizione con analogo meccanismo autosomico dominante, in
accordo con il suddetto modello (ad esempio geni Mismatch Repair-MMR,
BRCA1, BRCA2). Meno frequentemente l'ereditarieta' imputabile ad essi
e' autosomica recessiva (ad esempio gene MUTYH del sistema Base
Excision Repair-BER).
Numerose sono inoltre le sindromi da instabilita' genetica, spesso
associate allo sviluppo di tumori, con ereditarieta' di tipo
autosomico recessivo legate a mutazioni in geni appartenenti a
diversi sistemi di riparazione e/o di controllo dell'integrita' del
DNA (ad esempio geni FANC, BLM,ATM, geni XP del sistema Nucleotide
Excision Repair-NER). Le rare forme di predisposizione dovute a
oncogeni sono invece sempre dominanti (ad esempio geni RET, KIT,
MET).
Nella Tabella 3 sono riportati alcuni esempi relativi ad alcune tra
le sindromi di predisposizione al cancro piu' note, le principali
manifestazioni cliniche (tumorali e non), le modalita' di
trasmissione (AD, autosomico dominante; AR, autosomico recessivo) e i
geni coinvolti.
Tabella 3. Esempi relativi ad alcune sindromi di predisposizione al
cancro
Parte di provvedimento in formato grafico
Nel caso specifico di ricerca di una mutazione in pazienti gia'
affetti da patologia oncologica il test per le mutazioni germinali
oggi e' uno strumento utile per stimare il rischio di secondi tumori
e per screenare i consanguinei al fine di attuare strategie
preventive. Inoltre il test genetico puo' oggi consentire una terapia
personalizzata, come ad esempio nel caso dei nuovi farmaci quali i
PARP inibitori che hanno mostrato efficacia nelle pazienti con
carcinoma ovarico BRCA mutato.
3.c.ii Mutazioni somatiche
La maggior parte dei tumori sono sporadici e contraddistinti
esclusivamente da mutazioni acquisite nel corso della vita, a carico
di oncogeni, oncosoppressori e geni della riparazione del DNA.
Gli oncogeni sono geni cellulari dotati di proprieta' oncogene
trasformanti; si tratta spesso di sequenze di DNA omologhe, cioe'
molto simili, a sequenze "v-onc " presenti in alcuni Retrovirus,
ossia in virus a RNA capaci di causare tumori in animali. Gli
oncogeni vengono classificati in base a localizzazione cellulare e
funzione del loro prodotto proteico in:
- fattori di crescita
- recettori per fattori di crescita
- trasduttori intracellulari
- fattori di trascrizione nucleare e inibitori dell'apoptosi
(morte cellulare).
I geni oncosoppressori hanno la funzione di "sopprimere" una
proliferazione cellulare inappropriata o, piu' in generale, la
trasformazione neoplastica. Hanno quindi funzioni opposte a quelle
degli oncogeni. In condizioni normali, i processi di proliferazione,
differenziamento e morte cellulare sono il risultato di un delicato
equilibrio che deriva dall'azione bilanciata di entrambe le categorie
di geni, oncogeni e oncosoppressori. La mutazione di una singola
copia dell'oncosoppressore consente ancora il funzionamento del gene
a livelli sufficienti e quindi non e' associato allo sviluppo del
tumore, mentre il danneggiamento o la perdita di entrambe le copie
determina invece la "loss of function", ossia l'inattivazione
completa della sua funzione che induce percio' la comparsa del
tumore.
I geni della riparazione del DNA sono in grado di determinare,
quando alterati, un aumento del tasso di mutazione e/o
un'instabilita' genetica che facilita l'acquisizione progressiva di
mutazioni in oncogeni e oncosoppressori che portano allo sviluppo di
un tumore. A differenza dei geni precedenti, essi hanno quindi un
ruolo indiretto nella genesi del cancro: la mutazione di un gene
mutatore determina infatti una perdita della sua funzione riparativa
e quindi del meccanismo di controllo sulla stabilita' del materiale
genetico che e' essenziale per uno sviluppo normale delle cellule.
L'identificazione nei tumori di alcune anomalie genetiche,
soprattutto quelle a carico degli oncogeni, e' importante in termini
di diagnosi, prognosi e terapia. Ad esempio la traslocazione 9;22 che
attiva l'oncogene abl e che comporta la formazione di un cromosoma 22
anomalo (detto cromosoma Philadelphia) e' specifica della leucemia
mieloide cronica ed e' fondamentale per fare correttamente questa
diagnosi. Inoltre, il monitoraggio del midollo osseo mediante
citogenetica o analisi molecolare puo' documentare il raggiungimento
e la persistenza della guarigione o, alternativamente, puo'
diagnosticare precocemente la ripresa della malattia.
L'amplificazione di alcuni oncogeni, quali ad esempio N-MYC (nel
neuroblastoma) e HER-2 (nel carcinoma della mammella e dello
stomaco), e' riscontrata spesso in fasi avanzate di malattia ed ha
significato prognostico negativo. Infine, molti sforzi vengono oggi
rivolti alla target therapy per lo sviluppo di farmaci mirati che
agiscono in maniera specifica sulle proteine alterate o iperespresse
prodotte da un oncogene attivato, quali ad esempio Imatinib
(inibitore di abl) nella leucemia mieloide cronica e Trastuzumab e
Pertuzumab (anticorpi anti-HER2) nel carcinoma mammario, Cetuximab e
Panitumumab nel carcinoma del colon RAS wild type, Gefitinib e altri
TKI nell'adenocarcinoma del polmone con mutazione di EGFR.
Obiettivi e Raccomandazioni
Da quanto esposto emergono le seguenti priorita', rispetto alle
quali sono identificabili i relativi interventi (Tabella 4):
- Test per le mutazioni germinali. La ricerca di mutazioni
germinali e' funzionale all'identificazione di un aumentato rischio
familiare, e' un percorso da sviluppare correttamente tramite la
Consulenza Genetica Oncologica ed e' strettamente focalizzato alla
prevenzione e all'analisi precoce della malattia. Quindi, la
somministrazione di test per le mutazioni germinali oggi e' uno
strumento utile per stimare il rischio di secondi tumori e per
screenare i consanguinei al fine di attuare strategie preventive. A
questo riguardo v.4.3.i. Inoltre il test genetico puo' oggi
consentire una terapia personalizzata, come ad esempio nel caso dei
nuovi farmaci quali i PARP inibitori che hanno mostrato efficacia
nelle pazienti con carcinoma ovarico BRCA mutato. A questo riguardo v
5.b.
- Test per le mutazioni somatiche. L'identificazione nei tumori
di alcune anomalie genetiche, soprattutto quelle a carico degli
oncogeni, e' importante in termini di diagnosi, prognosi e terapia.
Poiche' bisogna utilizzare appropriatamente tali test, e
considerando, d'altra parte, il grande potenziale di nuove conoscenze
che caratterizza la ricerca in questo campo, e' necessario che l'uso
clinico di tali test sia sostenuto da chiare indicazioni
evidence-based. E' quindi necessario prevedere sia un'accurata
valutazione di utilizzabilita' clinica sia un suo tempestivo
aggiornamento in base alle evidenze scientifiche prodotte. Il SNLG
elabora raccomandazioni di comportamento clinico basate sugli studi
scientifici piu' aggiornati, secondo il proprio metodo; e'
riconducibile a tale processo anche la collaborazione con societa'
scientifiche ed esperti di settore. In tale framework di livello
nazionale potra' essere prodotta una linea-guida per l'uso
appropriato dei test per le mutazioni somatiche nonche' una
quick-review periodica della letteratura sia primaria che secondaria;
tale funzione dovrebbe essere assicurata dal network HTA previsto nel
Cap. 6.
Tabella 4. Interventi identificabili
Parte di provvedimento in formato grafico
Bibliografia.
1. Societa' Italiana di Genetica Umana (SIGU). Il sequenziamento
del DNA di nuova generazione: indicazioni per l'impiego clinico.
Disponibile su: http://www.sigu.net/show/documenti/5/1/linee%20guida
2. Yang Y et al. Clinical whole-exome sequencing for the diagnosis
of mendelian disorders. N Engl J Med. 2013 Oct 17;369(16):1502-11.
3. Lee H et al. Clinical exome sequencing for genetic
identification of rare Mendelian disorders. JAMA. 2014 Nov
12;312(18):1880-7.
4. Yang Y et al. Molecular findings among patients referred for
clinical whole-exome sequencing. JAMA. 2014 Nov 12;312(18):1870-9.
5. Zaitlen N et al. Using extended genealogy to estimate components
of heritability for 23 quantitative and dichotomous traits. PLoS
Genet. 2013 May;9(5):e1003520
6. Zhou K et al. Variation in the glucose transporter gene SLC2A2
is associated with glycemic response to metformin. Nat Genet. 2016
Sep;48(9):1055-9.
CAPITOLO 4
La prevenzione personalizzata.
4.a. Test preconcezionali
La prevenzione delle malattie mendeliane da tempo utilizza lo
screening dei "portatori sani" per intercettare le coppie a rischio
di malattie recessive comuni o per le quali esiste nella famiglia uno
specifico rischio (cosiddetto screening a cascata). Un esempio
illustrativo e' la prevenzione della beta talassemia omozigote, la
cui incidenza e' stata drasticamente abbattuta in varie aree del
mondo, combinando lo screening degli eterozigoti con la consulenza
genetica e la diagnosi prenatale. Negli ultimi anni si e' proposto di
allargare la ricerca dei portatori anche per altre malattie recessive
comuni, come la fibrosi cistica (FC), causata dalle mutazioni del
gene CFTR. L'offerta attiva dello screening a cascata tra i fratelli
e le sorelle di una persona affetta da una malattia recessiva appare
giustificato solo per le condizioni che hanno una frequenza non
inferiore a 1:10.000 nella popolazione, il che corrisponde ad una
frequenza di eterozigoti di almeno 1:50. Di regola tale screening non
e' giustificato per i consanguinei piu' remoti, se la frequenza della
malattia non e' elevata nella popolazione.
Negli Stati Uniti, l'American College of Obstetrics and Gynecology
(ACOG) e l'American College of Medical Genetics (ACMG) hanno
raccomandato di offrire questo screening alle coppie che intendono
affrontare una gravidanza. Il test, inoltre, viene offerto dalla
sanita' pubblica in Israele nell'ambito di un pannello di diagnosi
genetiche. Esistono comunque diverse altre esperienze di screening
genetico limitate a piccoli gruppi, per la ricerca degli eterozigoti
per la FC ed altre malattie genetiche. Gli obiettivi di queste
raccomandazioni sono il miglioramento della consapevolezza
procreativa e/o la riduzione dell'incidenza delle malattie sottoposte
allo screening.
Oggi e' in forte espansione l'offerta dei test genetici diretti ai
consumatori, favorita dalla disseminazione di informazioni attraverso
internet. In alcune aree geografiche il test del portatore della FC
e' relativamente diffuso, per l'adesione spontanea all'offerta che
proviene da laboratori pubblici e privati, anche se non viene
raccomandato dalle societa' scientifiche e neppure promosso dalle
autorita' sanitarie. Per quanto riguarda l'Italia, si stima che negli
ultimi 20 anni siano stati eseguiti nel Veneto oltre 130.000 test per
lo screening dei portatori della FC, una campagna a cui ha fatto
seguito una significativa diminuzione dell'incidenza della malattia.
Analogamente, negli Stati Uniti, dopo le raccomandazioni della
ACOG-ACMG a favore dello screening della mutazione piu' comune
(F508del), si e' registrata una significativa riduzione
dell'incidenza della malattia. Ovviamente si tratta di un approccio
mirato all'analisi di specifici geni-malattia, che non incide sulla
frequenza delle altre malattie recessive.
L'introduzione delle tecnologie NGS consente, in teoria, di
verificare, nelle coppie che vogliono avviare una gravidanza, la
condizione di portatore per una specifica malattia mendeliana, oppure
escludere la presenza di mutazioni in geni responsabili di malattie
dominanti a penetranza incompleta o espressivita' variabile, non
diagnosticate clinicamente.
