Allegato 3
Dopo l'Allegato 3 dell'ordinanza del Ministro della salute 28 maggio
2015 e' inserito il seguente:
"Allegato 3-bis PROVE DIAGNOSTICHE PER LA RICERCA DI ANTICORPI
ANTI-RB51
Il test sierologico per la ricerca di anticorpi anti-RB51 e' la prova
della Fissazione del Complemento (FdC-RB51) specifica per RB51. Tutti
i capi dell'allevamento in cui si sospetti l'uso illecito di vaccino
devono essere sottoposti a prelievo ufficiale di sangue da parte
della ASL competente per territorio e saggiati mediante la prova
FdC-RB51.
La FdC-RB51, se eseguita durante i primi mesi dopo l'ultima
somministrazione di vaccino RB51, ha una sensibilita' elevata, cioe'
un'elevata probabilita' di identificare correttamente un animale
vaccinato.
Questa sensibilita' nei bovini e nei bufali e' prossima o superiore
al 90% nei primi 4 mesi, per scemare poi progressivamente, in animali
vaccinati in eta' prepubere e con tripla dose con richiamo. La
specificita' della prova, cioe' la sua capacita' di identificare
correttamente animali non vaccinati, e' stata stimata usando sieri di
campo di bovini e bufali non sottoposti a vaccinazione con RB51 ed e'
risultata pari a 99.9% (C.I. 99.73-99.96%).
Per l'esecuzione della prova deve essere utilizzato l'antigene
omologo prodotto con vaccino RB51 titolato con siero di riferimento
di bovino e di bufalo. La FDC deve essere effettuata nel seguente
modo:
1) inattivare i sieri bovini/bufalini, nativi o prediluiti, a 58°C
per trenta minuti;
2) distribuire 0,025 ml di ciascun siero in esame inattivato in
micropiastra e diluirli per raddoppio, dalla diluizione 1:4 alla
diluizione 1:128;
3) distribuire 0,025 ml di antigene liofilizzato e pronto all'uso,
in ciascun pozzetto contenente il siero diluito ed inattivato;
4) distribuire 0,025 ml di complemento precedentemente titolato a 2
Unita' fissanti il complemento al 100%;
5) agitare e porre in incubazione a 37°C per trenta minuti in
bagnomaria o in termostato;
6) dopo la prima incubazione, aggiungere 0,025 ml di sistema
emolitico contenente due unita' di emolisina (siero iperimmune di
coniglio anti-globuli rossi di montone) precedentemente titolate, ed
una sospensione di globuli rossi di montone al 2%;
7) agitare e porre in incubazione a 37°C per trenta minuti in
bagnomaria o in termostato;
8) dopo la seconda incubazione, centrifugare la micropiastra e
procedere con la lettura. Verificare che i controlli presentino la
reattivita' attesa;
9) leggere e registrare il titolo dei sieri in esame, che e'
rappresentato dalla piu' alta diluizione del siero che ha determinato
fissazione del complemento. Il valore soglia per la positivita' della
prova e' 1:4 al 100% di fissazione.
La prova intradermica della Brucellina (BST), se eseguita durante i
primi mesi dopo l'ultima somministrazione di RB51, ha una
sensibilita' piuttosto bassa, inferiore alla FdC-RB51, che pero' si
mantiene costante nel tempo invece di scemare rapidamente. Inoltre,
la specificita' della BST (cioe' la probabilita' di dare risultato
negativo in un animale non vaccinato) e' molto alta. L'effetto
combinato di questa bassa sensibilita' e alta specificita' rende la
prova inadatta a certificare che un animale non e' stato vaccinato (o
nel caso dell'infezione da brucella selvaggia, che l'animale e'
sano), quindi si tratta di una prova inadatta per la certificazione
degli animali nel commercio internazionale.
Contemporaneamente, data l'elevata specificita', se un animale
risulta positivo alla BST ha un'elevata probabilita' di essere venuto
a contatto con l'antigene brucellare (vaccinale o selvaggio che sia).
Procedere nel modo seguente:
- Tosare l'area da sottoporre ad inoculo tra il terzo distale del
collo e la spalla facendo attenzione a non lesionare la cute.
L'area di inoculo non deve essere raggiungibile dalle corna ne'
deve essere soggetta al contatto ripetuto con eventuali strutture
dell'allevamento.
- Misurare lo spessore della cute, sollevata in plica, mediante
cutimetro.
- Registrare lo spessore della cute rilevata sul modello 2/33
- Inoculare per via intradermica di 0,1 ml di Brucellergene OCB®
con una siringa da insulina, sollevando in plica la cute
dell'area da inoculare. Inserire l'ago parallelamente alla cute
in modo da effettuare una inoculazione intradermica. Dopo
inoculazione della brucellina si osservera' la comparsa di un
piccolo pomfo. Evidenziare l'area di inoculo mediante apposizione
di simbolo colorato.
- Dopo 72h, lo stesso personale che ha eseguito l'inoculo si
recera' di nuovo in azienda per la verifica dell'eventuale
reazione intradermica effettuando le seguenti operazioni:
o Osservazione del punto di inoculo per evidenziare l'eventuale
comparsa di una reazione cutanea visibile e palpabile;
o Misurazione dello spessore della cute dell'area di inoculo con
cutimetro
o Un aumento dello spessore della cute uguale o maggiore ai 2 mm
e' considerato come esito positivo alla prova di
intradermoreazione.
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| Numero animali | Numero massimo |
| esaminati |animali positivi |
+===================+=================+
|1,131 |1 |
+-------------------+-----------------+
|132,303 |2 |
+-------------------+-----------------+
|304,506 |3 |
+-------------------+-----------------+
|507,73 |4 |
+-------------------+-----------------+
|731,968 |5 |
+-------------------+-----------------+
|969,1218 |6 |
+-------------------+-----------------+
|1219,1475 |7 |
+-------------------+-----------------+
|1476,174 |8 |
+-------------------+-----------------+
|1741,2011 |9 |
+-------------------+-----------------+
|2012,2286 |10 |
+-------------------+-----------------+
|2287,2566 |11 |
+-------------------+-----------------+
|2567,285 |12 |
+-------------------+-----------------+
|2851,3137 |13 |
+-------------------+-----------------+
|3138,3426 |14 |
+-------------------+-----------------+
|3427,3719 |15 |
+-------------------+-----------------+
|3720,4014 |16 |
+-------------------+-----------------+
|4015,4311 |17 |
+-------------------+-----------------+
|4312,461 |18 |
+-------------------+-----------------+
|4611,4912 |19 |
+-------------------+-----------------+
|4913,5214 |20 |
+-------------------+-----------------+