Il primo scenario e' esemplificato dall'analisi delle mutazioni del
gene CFTR, (www.genet.sickkids.on.ca). Molte variazioni nella
sequenza di questo gene non hanno significato patogenetico; per altre
non e' chiaro il rapporto con la malattia. Nessun metodo commerciale
permette oggi di identificare tutte le mutazioni del gene malattia la
cui frequenza varia significativamente a livello geografico.. Questo
problema sta diventando rilevante in alcune regioni italiane per la
costante crescita della multietnicita'. Sono invece disponibili test
commerciali di primo livello per la ricerca delle mutazioni piu'
frequenti di CFTR che garantiscono in Italia una detection rate del
70-90%. Alcuni laboratori utilizzano metodi sviluppati in casa, in
grado di ridurre i costi. Un risultato negativo di questi test non
esclude la presenza di mutazioni non ricercate. Il rischio residuo
puo' essere quantificato in base alla frequenza delle mutazioni nella
popolazione in esame e alla detection rate del test. Questo limite ha
rappresentato finora una delle principali obiezioni alla
raccomandazione dello screening del portatore nella popolazione
generale, data la particolare difficolta' di spiegare adeguatamente
il significato di un test negativo.
Le tecniche NGS hanno migliorato la sensibilita' e gia' oggi hanno
costi minori e potrebbero in futuro essere utili per lo screening di
popolazione per diverse malattie a maggiore incidenza. La loro
evoluzione tecnologica e' rapida, ma il loro limite sta nella loro
capacita' di evidenziare variazioni di sequenza al momento di
significato clinico non noto. Cio' comporta da un lato il ricorso ad
un grande numero di consulenze genetiche complesse, e dall'altro lato
il rischio di una mancata comprensione da parte dei probandi e/o dei
medici curanti dei risultati del test, un aumento del numero dei test
nei partner, l'esecuzione di indagini prenatali non interpretabili e
l'ansia dei futuri genitori che si troverebbero a prendere decisioni
riproduttive in assenza di informazioni certe o affidabili. A tutto
cio' si deve aggiungere che persino nel caso delle mutazioni delle
quali e' nota l'associazione con la malattia non e' sempre possibile
predire, a livello individuale, la gravita' del quadro clinico, in
quanto l'effetto modulante di altri geni e dell'ambiente puo' dare
origine a fenotipi variabili.
Per altre malattie recessive ad elevata frequenza sono disponibili
evidenze che giustificherebbero l'introduzione delle tecniche NGS
nella pratica clinica, come dimostra il caso dell'atrofia muscolare
spinale o della distrofia muscolare di Duchenne/Becker. Le tecnologie
NGS hanno maggiore sensibilita' rispetto alle tecniche tradizionali e
abbattono i tempi ed i costi dei test di screening dei portatori di
mutazioni associate a malattie mendeliane eterogenee, come la
sindrome di Alport.
Gli altri scenari, ovvero la ricerca simultanea di mutazioni in
diversi geni responsabili di malattie recessive, oppure la ricerca di
mutazioni ipomorfe in malattie dominanti, non trovano ancora
sufficiente supporto dai dati della letteratura. Se e' vero che le
tecniche NGS consentono in linea teorica di intercettare i portatori
sani per le malattie recessive di cui sono note le basi molecolari,
di fatto l'estensione dello screening preconcezionale alla maggior
parte dei geni delle malattie gravi e' considerato finora
impraticabile, anche se esistono prove di concetto che indicano, in
prospettiva, la possibilita' di introdurlo nella pratica sanitaria.
In conclusione i test che hanno come oggetto lo screening dei
portatori di mutazioni genetiche responsabili di malattie recessive
comuni, come la fibrosi cistica, sono altamente attendibili e sono
facilmente eseguibili con le tecniche tradizionali. Esistono quindi
le condizioni per la loro implementazione, una volta che sia
garantita la qualita' e la disponibilita' della consulenza genetica e
siano avviate campagne di informazione a livello di popolazione. La
prevedibile evoluzione delle tecnologie NGS ampliera' le possibilita'
di screening dei portatori di geni associati a molte malattie
genetiche. Tuttavia, l'eventuale implementazione di programmi di
screening di questo tipo dovra' essere testata su programmi pilota.
Obiettivi e Raccomandazioni
Da quanto esposto emergono le seguenti priorita', rispetto alle
quali sono identificabili i relativi interventi (Tabella 5):
- Programmazione dell'Implementazione delle piattaforme NGS (tale
priorita' e' gia' definita nel Cap. 3.a)
- Promuovere programmi evidence-based di screening dei portatori
di mutazioni genetiche responsabili di malattie recessive comuni. La
disponibilita' di sufficienti evidenze scientifiche mette il Sistema
Sanitario in condizione di inserire tale screening in modo
sistematico nell'ambito dei servizi offerti alla popolazione di
riferimento (come definita dalle Linee-guida: v. dopo). Si identifica
quindi un intervento di sanita' pubblica con le seguenti
caratteristiche: basato su valutazioni di efficacia sperimentale;
organizzato per profili di assistenza e quindi non soltanto delegato
alla competenza /sensibilita'/ iniziativa tecnico-professionale;
mirato all'equita' e quindi basato sul coinvolgimento attivo della
popolazione destinataria; dotato di un esplicito sistema informativo
e di valutazione.
Il processo di trasferimento delle nuove conoscenze scientifiche
nella pratica, impone la sua articolazione nelle seguenti fasi:
- Produzione di linee guida per screening dei portatori di
mutazioni genetiche responsabili di malattie recessive comuni. Il
Sistema nazionale linee guida (SNLG) elabora raccomandazioni di
comportamento clinico basate sugli studi scientifici piu' aggiornati,
secondo il proprio metodo; e' riconducibile a tale processo anche la
collaborazione con societa' scientifiche ed esperti di settore. In
tale framework di livello nazionale potra' essere prodotta una
linea-guida per l'uso appropriato dello screening.
- La successiva fase di implementazione e' riconducibile alle
responsabilita' e metodi della programmazione e management dei
servizi sanitari regionali e richiede un processo esplicito di
recepimento e applicazione.
- Organizzazione di un percorso. Assunto che la linea-guida
riguarda per definizione la dimensione tecnico-professionale, le
raccomandazioni derivate dalla LG devono portare alla implementazione
di un'organizzazione in grado di accogliere la popolazione target in
un percorso esplicito, basato su 'nodi organizzativi' chiaramente
definiti e procedure di 'ingaggio' precise ed esplicite. Si tratta
quindi di definire un percorso diagnostico- terapeuticoassistenziale
(PDTA: sequenza predefinita, articolata e coordinata di prestazioni,
ambulatoriali e/o di ricovero, che prevede la partecipazione
integrata di diversi specialisti e professionisti, al fine di
realizzare la diagnosi e la terapia piu' adeguate per una specifica
patologia. Questo contesto comprende l'identificazione nel territorio
regionale delle strutture/risorse responsabili dei vari step del
percorso) che prenda in carico gli individui destinatari dello
screening.
- Progetti pilota di screening dei portatori di geni associati a
(molte) malattie genetiche (con tecnologia NGS). La forza delle
evidenze scientifiche relative allo screening dei portatori di geni
associati a molte malattie genetiche e' ritenuta sufficiente per
proporre un intervento sulla popolazione target. Tuttavia le
modalita' organizzative e, complessivamente la sua fattibilita'
devono ancora essere definite e valutate; inoltre, le patologie
'bersaglio' di tale intervento devono essere accuratamente definite.
Per tali motivi e' richiesta la definizione di una linea-guida
(nell'ambito gia' sopra ricordato del SNLG) e relativamente a questa
e' opportuno, per la sua implementazione, organizzare progetti pilota
accuratamente disegnati e valutati.
- Campagne di informazione. Come espresso nel Capitolo 7, nella
attuale fase di sviluppo dell'uso delle scienze omiche, si tratta
prioritariamente di sviluppare una vera e propria literacy sia del
personale non specializzato del SSN sia della popolazione piuttosto
che programmare direttamente l'uso dei media di massa. Pertanto le
esigenze divulgative ed informative sull'uso appropriato dei test
preconcezionali di carattere genomico vanno perseguite con le
strategie e metodologie previste nel cap 7.
Tabella 5. Interventi identificabili
Parte di provvedimento in formato grafico
4.b Test Prenatali
Le tecniche di diagnosi prenatale comprendono indagini strumentali
e di laboratorio sviluppate negli ultimi 50 anni, con l'obiettivo di
monitorare il concepito, a partire dalle prime fasi dello sviluppo
embrionale fino ai momenti che precedono il parto.
L'ecografia prenatale e' la tecnica non invasiva di diagnosi
prenatale piu' importante e diffusa. Viene impiegata per
monitorizzare lo sviluppo dell'embrione e del feto, verificarne il
benessere, seguire l'evoluzione della gravidanza e come supporto alle
indagini invasive che prevedono l'acquisizione dei tessuti fetali. La
sua non invasivita' e l'elevato grado di risoluzione ottenuta con le
apparecchiature di ultima generazione ne giustificano la
straordinaria diffusione ed il suo impiego sistematico, nei paesi
industrializzati, pressoche' in tutte le gravidanze. Le sue
potenzialita' correlano con l'epoca gestazionale in cui viene
utilizzata, la risoluzione dell'apparecchiatura e l'esperienza
dell'operatore.
L'amniocentesi e' la tecnica invasiva di diagnosi prenatale
maggiormente utilizzata ed e' finalizzata all'acquisizione, mediante
puntura transaddominale, sotto controllo ecografico, del liquido
amniotico, idealmente attorno alla XV-XVI settimana di amenorrea. Il
rischio di aborto, collegato all'invasivita' della tecnica e'
calcolato in circa 1:200, ma varia in rapporto all'esperienza
dell'operatore. Il liquido amniotico contiene una parte non
corpuscolata, cioe' priva di cellule, che viene isolata, per
centrifugazione del campione, ed una parte corpuscolata, formata
dagli amniociti, le cellule che derivano dalla cute, dalle mucose,
dalle vie genito-urinarie, dall'apparato gastrointestinale del feto e
dalle membrane amniotiche. Sulla porzione non corpuscolata e'
possibile dosare l'alfafetoproteina (AFP) ed, eventualmente, altri
marcatori biochimici, mentre gli amniociti si utilizzano, in primo
luogo, per le analisi citogenetiche, ed eventualmente quelle
molecolari e biochimiche, sia direttamente che sulle cellule
coltivate.
La villocentesi e' una tecnica invasiva, utilizzata per il prelievo
del trofoblasto mediante puntura transaddominale, sotto controllo
ecografico, idealmente attorno alla X-XII settimana di amenorrea. Il
rischio di aborto, collegato all'invasivita' della tecnica, e' circa
2-3%, ma varia significativamente in rapporto all'esperienza
dell'operatore. Il tessuto acquisito puo' essere utilizzato per
l'analisi citogenetica, direttamente sulle cellule del
citotrofoblasto o sulle colture (cellule mesenchimali del villo).
L'uso combinato delle due tecniche fornisce informazioni su
popolazioni cellulari che hanno un'origine embrionale diversa,
consentendo, nella maggior parte dei casi, di risolvere il potenziale
problema delle discrepanze tra il cariotipo placentare ed il
cariotipo fetale (riscontrabile in circa il 2% dei campioni), che e'
riconducibile ad una condizione di mosaicismo postzigotico. La
villocentesi permette di acquisire materiale biologico in quantita'
relativamente abbondanti ed e' percio' la tecnica di elezione per la
diagnosi molecolare dei geni-malattia e per le analisi biochimiche.
La precocita' della tecnica, rispetto all'amniocentesi, e'
controbilanciata dalla sua maggiore invasivita' e dall'acquisizione
di tessuto placentare e non fetale.
La cordocentesi e' la tecnica di acquisizione del sangue fetale,
per puntura transaddominale, attorno alla XVIII settimana di
amenorrea. Il rischio di aborto, collegato all'invasivita' della
tecnica, e' circa 2%, ma varia significativamente in base
all'esperienza dell'operatore. La tecnica e' fortemente in disuso,
essendo utilizzata soprattutto per monitorizzare alcune patologie
infettive ed eventualmente per tentare di chiarire dubbi emersi
dall'analisi citogenetica sugli amniociti.
Gli screening prenatali non invasivi, sviluppati negli ultimi 40
anni, si basano essenzialmente sull'analisi di marcatori biochimici
sul sangue materno, combinati con le indagini ecografiche. Il
prototipo di queste analisi e' il dosaggio dell'AFP, inizialmente
utilizzato come marcatore dei difetti del tubo neurale (valore
aumentato) e, successivamente, della sindrome di Down (SD; valore
ridotto). Con il tempo questi screening, basati sull'associazione di
marcatori diversi, hanno ottenuto un crescente sviluppo nel calcolo
della probabilita' delle aneuploidie fetali, soprattutto nelle madri
che rientravano nella fascia di eta' a bassa probabilita' di
patologia cromosomica nel feto, e percio' non candidate al
monitoraggio invasivo della gravidanza. Il triplo-test (o tri-test)
basato sul dosaggio, nel secondo trimestre, dell'AFP, della
gonadotropina corionica e dell'estriolo non coniugato, combinato con
l'eta' materna e con l'eta' gestazionale misurata ecograficamente,
consentiva di predire circa il 65% delle SD, con una percentuale di
falsi positivi (FPR) compresa tra il 5 ed il 10%. A questo protocollo
ne sono stati affiancati nel tempo numerosi altri, basati su vari
marcatori, in diverse combinazioni, e sull'anticipazione dello
screening dal secondo al primo trimestre. Parallelamente, i marcatori
biochimici sono stati integrati con quelli ecografici, in particolare
l'analisi dello spessore della cute nucale (translucenza nucale -
TN), che, sebbene non patognomonico della SD, tra l'XI e la XIV
settimana di amenorrea, diagnostica circa il 75% dei casi, con una
FPR del 5%. Successivamente, si e' affermato il bi-test, che utilizza
il sangue materno acquisito attorno alla X-XI settimana, sul quale
viene dosata la frazione libera della beta gonadotropina corionica ed
una glicoproteina ad elevato peso molecolare, la Pregnancy Associated
Plasma Protein A (PAPP-A). Questa analisi, integrata con la
misurazione della TN e l'eta' materna, predice circa l'80% delle SD,
con una percentuale di falsi positivi pari a circa il 6%. In questo
contesto va considerato anche il test contingente (TN + marker
biochimici a 11-13 settimane; marker ecografici a 12-13 settimane o
biochimici a 14- 16 settimane nei gruppi a probabilita' intermedia),
che consente di migliorare la specificita' del test.
4.b.1 Diagnosi prenatale non invasiva sul DNA fetale presente nel
circolo materno: il Non Invasive Prenatal Testing (NIPT)
E' stato dimostrato che, a partire dal I trimestre di gravidanza,
e' presente nel circolo ematico materno DNA libero (cell free fetal
DNA, cfDNA), parte del quale e' di origine fetale (cell free fetal
DNA, cffDNA), che puo' essere recuperato in maniera non-invasiva ed
utilizzato per lo screening di alcune patologie fetali. Il cfDNA
origina dalla lisi delle cellule materne e placentari. I frammenti di
DNA fetale degradato contengono mediamente 180 paia di basi (bp) e
sono sospesi nel plasma arterioso. Il cffDNA puo' essere isolato a
partire dalla X settimana, quando raggiunge quantita' sufficienti per
un potenziale impiego clinico. La sua percentuale puo' variare tra
<4%, una quantita' non utile per lo screening, a circa il 40%, con
una media del 10%, alla XII settimana, quando il 90% circa dei
frammenti di DNA libero circolante nel plasma originano dall'apoptosi
degli epiteli materni, creando una commistione di cfDNA materno e
cffDNA. Il cffDNA scompare dal circolo materno poche ore dopo il
parto, probabilmente per escrezione renale.
Il cffDNA viene utilizzato nei protocolli di Non Invasive Prenatal
Testing (NIPT), soprattutto per lo screening delle aneuploidie
cromosomiche. Indipendentemente dalla tecnica utilizzata, l'analisi
si basa su comparazioni. Ad esempio, nel caso del cromosoma 21
(CR21), la tecnica confronta il numero dei frammenti del CR21 nella
gravidanza in esame, con il numero dei frammenti di un altro
cromosoma dello stesso campione atteso in una condizione di disomia,
oppure con quelli di un pool di gravidanze disomiche (due CR21) di
riferimento. Se il campione ottenuto dalla gravidanza in esame
contiene due coppie di CR21 (due della madre e due del feto), il
rapporto tra i conteggi (numero dei frammenti del CR21 nel
test/numero dei frammenti nei campioni di riferimento disomici) e'
all'incirca uguale a 1. Se nella gravidanza in esame e' presente un
feto con trisomia 21 (T21), aumenta la frazione fetale (FF) per la
presenza di frammenti circolanti aggiuntivi rilasciati dal CR21
soprannumerario del feto. L'entita' dell'aumento dipende dalla
percentuale della FF totale e dal numero delle bp del CR21, in
rapporto alle bp del genoma complessivo del feto.
In circa il 2% dei diversi campioni analizzati attorno alla XII
settimana la FF non supera la soglia del 4% e pertanto non sono
idonei per lo screening. E' possibile che in questi campioni la
percentuale delle patologie cromosomiche sia significativamente piu'
elevata, rispetto a quella dei campioni con FF =4%.
Il NIPT non differenzia il DNA feto-placentare da quello materno.
Pertanto non e' un test diagnostico, ma di screening, che, mediante
algoritmi dedicati, definisce la probabilita' che il feto sia affetto
da una delle principali trisomie autosomiche (trisomia 21 [T21],
trisomia 18 [T18], trisomia 13 [T13]) o da un'aneuploidia dei
cromosomi sessuali (X, XXX, XXY, XYY), analizzando selettivamente,
nel cffDNA, il numero dei frammenti contribuiti da ciascuno dei
cromosomi oggetto del test.
Una recente metanalisi ha riportato, per le tre principali
aneuploidie autosomiche, nelle gravidanze singole, le seguenti
percentuali di sensibilita' (detection rate - DR) e di specificita'
(FPR) del NIPT:
- T21 - DR 99,2% (95% CI, 98,5-99,6%); FPR 0,09% (95% CI,
0,05-0,14%)
- T18 - DR 96,3% (95% CI, 94,3-97,9%); FPR 0,13% (95% CI,
0,07-0,20%)
- T13 - DR 91,0% (95% CI, 85,0-95,6%); FPR 0,13% (95% CI,
0,05-0,26%).
Vari fattori spiegano queste discrepanze, in particolare i
mosaicismi feto-placentari, la presenza di un vanishing twin, le
malattie tumorali materne, i mosaicismi cromosomici materni,
l'assenza/insufficienza della FF.
L'analisi del cffDNA puo' essere effettuata anche sulle gravidanze
bigemine, limitatamente allo screening delle principali trisomie
autosomiche; il risultato esprime una probabilita' distribuita tra i
due feti. Il gemello piu' piccolo, che fornisce una quantita' minore
di DNA, produce una FF statisticamente inferiore alla media della FF
presente nelle gravidanze singole, suggerendo che il contributo al
cffDNA della FF da parte delle due placente sia disomogeneo e sia
addirittura possibile che una di esse non sia sufficientemente
rappresentata (FF <4%), con il rischio di una percentuale di falsi
negativi (FNR). I dati disponibili suggeriscono per la T21, una
sensibilita' del 95%; per la T18, dell'86%; per la T13, del 100% (i
dati numerici delle T13 e T18 sono comunque troppo limitati per
raggiungere un valore verosimile di sensibilita'), in assenza di FPR
per nessuna delle tre trisomie. In presenza di un risultato positivo,
il test non indica quale feto sia affetto.
La specificita' del NIPT nello screening delle aneuploidie dei
cromosomi sessuali e' inferiore rispetto a quella degli autosomi. Una
metanalisi ha indicato per la monosomia X una sensibilita' (DR) del
90,3% (95% CI, 85,7-94,2%) ed una specificita' (FPR) dello 0,23% (95%
CI, 0,14-0,34%). Per tutte le altre aneuploidie dei 39 cromosomi
sessuali, la sensibilita' e' risultata del 93,0% (95% CI, 85,8-97,8%)
e la specificita' dello 0,14% (95% CI, 0,06-0,24%).
Nella prospettiva di sviluppare tecniche in grado di analizzare
l'intero genoma, sono stati messi a punto pannelli che analizzano
singole microdelezioni associate ad alcune sindromi clinicamente
riconoscibili, ma questi test necessitano tutti di essere validati.
Analogamente, si stanno mettendo a punto test per lo screening
molecolare di malattie mendeliane. I primi screening hanno riguardato
la determinazione del sesso del feto, basata sulla ricerca nel plasma
materno di sequenze di SRY e DYS14 del cromosoma Y, una tecnica
attualmente utilizzata in alcuni Paesi per monitorizzare le
gravidanze a rischio per alcune malattie legate al cromosoma X. Altri
protocolli riguardano lo screening del fenotipo Rh del feto concepito
da madri RhDnegative, dell'acondroplasia originata de novo al
concepimento o segregata da un padre affetto, del nanismo tanatoforo,
della sindrome di Apert. Analogamente possono essere sottoposte a
screening le malattie autosomiche recessive, nelle quali i genitori
sono eterozigoti per mutazioni diverse. In questi casi, l'esclusione
o la presenza dell'allele paterno possono essere utilizzate per
precisare la probabilita' che il feto sia affetto, come nel caso
della talassemia o della fibrosi cistica. La maggior parte di questi
protocolli sono ancora sperimentali.
Le linee-guida del Ministero della Salute hanno formulato una serie
di raccomandazioni:
- Il cfDNA/NIPT e' il test di screening prenatale dotato al
momento di maggiore sensibilita' e specificita' per lo screening
della trisomia 21.
- Il cfDNA/NIPT riduce il ricorso alle indagini diagnostiche
invasive, che hanno costi piu' elevati, e, di conseguenza, riduce il
rischio di aborto collegato a quelle tecniche.
- Il cfDNA/NIPT non fornisce un risultato in circa il 2% dei
casi, per l'inadeguatezza del campione correlata alla bassa
concentrazione del cfDNA nel plasma materno; al momento non sono
disponibili studi in grado di chiarire se questi fallimenti si
associno alla presenza, nel feto, di altre anomalie cromosomiche al
di fuori delle trisomie 13 e 18.
L'utilizzo del cfDNA/NIPT come screening contingente dopo il Test
Combinato (eseguito da operatori certificati) appare il modello
migliore per la sua implementazione a livello nazionale, in quanto
avrebbe un limitato impatto complessivo sulla spesa sanitaria, a
differenza dello screening universale, ed appare in grado di superare
il problema dei casi senza risultato.
L'estensione del cfDNA/NIPT alle trisomie 18 e 13, utilizzandolo
come screening contingente, non aumenterebbe il ricorso alle tecniche
invasive, qualora i casi senza risultato fossero gestiti con il Test
Combinato.
Il cfDNA/NIPT deve essere offerto nell'ambito di una consulenza con
specialisti di genetica medica/medicina fetale, integrata da un
esaustivo consenso informato, nel quale deve essere fatto specifico
riferimento alla volonta' di essere o di non essere informati su
eventuali risultati incidentali, clinicamente rilevanti, emersi
dall'analisi.
Il cfDNA/NIPT non e' sostitutivo e percio' non evita di effettuare
le altre indagini cliniche, laboratoristiche e strumentali che fanno
parte integrante del monitoraggio della gravidanza.
I Centri che erogano il test devono avere competenze nella diagnosi
ecografica e nella diagnosi prenatale; essere in grado di offrire la
consulenza prima e dopo il test; devono essere collegati con
laboratori certificati, che partecipano a programmi di controllo
della qualita', nazionali ed internazionali e sono dotati di
personale con competenza specifica nelle tecniche NGS.
Le caratteristiche del test raccomandano che esso venga eseguito
presso un numero ristretto di laboratori a livello nazionale; per
questo e' auspicabile una pianificazione ed un accordo
interregionale.
Devono essere predisposte campagne di informazione alla popolazione
e di formazione dei professionisti, per garantire equita'
nell'accesso al test.
4.b.2 La diagnosi prenatale genomica (NGPD - Next Generation Prenatal
Diagnosis)
Il DNA estratto dalle cellule fetali acquisite mediante
amniocentesi o villocentesi, viene di solito esaminato per singoli
geni le cui mutazioni sono causa di malattie mendeliane per le quali
la coppia e' a rischio. I dati raccolti dalla SIGU hanno stimato che
il 5-10% di tutte le indagini molecolari effettuate in Italia
riguardino la diagnosi prenatale di malattie mendeliane. I test
molecolari nel loro complesso sono aumentati negli anni. L'ultima
rilevazione, del 2011 ne aveva censiti piu' di 260.000 (con un
incremento del 6% rispetto alla precedente rilevazione del 2007).
Queste analisi fanno ovviamente riferimento al gene-malattia indagato
(al momento sono note le basi molecolari di circa 4500 malattie
mendeliane per le quali sono disponibili specifici test). Il
sequenziamento tradizionale (secondo la metodica di Sanger) e'
attualmente il gold standard per la diagnosi molecolare prenatale
delle malattie genetiche a difetto molecolare noto. Le tecnologie NGS
hanno rivoluzionato i protocolli diagnostici, rendendo in teoria
possibile l'analisi di tutte le malattie mendeliane. Nelle sue
applicazioni allo studio del DNA fetale, questa procedura viene
definita amniocentesi genomica o diagnosi prenatale con
sequenziamento di seconda generazione o NGPD (Next Generation
Prenatal Diagnosis), impropriamente "super-amniocentesi ". Questa
analisi consente di effettuare lo screening di circa il 50% delle
malattie mendeliane (di molte malattie genetiche non e' ancora noto
il difetto molecolare; inoltre dallo screening sono escluse le
malattie estremamente rare e quelle per le quali non viene ritenuta
etica la diagnosi prenatale). La NGPD non analizza i polimorfismi di
suscettibilita' (SNP), cioe' le varianti che predispongono allo
sviluppo delle malattie complesse, e neppure le malattie ad esordio
tardivo, ne' le malattie del comportamento ne' quelle psichiatriche.
Si possono considerare tre principali scenari all'interno dei quali
effettuare la diagnosi prenatale molecolare, con tecniche
tradizionali e/o NGS.
Il primo, riguarda la diagnosi di una specifica malattia mendeliana
per la quale la gravidanza e' a rischio; il secondo, l'esclusione di
una malattia mendeliana in un feto affetto da difetti
eco-evidenziati, in una gravidanza che non presentava un rischio a
priori aumentato, in base alla storia familiare; il terzo, lo
screening allargato delle mutazioni correlate a molte malattie
mendeliane, in una gravidanza che non presenta a priori uno specifico
aumento del rischio.
Nel primo caso, e' indispensabile identificare nella famiglia o in
un probando la mutazione responsabile della malattia per la quale la
gravidanza e' a rischio. L'approccio piu' efficace e' quello di
definire, prima della gravidanza, il difetto molecolare responsabile
della malattia. In questo caso, la NGS puo' eventualmente essere
utilizzata per ricercare nella famiglia la mutazione patogenetica,
mentre la successiva diagnosi prenatale viene effettuata con un test
molecolare tradizionale.
Nel secondo caso, la NGPD puo' intercettare una malattia mendeliana
non sospettata in base alla storia familiare, qualora il feto
presenti dei difetti, non interpretabili con le tecniche strumentali
e di laboratorio tradizionali. Tuttavia, la detection rate in questi
casi e' molto bassa: in una piccola coorte di feti e neonati con
anomalie ecografiche prenatali e cariotipo normale, la NGPD ha
identificato varianti patogenetiche nel 10% dei casi. Sono inoltre
noti singoli casi di malattie mendeliane sospettate nel corso della
gravidanza, poi risolte con la NGS.
Nel terzo caso, al fine di escludere la presenza di una malattia
mendeliana nel feto, la NGPD puo' trovare applicazione nello
screening delle gravidanze senza rischi specifici, utilizzando le
cellule fetali acquisite con le tecniche invasive routinarie.
Questo test e' oggi disponibile presso alcune strutture private, ma
presenta una serie di criticita', ad esempio, l'incapacita' di
individuare tutte le mutazioni presenti nei geni analizzati, cioe' un
limite nella sensibilita' del test, che dipende essenzialmente dal
numero delle volte in cui la stessa sequenza di DNA viene
decodificata (cosiddetto coverage). Di fatto, non e' chiaro in quale
misura i geni in esame siano "coperti ", il che comporta una
percentuale non piccola di risultati falsi negativi. Inoltre, la
capacita' di questi test di individuare le malattie genetiche nel
feto e' di solito sovrastimata. Infatti, il test individua le
mutazioni presenti in un numero limitato di geni-malattia, di solito
quelli responsabili delle malattie piu' comuni, mentre le malattie
genetiche a difetto molecolare noto sono ben piu' numerose. Inoltre,
il test non riconosce alcuni tipi di errore presenti nel DNA (ad
esempio le mutazioni da espansione del DNA, le inserzioni e le
delezioni). A tutto cio' va aggiunto che le analisi genomiche
identificano migliaia di variazioni nella sequenza del DNA, molte
delle quali prive di significato patologico e molte di
interpretazione non univoca. Percio', questo test necessita di essere
preceduto e seguito da una complessa consulenza genetica.
In conclusione, l'uso di questi test non ha al momento sufficienti
supporti scientifici per giustificarne l'applicazione nella diagnosi
prenatale. A fronte della strabordante pubblicita' ingannevole del
settore, e' indispensabile che le donne che intendono sottoporsi a
questo test ricevano informazioni complete e veritiere da un
genetista medico.
Obiettivi e Raccomandazioni
Da quanto esposto emergono le seguenti priorita', rispetto alle
quali sono identificabili i relativi interventi (Tabella 6):
- Promuovere la diffusione della diagnosi prenatale non invasiva
sul DNA fetale presente nel circolo materno. Relativamente all'uso
del test cfDNA/NIPT per lo screening della trisomia 21, il CSS ha
gia' prodotto la relativa LG. E' tuttavia da garantire l'accesso a
tutta la popolazione target; pertanto permane l'esigenza di
promuovere/monitorare la diffusione dei Percorsi di presa in carico
(PDTA) e la consapevolezza nella popolazione in tutto il personale
sanitario teoricamente coinvolto (Literacy).
- Organizzazione di un percorso. Assunto che la linea-guida
riguarda per definizione la dimensione tecnico-professionale; le
raccomandazioni derivate dalla LG devono portare alla implementazione
di un'organizzazione in grado di accogliere la popolazione target in
un percorso esplicito, basato su 'nodi organizzativi' chiaramente
definiti e procedure di 'ingaggio' precise ed esplicite. Si tratta
quindi di definire un PDTA che prenda in carico gli individui
destinatari dello screening.
- Campagne di informazione: Come espresso nel Capitolo 7, nella
attuale fase di sviluppo dell'uso delle scienze omiche, si tratta
prioritariamente di sviluppare una vera e propria literacy sia del
personale non specializzato del servizio sanitario nazionale sia
della popolazione piuttosto che programmare direttamente l'uso dei
media. Pertanto le esigenze divulgative ed informative sull'uso
appropriato dei test prenatali di carattere genomico vanno perseguite
con le strategie e metodologie previste nel cap 7.
- Definire percorsi per diagnosi prenatale genomica (NGPD - Next
Generation Prenatal Diagnosis). La disponibilita' di sufficienti
evidenze scientifiche mette il Sistema Sanitario in condizione di
inserire tale valutazione in modo sistematico nell'ambito dei servizi
offerti alla popolazione di riferimento (secondo le modalita'
identificate dalle Linee-guida: v. dopo). Si identifica quindi un
intervento di sanita' pubblica con le seguenti caratteristiche:
basato su valutazioni di efficacia sperimentale; organizzato per
profili di assistenza e quindi non soltanto delegato alla competenza
/sensibilita'/ iniziativa tecnico-professionale; mirato all'equita' e
quindi basato sul coinvolgimento attivo della popolazione
destinataria; dotato di un esplicito sistema informativo e di
valutazione. Il processo di trasferimento delle nuove conoscenze
scientifiche nella pratica, impone la sua articolazione nei seguenti
step:
- Produrre line-guida per la definizione di percorsi per diagnosi
prenatale genomica (NGPD - Next Generation Prenatal Diagnosis). Tale
obiettivo puo' essere conseguito in armonia con il Sistema nazionale
linee guida (SNLG) che e' impostato per elaborare raccomandazioni di
comportamento clinico basate sugli studi scientifici piu' aggiornati,
secondo il proprio metodo; e' riconducibile a tale processo anche la
collaborazione con societa' scientifiche ed esperti di settore. In
tale framework di livello nazionale potra' essere prodotta una
linea-guida per l'uso appropriato della diagnosi prenatale genomica
(NGPD - Next Generation Prenatal Diagnosis). La successiva fase di
implementazione e' riconducibile alle responsabilita' e metodi della
programmazione e management dei servizi sanitari regionali e richiede
un processo esplicito di recepimento e applicazione.
- Organizzazione di un percorso. Assunto che la linea-guida
riguarda per definizione la dimensione tecnico-professionale; le
raccomandazioni derivate dalla LG devono portare alla implementazione
di un'organizzazione in grado di accogliere la popolazione target in
un percorso esplicito, basato su 'nodi organizzativi' chiaramente
definiti e procedure di 'ingaggio' precise ed esplicite. Si tratta
quindi di definire un PDTA che prenda in carico gli individui
destinatari dello screening.
- Campagne di informazione: Come espresso nel Capitolo 7, nella
attuale fase di sviluppo dell'uso delle scienze omiche, si tratta
prioritariamente di sviluppare una vera e propria literacy sia del
personale non specializzato del servizio sanitario nazionale sia
della popolazione piuttosto che programmare direttamente l'uso dei
media. Pertanto le esigenze divulgative ed informative sull'uso
appropriato dei test prenatali di carattere genomico vanno perseguite
con le strategie e metodologie previste nel cap 7.
Tabella 6. Interventi identificabili
Parte di provvedimento in formato grafico
4.c Screening neonatale ed approcci genomici
- Introduzione. Lo screening neonatale ha lo scopo di individuare
i neonati affetti da malattie congenite genetiche del metabolismo ed
avviare il piu' precocemente possibile un trattamento in grado di
impedire lo sviluppo e la progressione della malattia. In Italia dal
1999 tutti i neonati sono sottoposti a screening neonatale per
ipotiroidismo congenito, fibrosi cistica, fenilchetonuria. Ulteriori
malattie oggetto di screening introdotte successivamente sono il
deficit di biotinidasi, la galattosemia, l'iperplasia surrenale
congenita. Alcune Regioni hanno promosso uno screening allargato a
piu' di 40 malattie metaboliche, indicazione recepita anche dalle
recenti proposte dei LEA.
Attualmente la "Spettrometria di massa tandem" (MS/MS)
spettrometria di massa e' la tecnica utilizzata per l'analisi di
screening delle malattie metaboliche ereditarie e si basa sul
dosaggio dell'attivita' enzimatica e/o l'identificazione di
metaboliti su spot di sangue essiccato. Come tutti i test di
screening, l'analisi biochimica ha un elevata sensibilita' che riduce
al minimo i "falsi negativi", a scapito di una specificita' piu'
bassa con un numero relativamente elevato di "falsi positivi".
L'analisi genetica nello screening neonatale e' al momento
considerata un esame di II livello, riservato a quei campioni
risultati positivi al test biochimico (I livello), al fine di ridurre
il numero di "falsi positivi". Il suo ruolo e' determinato dalle
caratteristiche intrinseche delle tecnologie utilizzate, quali la
quantita' di DNA necessaria, il costo elevato, i tempi di
refertazione e i limiti tecnici di analisi.
- Introduzione di approcci genomici nello Screening neonatale. Le
tecnologie NGS consentono di rivalutare l'uso dell'analisi genetica
nell'ambito dello screening neonatale, come potenziale test di I
livello in sostituzione dell'analisi biochimica. I vantaggi che ne
deriverebbero comprendono la possibilita' di aumentare lo spettro
delle mutazioni indagabile e l'estensione dell'analisi anche ai geni
responsabili di patologie non metaboliche, comunque trattabili.
Alcuni aspetti renderebbero pero' problematico l'uso delle tecniche
NGS nello screening neonatale. Tra essi, i limiti tecnici
dell'analisi (coverage, riproducibilita', quantita' di DNA necessaria
e tipo di campione), l'interpretazione delle varianti di significato
incerto e la loro rivalutazione a distanza di tempo, la refertazione
di dati non propriamente relativi a malattie metaboliche soggette a
screening (ad es quelli relativi alle malattie ad insorgenza
nell'eta' adulta, la suscettibilita' allo sviluppo di neoplasie, i
dati di farmacogenetica, ecc).
Per tentare di valutare l'efficacia e la riproducibilita' delle
tecniche NGS nello screening neonatale, sono stati condotti alcuni
studi,che hanno utilizzato piccole quantita' di DNA estratto da spot
di sangue essiccato su cartine di Guthrie mediante targeted
resequencing, whole genome sequencing (WGS) e whole exome sequencing
(WES), con risultati pressoche' sovrapponibili a dimostrazione di una
elevata concordanza e riproducibilita' dei risultati.
Altri studi hanno effettuato in parallelo lo screening neonatale
biochimico e l'analisi con tecniche NGS per confrontarne i risultati.
In uno studio di Bodian et al. sono stati analizzati i campioni di
1696 neonati di diversa origine geografica, sia sani che affetti o
prematuri, ed e' stata ottenuta una buona concordanza tra i risultati
biochimici e quelli genetici in 1183 campioni, con una discordanza in
513 casi, comprendenti tra l'altro varianti di significato incerto
(80%), falsi positivi all'analisi biochimica (16%), falsi positivi
all'analisi genetica (3%), falsi negativi all'analisi genomica (1%).
- Aspetti etici e legali. Lo screening neonatale biochimico viene
attualmente eseguito senza richiesta del consenso dei genitori
nell'ambito degli screening obbligatori. L'introduzione dell'NGS
nello screening neonatale comporterebbe l'acquisizione del consenso
dopo aver adeguatamente informato le famiglie riguardo al tipo di
analisi, ai possibili risultati, soprattutto per l'analisi di genoma
o esoma. I genitori avrebbero la possibilita' di scegliere se fare
sottoporre i propri figli al test, con la conseguenza che non tutti i
neonati potrebbero essere sottoposti a screening. I genitori
dovrebbero inoltre decidere se ricevere i risultati relativi alle
patologie metaboliche dello screening e sugli eventuali "incidental
findings" riguardanti malattie ad insorgenza in eta' adulta. Su
questo punto le attuali linee guida sconsigliano l'analisi di WGS e
WES in soggetti sani, soprattutto in minorenni: questa
raccomandazione si basa sulla tutela del diritto di scelta del
singolo individuo di essere informato riguardo ai propri dati
genetici e il consenso puo' essere espresso solo al raggiungimento
della maggiore eta' in caso di dati relativi a patologie di
"rilevanza non immediata".
- La propensione dei genitori. Alcuni studi si sono proposti di
indagare l'interesse dei genitori in relazione alla possibilita' di
sottoporre i propri figli al sequenziamento del genoma. Waisbren et
al. hanno sottoposto un questionario a 663 genitori, subito dopo la
nascita del loro figlio e qualche mese dopo. Dai risultati e' emerso
che la scelta dei genitori e' influenzata in parte dallo stress del
periodo neonatale, e ci sono stati piu' genitori favorevoli
all'analisi WGS tra i casi in cui lo screening biochimico aveva
fornito un risultato patologico. Questi dati sono stati confermati da
un altro studio di Frankel et al., in cui e' stato anche osservato
che il riscontro di mutazioni o varianti comporta un senso di colpa
nei genitori tale da incrementare lo stress e l'ansia del periodo
neonatale. Secondo Waisbren et al, la proposta dell'analisi WGS dopo
qualche mese dal parto ha avuto meno consensi rispetto alla proposta
alla nascita, per cui e' stato concluso che le tempistiche del test
influenzano il parere delle famiglie, probabilmente in relazione allo
stress del periodo neonatale. Joseph e al. hanno proposto di
estendere l'analisi WGS ai genitori di bambini affetti da deficit
immunitario congenito, dopo l'acquisizione del consenso informato ed
un colloquio con le famiglie. Nonostante la differenza dei livelli
culturali e socioeconomici, tutti i genitori erano favorevoli a
ricevere i risultati dell'analisi WGS relativi allo screening
neonatale, ma non tutti concordavano sulle informazioni riguardanti
le malattie a esordio nella vita adulta e sui dati di
farmacogenetica.
Obiettivi e Raccomandazioni
Da quanto esposto emergono le seguenti priorita', rispetto alle
quali sono identificabili i relativi interventi (Tabella 7):
- Definire i percorsi di presa in carico. Considerata
l'evoluzione della conoscenza scientifica e del quadro legislativo,
emerge la priorita' di garantire l'organizzazione della presa in
carico per assicurare qualita' ed equita' di accesso.
Raccomandazioni.
Finora e' stata dimostrata l'efficacia e la riproducibilita'
dell'analisi NGS, anche su campioni utilizzati di routine nello
screening neonatale, caratteristiche tecniche che consentono la
potenziale introduzione di approcci genomici come indagini per lo
screening neonatale. Tuttavia, l'interpretazione delle varianti di
significato incerto e le tempistiche di refertazione delle analisi di
migliaia di campioni, lo stoccaggio dei numerosi dati, rendono poco
realistico al momento il loro impiego come analisi di I livello.
Pertanto attualmente si raccomanda che tecniche di analisi NGS
siano eseguite solo in seconda istanza, successivamente allo
screening biochimico positivo, per ridurre il numero di falsi
positivi, risolvere diagnosi dubbie, distinguere mutazioni causative
di condizioni non identificabili con lo screening biochimico.
A questo proposito la Societa' Europea di Genetica Umana (ESHG
https://www.eshg.org/home.0.html) consiglia di ricorrere al target
sequencing in ambito di screening neonatale, per focalizzare
l'analisi solo alle condizioni genetiche di patologie metaboliche per
le quali e' possibile un trattamento efficace.
Infine, l'introduzione dell'analisi genetica nello screening
implica una riflessione su alcune tematiche, principalmente etiche,
sulla possibilita' di sottoporre un neonato apparentemente sano, che
non ha manifestato ancora sintomi o segni di alcuna patologia, ad
analisi WGS e WES, con conseguente consenso dei genitori
all'informazione dei dati genetici.
Tabella 7. Interventi identificabili
Parte di provvedimento in formato grafico
4.d Test post-natali
4.d.1 Malattie Mendeliane
La possibilita' di analizzare l'intera sequenza del genoma con le
nuove tecniche di sequenziamento di seconda generazione ha trovato
un'estesa applicazione nel riconoscimento delle mutazioni
responsabili di malattie ereditarie. L'approccio genomico ha
rivoluzionato lo studio di queste malattie, supera spesso l'analisi
del singolo gene (o di una sua porzione) considerato responsabile,
quando mutato, della malattia, ma utilizza l'analisi dell'intera
sequenza del DNA genomico, o della porzione codificante (esoma), o di
un pannello allargato di geni potenzialmente coinvolti nella malattia
(targeting resequencing). Il capitolo 3a ha gia' discusso l'approccio
genomico nella diagnosi delle malattie Mendeliane. In questa sezione
del documento vengono sviluppati alcuni concetti in relazione
all'impiego dell'indagine genomica nella prevenzione personalizzata
di queste malattie.
I test genetici
La ricerca genetica applicata all'uomo ha prodotto negli ultimi 30
anni un risultato traslazionale principale, ovvero il trasferimento
delle conoscenze nella pratica clinica, con lo sviluppo dei test
genetici. Secondo una definizione accreditata, "i test genetici
consistono nell'analisi di un gene, del suo prodotto o della sua
funzione, dei cromosomi o di altro DNA, per identificare o escludere
una modificazione che puo' associarsi ad una malattia genetica"
(Harper, 1997).
Tuttavia, dato che i test genetici non analizzano necessariamente
solo le condizioni patologiche, l'autorevole Human Genetic Commission
britannica (2009) ha ridefinito i test genetici indicandoli come "le
analisi rivolte ad individuare la presenza, l'assenza o la mutazione
di un particolare gene, di un cromosoma, di un prodotto di un gene o
di un metabolita, che sono indicative di una specifica modificazione
genetica".
Questa definizione viene correntemente utilizzata come il
contenitore di alcune indagini di largo impatto, soprattutto, ma non
esclusivamente, nella professione medica. Esse comprendono, secondo
la modalita' ricercata: i test diagnostici, i test presintomatici, i
test per l'identificazione dei portatori sani, i test di farmaco
genetica, i test predittivi o di suscettibilita', i test
comportamentali e di orientamento sugli stili di vita, i test di
nutri genetica, i test fenotipici, i test rivolti a definire i
rapporti di parentela, i test ancestrali, i test di compatibilita'
genetica.
I test diagnostici si applicano alle persone affette da qualche
patologia, spesso trasmessa con il modello dell'eredita' semplice o
mendeliana (ad es. distrofia muscolare di Duchenne, da mutazione del
gene DMD), oppure a dismorfismi causati da una patologia cromosomica
(ad es. sindrome di Down da trisomia 21) o genomica (ad es. sindrome
di Williams, da microdelezione 7q11.23), e vengono utilizzati per
confermare un sospetto clinico o per aiutare il clinico in una
diagnosi, per sottoclassificare una malattia, per stabilire
correlazioni genotipo-fenotipo (cioe' tra la costituzione genetica e
l'insieme delle caratteristiche morfologiche e funzionali), e percio'
definire la storia naturale della malattia. In generale, per
migliorare la consulenza genetica e, occasionalmente, per orientare
la terapia.
I test presintomatici si eseguono sulle persone non affette, che
appartengono alle famiglie nelle quali una malattia, ad esordio
tardivo, si trasmette in maniera autosomica dominante (ad es. corea
di Huntington, rene policistico tipo adulto, atassie
spino-cerebellari, distrofia miotonica, ecc.). L'identificazione di
una mutazione nel gene-malattia stabilisce che quella persona, se
vivra' sufficientemente a lungo, sviluppera' la malattia.
I test per l'identificazione dei portatori sani riguardano in
teoria tutta la popolazione, in quanto, per definizione, ogni persona
e' eterozigote (portatore sano) per un piccolo numero di geni che, se
mutati, possono causare delle malattie e che possono essere trasmessi
da una generazione all'altra. Nel caso di pazienti affetti da
malattie recessive (sia autosomiche sia legate all'X), il test
genetico e' indicato per i familiari in eta' riproduttiva, per
definire il rischio di ricorrenza collegato alla condizione di
portatore sano. Nel caso specifico delle malattie autosomiche
recessive, puo' essere orientativamente indicata la frequenza di
1:10.000 nella popolazione degli omozigoti affetti da tale
condizione, per indicare la soglia, al di sotto della quale i
familiari potenzialmente a rischio di essere portatori dovrebbero
essere testati. Di fatto, per una frequenza di 1:10.000 omozigoti
affetti e' attesa una frequenza di eterozigoti di 1:50. In questo
caso un fratello/sorella di un affetto ha 2/3 di probabilita' di
essere eterozigote e, considerata la frequenza di 1:50 eterozigoti
attesa nella popolazione, il loro rischio riproduttivo sale da
1:10.000 (frequenza di quella malattia nella popolazione) a 1:300.
I test di farmacogenetica predicono la risposta individuale ai
farmaci, in termini di efficacia e di rischio relativo di eventi
avversi (ad es. il gene della tiopurina metiltransferasi definisce la
risposta alla 6-mercaptopurina, un farmaco utilizzato nel trattamento
delle leucemie).
I test predittivi o di suscettibilita' valutano, nella persona che
si sottopone al test, la presenza di una suscettibilita' o di una
resistenza nei confronti di una malattia complessa e comune
(cosiddette "malattie multifattoriali" che originano dall'interazione
tra i geni e l'ambiente), diversa da quella media della popolazione
(ad es. suscettibilita' alla celiachia, al diabete tipo 2; alla
malattia di Crohn).
I test comportamentali e di orientamento sugli stili di vita
forniscono informazioni sulle tendenze comportamentali individuali,
sulle capacita' fisiche e cognitive, sulla risposta a certe
condizioni ambientali. Hanno lo scopo di aiutare la persona a
modificarne le conseguenze potenzialmente negative di tali
comportamenti, attraverso cambiamenti elettivi (ad es. analisi
dell'HLA per definire la sensibilita' al berillio, un metallo
utilizzato in vari tipi di lavorazione industriale).
I test di nutrigenetica forniscono informazioni sulle modalita' con
le quali una persona metabolizza i cibi (ad es. geni coinvolti nel
metabolismo dei lipidi, degli acidi grassi, degli zuccheri, degli
aminoacidi).
I test fenotipici identificano le modalita' con le quali il
genotipo condiziona il fenotipo (ad es. correlazione tra certe
mutazioni alleliche del gene LAMNA/C e quadri clinici nosologicamente
distinti).
I test per la definizione dei rapporti di parentela definiscono la
percentuale di geni condivisi dalle persone potenzialmente correlate
a livello genetico (ad es. paternita' e maternita' biologica).
I test ancestrali stabiliscono i rapporti di una persona nei
confronti di un antenato o di una determinata popolazione e quanto
del suo genoma sia stato ereditato dagli antenati appartenenti ad una
particolare area geografica o gruppo etnico.
I test di identificazione genetica determinano la probabilita' con
la quale un campione o una traccia di DNA recuperato da un oggetto o
da altro materiale appartenga ad una determinata persona.
L'approccio finora utilizzato prevede l'analisi di singoli sequenze
di DNA, in relazione al problema che si intende indagare. E' evidente
che con uno studio genomico si raccolgono tutte le informazioni
relative al genotipo di una persona, che di fatto comprendono tutte
le tipologie dei test genetici sopra riportati. Percio' in teoria
fornisce informazioni sulle mutazioni responsabili di malattie
mendeliane, permette di riconoscere i genimalattia per i quali
l'individuo e' portatore sano, fornisce informazioni sulle reazioni
ai farmaci, sulle abitudini alimentari, sui tratti somatici e
comportamentali, sulle malattie complesse per le quali e' a rischio o
nei confronti delle quali e' protetto, e puo' predire le condizioni
di rischio nei confronti di malattie monogeniche ad insorgenza
nell'eta' adulta e/o a penetranza incompleta. Ad esempio, la
mutazione del gene BRCA1 ha una probabilita' di circa il 70 ed il 40%
rispettivamente di esprimersi come tumore della mammella o come
carcinoma dell'ovaio nell'arco della vita di una donna eterozigote.
Questa caratteristica fa assimilare questo test alla categoria dei
predittivi, in quanto e' in grado di identificare una suscettibilita'
diversa da quella media della popolazione. Tuttavia si tende ad
utilizzare la definizione di predittivo solo per i test che
identificano la componente genetica delle malattie multifattoriali,
quelle dovute all'interazione tra l'effetto additivo di piu' geni e
l'ambiente. Analogamente, i test comportamentali e di orientamento
sugli stili di vita e i test di nutrigenetica sono, di fatto, test
predittivi o di suscettibilita' (in quanto si applicano a caratteri
complessi), mentre quelli fenotipici possono essere considerati test
diagnostici (in quanto si applicano a caratteri semplici).
Il sequenziamento del genoma umano e l'impressionante sviluppo
tecnologico, consentono dunque di analizzare in tempi rapidi e a
costi relativamente contenuti l'intero genoma, promettono di rendere
disponibile su larga scala la decodificazione del profilo genomico
individuale e, in teoria, di identificare le variazioni
costituzionali che ci rendono suscettibili alle malattie e che
influenzano i nostri stili di vita.
I test di suscettibilita' e predittivi nel mercato della salute: la
categoria dei "non-pazienti"
Il bioeticista George Annas (2000) aveva immaginato che la
decodificazione del genoma umano avrebbe identificato nella molecola
del DNA una sorta di cartella clinica. Aveva anche anticipato che,
prima di raggiungere quell'obiettivo, sarebbe stato necessario
rispondere ad alcune domande fondamentali, fra le quali: chi e'
autorizzato a creare il 'CD' che contiene l'informazione genetica?
Chi lo conserva? Chi ne controlla l'uso? In che maniera il 'CD'
potrebbe essere trattato come un'informazione medica sensibile? A
distanza di oltre tre lustri da quella previsione, lo scenario
anticipato sembra a portata di mano. Non solo l'obiettivo di
abbattere i costi del sequenziamento del genoma umano e percio' di
renderlo disponibile e' stato raggiunto ma, soprattutto, le tecniche
in grado di processare su larga scala i campioni biologici sono
disponibili presso molti laboratori e i cittadini sono oggetto di
crescenti pressioni da parte del mercato della salute, che enfatizza
le presunte potenzialita' predittive e preventive di queste analisi.
Il sequenziamento del genoma di alcune persone celebri, come i
genetisti James Watson (uno degli scopritori della doppia elica del
DNA) e Craig Venter (uno dei due coordinatori dei progetti che hanno
sequenziato il genoma umano), ha dato il via all'era della "medicina
personalizzata " e ha creato nell'opinione pubblica enormi
aspettative. Una piccola frazione della sequenza di Watson non e'
stata resa pubblica, mentre quella di Venter e' stata pubblicata
nella sua interezza, per quanto riguarda i suoi 23.224 geni e le
regioni variabili, compresi alcuni polimorfismi che lo renderebbero
potenzialmente suscettibile al comportamento antisociale,
all'alcolismo, alla coronaropatia, all'ipertensione, all'obesita',
all'insulino-resistenza, all'ipertrofia del cuore sinistro,
all'infarto acuto del miocardio, al deficit di lipasi lipoproteica,
all'ipertrigliceridemia, all'ictus, alla malattia di Alzheimer.
Craig Venter non e' tuttavia una persona particolarmente
sfortunata. La sua sequenza genomica esemplifica, di fatto, il
"genoma imperfetto " condiviso da ogni persona, per la sola ragione
di appartenere alla specie umana. E' infatti noto che ogni persona,
presa a caso, e' eterozigote per un numero significativo di mutazioni
(il 44% dei geni di Venter era eterozigote per una o piu' varianti).
Un piccolo numero di queste mutazioni riguarda i geni responsabili di
malattie rare (per lo piu' trasmesse in maniera mendeliana), mentre
alcune migliaia di varianti interessano geni correlati alle malattie
complesse, sul cui fenotipo agiscono con un piccolo effetto additivo,
che si somma alla componente ambientale (eredita' multifattoriale).
Il concetto di eredita' multifattoriale e' anche suffragato dal
sequenziamento del primo uomo di provenienza Asiatica, nel quale e'
stata dimostrata la presenza di oltre il 56% dei polimorfismi noti
che conferiscono suscettibilita' alla malattia di Alzheimer, del 15%
di quelli per il diabete, del 10% di quelli per l'ipertensione, del
9% di quelli per la malattia di Parkinson e del 63% di quelli della
dipendenza dal tabacco.
Lo scenario evidenziato dal sequenziamento di questi primi genomi e
confermato dal sequenziamento successivo di centinaia di migliaia di
genomi e il potenziale impatto della "predizione genetica ", basata
sul sequenziamento del genoma delle persone, sulla concezione della
salute era stato delineato una decina di anni prima da Jonsen et al.
(1996), che avevano anticipato l'incombente presenza, sulla scena
della medicina, dei "non-pazienti ". Gia' allora era apparso chiaro
che l'imminente possibilita' di analizzare la suscettibilita' alle
malattie comuni avrebbe avvicinato al mondo della medicina milioni di
persone asintomatiche. Secondo gli autori dell'articolo, gli
unpatients sono una nuova classe di persone all'interno della
medicina: non sono "pazienti" nel senso classico, in quanto non
presentano sintomi; sono persone che condividono predisposizioni
genetiche, che potrebbero vivere nell'attesa dell'ipotetica comparsa
di qualche segno di malattia, organizzano la loro vita in funzione
delle visite mediche o delle analisi di laboratorio, finiscono per
sentirsi ammalati o addirittura sviluppano sintomi psicosomatici.
Senza negare l'importanza del profilo genomico e le sue capacita'
di condizionare in prospettiva la qualita' della vita, non si puo'
non ripetere che il nostro stato di salute/malattia non viene
definito solo dal DNA ma anche dalla sua interazione con l'ambiente.
E' esemplificativo il caso dei gemelli identici (monozigoti) che, pur
condividendo lo stesso DNA, nel corso della vita amplificano le loro
divergenze fenotipiche, in quanto la complessa regolazione del
genoma, che e' fortemente condizionata dall'ambiente, crea, di fatto,
differenze a livello della funzione dei rispettivi genomi.
Proprio sulla base di queste considerazioni, l'epigenetica ha
assunto negli ultimi anni un crescente sviluppo, avendo l'obiettivo
di analizzare gli aspetti funzionali del genoma, in particolare i
processi biochimici che non modificano la sequenza del DNA, ma che
possano modificare il fenotipo attraverso modificazioni funzionali.
Il Catalogo delle Malattie Mendeliane
Il numero complessivo dei fenotipi con accertata o sospetta base
mendeliana superava gli 8000 nel mese di novembre del 2016. Erano
note le basi genetiche di circa i 2/3 dei tali fenotipi
(http://www.omim.org/statistics/entry). Questo gap conoscitivo potra'
essere colmata dalle tecniche di sequenziamento di seconda
generazione. In parallelo sta aumentando il numero dei fenotipi
nosologicamente distinti, come conseguenza del miglioramento delle
capacita' di caratterizzare i fenotipi, alla condivisione delle
terminologie cliniche e delle infrastrutture sulle quali mettere in
comune le casistiche delle malattie rare (Centers for Mendelian
Genomics supportati da NHGRI e NHLBI negli USA, FORGE Canada, e WTDDD
nel Regno Unito). L'aumento del numero dei fenotipi non e' peraltro
inatteso, se si considera che il genoma umano contiene oltre 20.000
geni codificanti proteine, la maggior parte dei quali si e' altamente
conservata nell'evoluzione. E' percio' verosimile che anche la
maggior parte delle mutazioni in questi geni comportino conseguenze
fenotipiche. Si deve inoltre considerare che le alleliche (mutazioni
diverse dello stesso gene) possono associarsi a fenotipi diversi.
La maggior parte delle malattie sono al momento riconducibili alla
parte codificante del genoma, ma sta emergendo un nuovo paradigma. Un
gene e' un tratto di DNA che viene trascritto, anche se non viene
tradotto; e' probabile che quest'altro catalogo di geni (non
codificanti ma utilizzati comunque dal nostro organismo) siano almeno
numerosi quanto quelli codificanti. Stanno di fatto emergendo
malattie monogeniche dovute a mutazioni di sequenze non codificanti
per proteine, ma che codificano per RNA. Il catalogo dei geni e'
quindi destinato ad aumentare, cosi' come il catalogo delle malattie
dovute a mutazioni di sequenze del DNA.
La prevenzione delle malattie mendeliane
I risultati della ricerca e le crescenti potenzialita' diagnostiche
conseguenti all'introduzione nella pratica clinica delle tecniche di
sequenziamento di seconda generazione hanno avuto ripercussioni anche
sul fronte della prevenzione delle patologie mendeliane ad esordio
nella vita post-natale (ad esempio diverse patologie neoplastiche,
miocardiopatie e cardiopatie aritmogene, diabete mellito tipo MODY).
La maggior parte di queste condizioni mostra un elevato grado di
eterogeneita' genetica e pertanto l'approccio NGS e' particolarmente
indicato nella individuazione delle varianti genetiche causative.
Queste tecniche, in particolare l'analisi di pannelli di geni
candidati mediante targeted resequencing, vengono sempre piu'
utilizzate nella prevenzione oncologica e cardiologica. In questo
modo e' stato possibile ottenere un miglioramento della resa
diagnostica, con l'identificazione mediante WES di nuovi
geni-malattia, anche se sono aumentati contestualmente i risultati di
difficile interpretazione, in particolare i cosiddetti VOUS e gli
incidental findings.
Trattandosi di condizioni non frequenti (nel caso di malattie
comuni, come i tumori, le forme su base mendeliana, rappresentano
circa il 5-10% del totale dei casi), l'approccio standard alla
prevenzione delle malattie mendeliane in epoca post-natale prevede
l'individuazione dei soggetti a rischio attraverso l'analisi
dell'albero genealogico ed il fenotipo clinico (ad es. aggregazione
familiare di specifiche patologie, insorgenza in eta' precoce
rispetto alla media della popolazione generale, e/o altre
caratteristiche cliniche specifiche). Un risultato negativo di un
test di predisposizione, eseguito con metodiche tradizionali o
analizzando un pannello di geni, non consente di escludere la
presenza di una variante genetica causativa non rilevata; cio' puo'
essere dovuto al fatto che non sono stati analizzati tutti i geni
noti gia' correlati con il fenotipo di interesse, oppure al
coinvolgimento di altri meccanismi genetici non ancora individuati.
Inoltre, e' noto che l'approccio clinico basato sull'analisi del
fenotipo e sull'impiego dei test convenzionali comporta ritardi ed
errori diagnostici, anche di fronte a patologie per le quali i test
sono ampiamente disponibili e validati, come la fibrosi cistica e la
sindrome dell'X fragile. Un approccio su scala piu' larga (WES o WGS)
dovrebbe quindi consentire di ridurre il numero di risultati non
informativi. In effetti, gli approcci genomici hanno consentito di
individuare nuovi geni responsabili di patologie mendeliane
potenzialmente prevenibili mediante implementazione di specifiche
misure cliniche.
Il sequenziamento genomico preventivo
Il miglioramento delle conoscenze sulle basi genomiche di diverse
patologie, insieme alla riduzione dei costi delle tecnologie di
sequenziamento di seconda generazione, ha dato origine al concetto di
sequenziamento genomico preventivo (Preventive Genomic Sequencing;
PGS), un termine con il quale si indica l'obiettivo di identificare i
portatori silenti di varianti che determinano un'elevata
predisposizione allo sviluppo di malattie mendeliane, in particolare
quelle per le quali sono disponibili approcci preventivi validati. A
differenza dei programmi di screening genetico tradizionali, il PGS
non sarebbe quindi limitato alle persone/famiglie riconosciute ad
alto rischio, ma sarebbe applicabile all'intera popolazione per
individuare casi latenti o non ancora individuati di patologie
genetiche.
La possibile implementazione del PGS comporta diverse
problematiche, di natura etica, legale e clinica. Limitandosi a
considerare quest'ultimo aspetto, il problema centrale e'
rappresentato dalla scelta delle patologie che si vorrebbero testare.
In ambito diagnostico e di ricerca e' stato gia' proposto di limitare
la comunicazione dei risultati incidentali alle varianti genetiche
responsabili di patologie per le quali siano disponibili interventi
clinici di provata efficacia (medically actionable genes; MAGs),
lasciando ai pazienti la scelta se essere informati e, in caso
affermativo, in maniera completa o parziale, dei risultati emersi
dall'indagine.
Al momento e' stato proposto che gli eventuali programmi di PGS,
essendo di natura pilota, siano focalizzati sui MAGs. Un aspetto
importante da chiarire riguarda il grado di informazioni da
comunicare preliminarmente alle persone che richiedono il test e la
possibilita' di decidere se ricevere o meno i risultati inerenti a
specifici geni o malattie. Se la finalita' del PGS fosse la riduzione
della frequenza globale delle patologie causate dalle varianti nei
geni indagati, il programma dovrebbe essere applicato a tutta la
popolazione. Ammesso che tutti i soggetti potenzialmente interessati
potessero accedere al test, l'impatto, in termini di salute pubblica,
non sarebbe tuttavia molto significativo. Si stima infatti un tasso
di risultati positivi dello 0,5-1%. Per alcune patologie, cio'
comporterebbe la possibilita' di implementare programmi di
prevenzione, ma l'incidenza globale della malattia non sarebbe
sostanzialmente ridotta. Ad esempio, i geni BRCA1 e BRCA2 causano
circa il 5- 10% dei tumori del seno e il 15% dei carcinomi ovarici, e
i geni del mismatch repair, associati alla sindrome di Lynch, sono
implicati nell'1-3% dei carcinomi colorettali e nell'1% circa dei
carcinomi dell'endometrio. La maggior parte di questi tumori non
sarebbe quindi prevenibile attraverso l'implementazione di programmi
PGS, e il beneficio, a livello della popolazione generale, sarebbe
limitato. Inoltre, il rischio conferito da una variante patogenetica
riscontrata in un soggetto che non ha storia familiare o personale
della malattia alla quale la variante e' associata potrebbe essere
sostanzialmente diverso da quello che ha una persona affetta e/o con
storia familiare positiva per la malattia, a causa dell'intervento di
fattori modificatori ancora largamente sconosciuti. I database
genetici contenenti i risultati delle analisi WES effettuate con
finalita' di ricerca (ExAC, Exome Aggregation Consortium;
http://exac.broadinstitute.org/) hanno messo in evidenza una
frequenza relativamente elevata di varianti associate a patologie
mendeliane considerate patogenetiche, sollevando dubbi sul loro
effettivo significato clinico.
In conclusione, i test genomici post-natali per la prevenzione
delle malattie mendeliane trovano oggi indicazione per l'analisi di
pannelli di geni mediante targeted resequencing o in silico dopo
sequenziamento dell'intero esoma. Puo' essere preso in considerazione
l'esoma quando la causa genetica di un fenotipo con caratteristiche
che suggeriscono una base mendeliana non e' stata identificata in
base all'analisi dei geni candidati noti. L'offerta e
l'implementazione di programmi di PGS richiede invece ulteriori
discussioni ed eventuali studi pilota per verificarne l'utilita'
clinica e chiarirne le problematiche etiche connesse.
A titolo di esempio, negli approfondimenti viene riportato
l'approccio genomico alla prevenzione delle malattie cardiovascolari
mendeliane (v. Capitolo 8 d).
4 d.2 Test post-natali per malattie complesse.
4.d 2.i Concetti generali
Le analisi genome-wide hanno avuto un grande impatto nella
comprensione delle differenze e percio' della variabilita'
interindividuale e hanno permesso di mappare un migliaio di
loci-malattia associabili a fenotipi di suscettibilita' alle malattie
piu' comuni nell'uomo. La suscettibilita' a sviluppare una
determinata malattia e' dovuta alla componente genetica della
malattia, ovvero la sua "ereditabilita' " riconducibile alle
caratteristiche del genoma individuale, distinguendola dalla
componente ambientale, intesa come alimentazione, farmaci,
microbioma, stili di vita, (esposoma).
L'analisi genetica della suscettibilita' alle malattie complesse ha
permesso di indagare per la prima volta i meccanismi biologici della
variabilita' interindividuale, nonche' dell'ereditabilita'. E' stato
cosi' scoperto che le persone differiscono tra loro in media da 4,1 a
5 milioni di varianti di singolo nucleotide (SNVs), almeno 459.000 -
565.000 delle quali si sovrappongono con le regioni regolatorie, che
circa una ogni 200 basi e' diversa e ogni persona possiede oltre 1500
variazioni che la rendono diversa rispetto alle mappe di riferimento.
Delle varianti trascritte, piu' del 85% sono rare con frequenze
alleliche minori (MAFS) al di sotto dello 0,5%. Inoltre se
considerassimo solo le varianti putativamente funzionali, il loro
numero aumenterebbe di oltre il 95%, a sottolineare l'importanza
dell'analisi delle varianti rare, al fine di stabilire con maggiore
precisione la suscettibilita' ad una malattia o una risposta ad un
farmaco.
La suscettibilita' genetica e' appunto la risultante della
variazione di un gene che altera la funzione biologica espressa dal
gene all'origine, modificando il rischio di un soggetto di sviluppare
una determinata patologia. Si definisce gene di suscettibilita', una
variante genetica che conferisce un rischio modificato di contrarre
una specifica malattia ma non e' di per se sufficiente a causare la
malattia. Le variazioni di questi geni sono note come polimorfismi e
possono variare quantitativamente e qualitativamente. Ad esempio, e'
stato riconosciuto che vi sono almeno 300 polimorfismi che
influenzano lo sviluppo delle patologie cardiovascolari. Tuttavia,
nessuno di questi, valutato singolarmente puo' essere utilizzato per
una stima del rischio predittivo ne' tantomeno come target di
terapia. Il potere predittivo dei singoli polimorfismi e' limitato
proprio dalla loro variabilita' a livello di popolazione, dal
contesto del genoma nella quale si trovano, dall'architettura
genomica (posizione nel gene, presenza di mutazioni aggiuntive,
controllo epigenetico, interazione con altri polimorfismi). Soltanto
un'analisi complessiva delle varianti di rischio (mediante precisi
algoritmi) di un determinato numero di polimorfismi, permette di
prevedere statisticamente il rischio di sviluppare una malattia o di
rispondere a un intervento terapeutico sulla base della
determinazione del genotipo per una o piu' mutazioni geniche. Un
algoritmo (RACE) sviluppato dalle Universita' di Roma Tor Vergata e
Vita e Salute di Milano ha permesso di valutare il rischio
individuale di ogni persona basandosi sull'analisi di 11 geni di
suscettibilita' alle malattie cardiovascolari congiuntamente alla
presenza di tutti gli altri fattori di rischio (fumo, stili di vita,
patologie concomitanti, dati di laboratorio clinico, attivita'
culturale). Combinati insieme in un modello a quattro dimensioni, e'
stato possibile stimare il rischio individuale prospettico in oltre
200 casi con accuratezza e precisione. Questo e' un esempio
applicativo di medicina personalizzata basato sulla variazione
genomica individuale di un set di 11 loci integrato con i fattori di
rischio ambientali riferiti al soggetto in esame e non alla
popolazione generale.
Questi studi nei prossimi anni si moltiplicheranno in conseguenza
della grande quantita' di dati clinici appartenenti ai singoli
soggetti (cartelle cliniche elettroniche), che saranno collegate a
informazioni genotipiche (SNPs) e renderanno possibile Phenome-Wide
association studies (PheWASs) ovvero, analisi comparative delle
varianti genetiche associate a fenotipi multipli utilizzando solo i
dati raccolti nelle banche dati. Il metodo PheWAS ha contribuito a
definire diversi sottotipi di una malattia ed e' determinante negli
studi di riposizionamento dei farmaci e nella medicina di precisione.
L'approccio PheWASs ha permesso di identificare e mappare con
precisione 160 loci-malattie diverse nella regione HLA sul braccio
corto del cromosoma 6 in una regione di DNA di circa 4 Mb, tra cui
geni di suscettibilita' alla schizofrenia, al diabete, alla psoriasi,
al lupus e ad altre malattie autoimmuni. Altri ricercatori hanno
utilizzato il metodo PheWAS per identificare l'origine di alcune
malattie neurologiche, psichiatriche e dermatologiche in segmenti di
DNA di origine Neandertaliana. PheWASs puo' essere utilizzato anche
per scoprire condizioni di co-morbidita', come ad esempio la
suscettibilita' alla paradontite che e' co-localizzata con loci di
suscettibilita' al diabete, all'ipertensione e
all'ipercolesterolemia, o anche di individuare sottotipi di pazienti
con patologie complesse, come nel diabete di tipo 2, distinguendo su
base genetica i soggetti suscettibili ad alcune complicanze, come la
nefropatia o la retinopatia. Analogamente, la neuropatia diabetica e'
stata associata ai polimorfismi di alcuni geni codificanti miRNAs
aprendo la strada a nuovi alleli di suscettibilita' in geni mai
identificati fino ad oggi su base polimorfica. Gli stessi autori
hanno identificato polimorfismi "a monte" del gene MIR1279 che
risultano associati con lo sviluppo della pericardite nei pazienti
affetti da Lupus Eritematoso Sistemico, indipendentemente dagli altri
loci di suscettibilita' alla malattia. Questi esempi dimostrano la
straordinaria potenza dell'approccio genomico per dissezionare le
malattie complesse. Ad esempio hanno identificato come loci di
suscettibilita' alle malattie autoimmuni, i geni STAT4, IL10,
PSORS1C1, PTPN2, ERAP1, TRAF3IP2 e MIR146A, che influenzano la
sintomatologia dell'artrite reumatoide in modo pleiotropico e
additivo.
Attualmente le ricerche sulle basi biologiche dei caratteri
complessi restano essenzialmente oggetto di studio; in questo
contesto si va sempre piu' configurando l'idea che le malattie comuni
siano determinate dall'effetto cumulativo di molte variazioni che
individualmente conferiscono un rischio di malattia molto modesto o
addirittura trascurabile, se non in associazione con molte/moltissime
altre variazioni.
L'utilizzo clinico dei polimorfismi di suscettibilita' dovrebbe
tenere conto di alcune cautele principali. In primo luogo, le persone
non dovrebbero sottoporsi a questi test senza conoscere a priori come
utilizzare i risultati. In secondo luogo, deve essere chiaro che
almeno un test ogni 20, tra quelli con una dichiarata specificita'
del 95%, fornisce un risultato falso positivo; ne consegue che il
sequenziamento completo del genoma di una persona fornisce un
risultato contenente almeno 6000 errori. Inoltre, va ricordato che,
all'interno dei dati ottenuti, ne vengono evidenziati alcuni di non
chiaro significato clinico (i cosiddetti VUS - Variations of Unknown
Significance), oppure la specificita' allelica (posizione in
cis/trans degli alleli in condizione di eterozigosi) che limitano
ulteriormente il potere predittivo di queste analisi. Non ultimo, il
valore clinico di un'indagine di questo tipo dipende dalla
possibilita' di collegare specifiche varianti ad un miglioramento
dell'esito clinico, il che di solito non e' affatto scontato. La
diversita' genetica individuale si presenta come un continuum che va
da polimorfismi neutri, attraverso polimorfismi funzionali e
suscettibilita' alla malattia con varianti di vero significato
patologico. E' evidente pertanto che diverse combinazioni di
polimorfismi a minore o elevato rischio costituiscono una rete
complessa e funzionale con diverse conseguenze cliniche. Infatti, e'
proprio la combinazione di alleli comuni a bassa penetranza con
alleli rari ad elevata penetranza che influenzano l'eta' di
insorgenza e / o la gravita' clinica di una malattia complessa. La
definizione del rischio per un singolo soggetto non dipende quindi
solo dal numero e dalla posizione delle varianti di suscettibilita'
individuate, ma anche dalla composizione unica del proprio genoma a
livello di carico mutazionale. A questo si aggiunge l'impatto fornito
dai fattori epigenetici e ambientali che in modo sinergico e a volte
antagonista, puo' contribuire alla definizione del fenotipo (in modo
deleterio o protettivo) perturbando l'equilibrio di vie metaboliche
specifiche innescando o inibendo il processo patogenetico. Per questa
ragione e' necessario sviluppare nuovi algoritmi in grado non solo di
identificare quelle varianti funzionali di elevato significato
clinico ma capaci di elaborare rischi personalizzati interattivi con
singoli fattori ambientali e migliorare in tal modo la nostra
comprensione della natura della malattia complessa.
4.d 2.ii L'esempio delle malattie cardiovascolari multifattoriali
La cardiopatia ischemica e' la prima causa di morte nel mondo
occidentale. L'aterosclerosi coronarica e' il substrato
anatomopatologico che sottende quasi tutte le manifestazioni cliniche
(angina cronica stabile, sindromi coronariche acute, morte improvvisa
coronarica) della cardiopatia ischemica.
La malattia aterosclerotica coronarica e' una malattia complessa
alla cui espressione clinica concorrono due meccanismi patogenetici
ugualmente importanti: i fattori ambientali comunemente chiamati
fattori di rischio; la suscettibilita' genetica, cioe' tutto il
corredo dei geni con i propri polimorfismi che facilitano il processo
aterosclerotico.
I fattori ambientali o di rischio, sono stati identificati nei
principali studi epidemiologici, ad esempio il Framingham Heart Study
effettuato a partire dal 1948 nella cittadina statunitense di
Framingham (Massachusetts) e piu' recentemente l'INTERHEART, che ha
individuato, in ordine decrescente di odds ratio o probabilita' di
associazione il livello di colesterolo, il fumo, il diabete,
l'ipertensione, l'obesita', ed ha individuato, come fattori
protettivi, il consumo giornaliero di frutta e verdura, l'esercizio
fisico e un moderato consumo di alcool. I fattori di stress
psico-sociali sono stati classificati come fattori che influenzano
negativamente tutti gli altri.
Sono state proposte molte le teorie che hanno cercato di spiegare
la formazione della placca aterosclerotica.
Quella oggi piu' accreditata e' la teoria metabolica, che pone il
colesterolo LDL come punto cardine nella formazione, progressione e
destabilizzazione della placca aterosclerotica.
E' stato riconosciuto uno stretto legame tra alcuni polimorfismi
dei geni che codificano per proteine importanti nei processi
biologici alla base della formazione della placca aterosclerotica e
della fisiologia cardiocircolatoria e lo sviluppo delle patologie
cardiovascolari. Ad esempio e' noto che il polimorfismo M235T del
gene codificante per l'angiotensinogeno (AGT) e' strettamente
correlato con l'ipertensione arteriosa. Numerosi altri studi hanno
riguardato i geni che producono proteine/enzimi attivi nel
metabolismo del colesterolo, della coagulazione, delle lipoproteine,
dell'aggregazione ed adesione piastrinica, dei processi infiammatori
a livello della parete vasale, del collagene e dell'ossidazione delle
LDL, nonche' dei loro recettori. Tra questi, i geni di maggiore
interesse per la definizione della suscettibilita' genetica
comprendono: i geni del metabolismo lipidico (ApoB, ApoCIII, ApoE,
CETP, LPL, PON, TRIB1); dell'ipertensione (ACE, AGT, ATIIR1); del
metabolismo dell'omocisteina (MTHFR, CBS); della trombosi (FV, FBNGN,
GPIIIa); dell'adesione leucocitaria (ELAM) ed altri geni a funzione
sconosciuta ma probabilmente con attivita' regolatoria, come la
regione non codificante 9p21 e regolazione dei geni CDKN2B e CDKN2A,
considerato oggi un polimorfismo ad elevata penetranza nelle malattie
cardiovascolari.
Quanti e quali di questi geni di suscettibilita' all'aterosclerosi
e all'infarto del miocardio possono essere considerati importanti per
la predizione della malattia?
Ogni allele di suscettibilita' deve essere identificato e
classificato in base al proprio score genetico di rischio (GRS)
risultante dalla combinazione degli alleli di rischio. Un GRS
rappresenta l'elemento costante di esposizione al rischio
dell'individuo durante tutta la sua vita che naturalmente si
interfaccia con gli altri fattori di rischio ambientali. Utilizzando
specifici algoritmi, e' possibile stabilire un punteggio di rischio
genetico (GRS) associato al rischio cardiovascolare individuale e
stabilire, l'eventuale effetto additivo o moltiplicativo dei singoli
fattori di rischio nella valutazione complessiva del rischio
ischemico nella malattia coronarica. Ad esempio, i valori del
colesterolo LDL e dei trigliceridi hanno un effetto additivo sul
rischio cardiovascolare, quando combinati, ma la loro interazione con
il GRS e' piu' complessa e potrebbe avere un effetto moltiplicativo.
Questo conferma che la progressione dell'aterosclerosi e' la
risultante di una combinazione tra il processo infiammatorio e i
livelli lipidici. E' bene chiarire subito che un set di geni
selezionati esclusivamente in base alla loro funzione nella
patogenesi cardiovascolare possono essere utili in termini di
predizione del rischio di malattia coronarica. Tuttavia, nessuno di
questi geni, valutato singolarmente, puo' essere utilizzato per una
valutazione del rischio predittivo ne' tantomeno come target di
terapia. Soltanto un'analisi complessiva delle varianti di rischio
(mediante precisi algoritmi) di un determinato set di geni
non-pleiotropici validato e qualificato, attraverso opportuni studi
di popolazione, e di analisi retrospettive e prospettive, permette di
prevedere statisticamente il rischio individuale di sviluppare la
malattia aterosclerotica o di rispondere a un intervento terapeutico
sulla base della determinazione del genotipo per una o piu' mutazioni
geniche.
Oltre ai polimorfismi che aumentano direttamente il rischio di
sviluppare malattie cardiovascolari, esistono alcuni geni che
indirettamente aumentano tale rischio. Queste suscettibilita'
"indirette" sono dovute ad alcuni geni che influenzano comportamenti
non salutari come il consumo di alcool e tabacco. L'importanza
"comportamentale" nella modificazione del rischio individuale e'
stata dimostrata in maniera inconfutabile da alcuni studi di
popolazione sulle migrazioni. Ad esempio, gli individui giapponesi
hanno una piu' bassa incidenza di sviluppare CVD rispetto agli
americani, ma gli americani-giapponesi, che hanno adottato uno stile
di vita "occidentale", hanno la stessa incidenza di sviluppare CVD
della restante popolazione americana. Un altro drammatico esempio di
una popolazione stazionaria, che ha subito un cambiamento ambientale,
e' quello degli Indiani Pima dell'Arizona. Prima dell'adattamento
allo stile di vita occidentale, questi indiani avevano una modesta
incidenza di obesita' e diabete, attualmente invece queste malattie
sono in dilagante crescita in questa popolazione. Molto studi
scientifici hanno documentato che la differenza di incidenza delle
CVD tra le popolazioni e' dovuta principalmente a fattori ambientali.
Questo non si puo' dire tuttavia per le popolazioni che non
differiscono nella suscettibilita' genetica; per esempio, gli indiani
Pima hanno sorprendentemente una bassa incidenza di CVD nonostante
l'alta frequenza di diabete. Le interazioni gene-ambiente sono
difficili da studiare negli esseri umani, ma gli studi
genetico-epidemiologici hanno rivelato alcuni esempi possibili. I
Masai, una tribu' dell'Africa orientale, hanno una alimentazione
estremamente elevata di grassi (la loro dieta e' composta quasi
interamente da prodotti di origine animale), ma i loro livelli di
colesterolo tendono ad essere relativamente bassi. Questo e' una
conseguenza di una insolita regolazione a feedback negativo della
sintesi del colesterolo per ragioni genetiche. D'altra parte, gli
eschimesi hanno relativamente scarsa repressione della sintesi del
colesterolo in risposta ad una dieta con un elevato contenuto di
grassi. Questo e' conseguente all'adattamento a condizioni ambientali
estreme con basse temperature e dieta ricca di acidi grassi
polinsaturi, che ha permesso di selezionare varianti specifiche di
geni codificanti per desaturasi che modulano il metabolismo degli
acidi grassi semi essenziali.
L'importanza del GRS nelle malattie cardiovascolari attualmente
puo' essere importante nella valutazione dell'aumento del rischio di
un consanguineo di un individuo affetto rispetto alla popolazione
generale. Le CVD si presentano di solito dopo i 55 anni, per cui tali
valutazioni sono importanti soprattutto negli eventi cardiovascolari
precoci. L'utilizzo del GRS nella valutazione del rischio preventivo
di malattia coronarica dovrebbe pertanto essere utilizzato nella
pratica clinica solo nelle seguenti condizioni:
- consulenza genetica pre- e post-test;
- impiego di polimorfismi non-pleiotropici gia' analizzati e
validati;
- interpretazione del risultato effettuato da un team di esperti
con figure professionali differenti (cardiologi, genetisti,
bioinformatici);
- il Centro che offre il test deve disporre di database, di
programmi e di algoritmi in grado di interconnettere i dati clinici
con i dati genetici.
Obiettivi e Raccomandazioni (Cap.4 d 2)
Da quanto esposto emergono le seguenti priorita', rispetto alle
quali sono identificabili i relativi interventi (Tabella 8):
- Promuovere il ricorso alla valutazione della suscettibilita'
genetica nei pazienti con CVD e di un programma organizzato di
screening del GRS nei familiari sani. La disponibilita' di
sufficienti evidenze scientifiche mette il Sistema Sanitario in
condizione di inserire tale screening in modo sistematico nell'ambito
dei servizi offerti alla popolazione di riferimento (come definita
dalle Lineeguida: v. dopo). Si identifica quindi un intervento di
sanita' pubblica con le seguenti caratteristiche: basato su
valutazioni di efficacia sperimentale; organizzato per profili di
assistenza e quindi non soltanto delegato alla competenza
/sensibilita'/ iniziativa tecnico-professionale; mirato all'equita' e
quindi basato sul coinvolgimento attivo della popolazione
destinataria; dotato di un esplicito sistema informativo e di
valutazione.
Sono disponibili LG e raccomandazioni a livello internazionale ma
appare comunque utile verificarne la contestualizzazione nel Sistema
Sanitario italiano. E' quindi necessario:
- Contestualizzare linee-guida per la valutazione della
suscettibilita' genetica nei pazienti con CVD e dello GRS nei
familiari sani. Tale obiettivo puo' essere conseguito in armonia con
il Sistema nazionale linee guida (SNLG) che e' impostato per
elaborare raccomandazioni di comportamento clinico basate sugli studi
scientifici piu' aggiornati, secondo il proprio metodo; e'
riconducibile a tale processo anche la collaborazione con societa'
scientifiche ed esperti di settore. In tale framework di livello
nazionale potra' essere prodotta una contestualizzazione di una
linea-guida internazionale. La successiva fase di implementazione e'
riconducibile alle responsabilita' e metodi della programmazione e
management dei servizi sanitari regionali e richiede un processo
esplicito di recepimento e applicazione
- Organizzazione di un percorso. Assunto che la linea-guida
riguarda per definizione la dimensione tecnico-professionale; le
raccomandazioni derivate dalla L-G devono portare alla
implementazione di un'organizzazione in grado di accogliere la
popolazione target in un percorso esplicito, basato su 'nodi
organizzativi' chiaramente definiti e procedure di 'ingaggio' precise
ed esplicite. Si tratta quindi di definire un percorso diagnostico-
terapeutico- assistenziale (PDTA) che prenda in carico gli individui
destinatari dello screening.
Tabella 8: Interventi identificabili
Parte di provvedimento in formato grafico