ALLEGATO
1. PREMESSA.
Le metodiche riportate nel presente allegato si applicano
esclusivamente ai tensioattivi anionici e non ionici.
Come "metodo di scelta" per la determinazione della
biodegradabilita' dei suddetti tensioattivi deve essere utilizzato
uno dei seguenti metodi, secondo quanto previsto dalle direttive n.
82/242/CEE e n. 82/243/CEE:
metodo OCSE, pubblicato nella relazione tecnica dell'OCSE dell'11
giugno 1976 "Proposition de methode pour la determination de la
biodegradabilite' des agents de surface utilises dans les detergents
synthetiques";
metodo in vigore in Germania, approvato con "Verordnung uber die
Abbaubarkeit anionischer und nichtionischer grenzflachenaktiver
Stoffe in Waschund Reinigungsmitteln" del 30 gennaio 1977, parte I,
pag. 244, nel testo del regolamento modifica detto regolamento, del
18 giugno 1980, pubblicato nel Bundesgesetzblatt 1980, parte I, pag.
706;
metodo in vigore in Francia, approvato con decreto del 28
dicembre 1977 pubblicato nel Journal officiel de la Repubblique
francaise del 18 gennaio 1978, e norma sperimentale T 73/270 marzo
1974, pubblicata dall'Association francaise de normalization"
(AFNOR);
metodo in vigore nel Regno Unito denominato "Porous Pot Test",
descritto nella relazione tecnica n. 70 (1978) del Water Research
Centre.
Tenuto conto della larga diffusione del "metodo di scelta"
proposto dall'OCSE, se ne riporta integralmente la procedura al
successivo paragrafo 4.
Come "metodo di conferma" per la determinazione della
biodegradabilita' dei tensioattivi anionici e non ionici deve essere
utilizzato quello riportato al successivo paragrafo 5 e
corrispondente ai metodi allegati alle direttive n. 82/243/CEE e n.
82/242/CEE.
2. TERMINOLOGIA.
Nel presente contesto valgono le seguenti definizioni:
biodegradabilita': attitudine alla biodegradazione;
biodegradazione: demolizione dei tensioattivi, effettuata per
azione di microrganismi, in prodotti piu' semplici, nelle condizioni
del metodo di saggio;
percentuale di biodegradabilita': la percentuale di tensioattivi
sintetici, di ciascuna categoria, biodegradata secondo i metodi sotto
specificati;
tensioattivi anionici (ai sensi della direttiva n. 82/243/CEE):
quei tensioattivi che, dopo essere passati attraverso scambiatori di
cationi e di anioni, vengono separati mediante eluizione frazionata e
determinati come sostanza attiva al blu di metilene (MBAS) con il
metodo di analisi descritto al paragrafo 6;
tensioattivi non ionici (ai sensi della direttiva n. 82/243/CEE):
quei tensioattivi che, dopo essere passati attraverso scambiatori di
cationi e anioni, vengono determinati come sostanza attiva allo iodio
bismutato (BIAS) con il metodo di analisi descritto al paragrafo 7.
3. TRATTAMENTO PRELIMINARE DEI PRODOTTI DA ESAMINARE.
3.1. Principio.
Per eseguire correttamente la prova di biodegradabilita' e'
necessario isolare le sostanze tensioattive dal detersivo, eliminando
i componenti insolubili ed inorganici che potrebbero falsare la prova
stessa. A tale scopo si effettua una estrazione alcolica: da un
campione omogeneo (polvere, paste e liquidi previamente essiccati) si
ottiene un estratto etanolico che contiene i tensioattivi, i saponi
ed altri componenti solubili in alcool; l'estrazione quantitativa non
e' necessaria tuttavia e' opportuno estrarre almeno l'80% dei
tensioattivi presenti; normalmente si ottiene il 90% e piu'.
E' inoltre necessario isolare e separare i tensioattivi anionici e
non ionici dai cationici o dai saponi. Questo risultato e' ottenuto
con una tecnica di scambio ionico: l'estratto etanolico viene
evaporato sino ad essiccazione, disciolto in una miscela
isopropanolo/acqua e la soluzione ottenuta viene passata attraverso
un dispositivo misto, composto da uno scambiatore cationico
fortemente acido e di uno scambiatore anionico macroporoso scaldato
fino a 323 K (50 C). Questa temperatura e' necessaria per evitare
la precipitazione di acidi grassi in ambiente acido.
I tensioattivi non ionici rimangono nell'effluente dal quale sono
ottenuti mediante evaporazione; gli acidi grassi dei saponi vengono
separati mediante eluizione con etanolo contenente CO2;i tensioattivi
anionici sono ottenuti sotto forma di sali di ammonio (che verranno
utilizzati nella prova di degradazione) mediante eluizione con una
soluzione acquosa isopropanolica di bicarbonato di ammonio; i
tensioattivi cationici, che potrebbero falsare la prova di
biodegradabilita' ed il metodo di analisi, sono eliminati dallo
scambiatore cationico posto sopra lo scambiatore anionico. In tal
modo con un'unica operazione vengono eliminati i saponi e i
tensioattivi cationici e vengono isolati i tensioattivi anionici e
non ionici.
3.2. Reattivi.
3.2.1. Acqua deionizzata.
3.2.2. Etanolo 95% v/v (C2H5OH) (denaturante ammesso:
metiletilchetone o metanolo).
3.2.3. Miscela isopropanolo/acqua (50/50 v/v):
- 50 parti in volume di isopropanolo (CH3COHCH3) e
- 50 parti in volume di acqua (3.2.1.).
3.2.4. Soluzione di anidride carbonica in etanolo
(approssimativamente 0,1% di CO2): mediante un tubicino di
alimentazione munito di un setto di vetro poroso incorporato passare
la CO2 attraverso l'etanolo (3.2.2.) per 10 minuti. Usare soltanto
soluzioni preparate di fresco.
3.2.5. Soluzione di bicarbonato di ammonio (60/40 v/v): 0,3 moli di
NH4HCO3 in 1000 cm(Elevato al Cubo) di miscela isopropanolo/acqua
composta di 60 parti di isopropanolo e 40 parti di acqua (3.2.1.).
3.2.6. Scambiatore di cationi (KAT), fortemente acido, resistente
all'alcool (50-100 mesh).
3.2.7. Scambiatore di anioni (AAT), macroporoso, Merck Lewatit, MP
7080 (70-150 mesh) o equivalente.
3.2.8. Acido cloridrico (10% HCl p/p).
3.3. Apparecchiatura.
3.3.1. Pallone da 2000 cm(Elevato al Cubo) a fondo tondo con tappo
conico di vetro smerigliato e condensatore a riflusso.
3.3.2. Imbuto - filtro di 90 mm di diametro (riscaldabile) per filtri
di carta.
3.3.3. Beuta per filtrazione a vuoto avente una capacita' di 2000
cm(Elevato al Cubo).
3.3.4. Colonne di scambio con camicia riscaldabile e rubinetto:
tubo interno di 60 mm di diametro a 450 mm di altezza (fig. 1).
3.3.5. Bagnomaria.
3.3.6. Forno per essiccazione a vuoto.
3.3.7. Termostato.
3.3.8. Evaporatore rotante.
3.3.9. Beuta da 5000 cm(Elevato al Cubo).
3.4. Procedimento.
3.4.1. Controllo analitico.
Dopo l'omogeneizzazione del campione di detersivo, e' necessario
determinare in esso la concentrazione dei tensioattivi anionici
(sulla base del tenore di MBAS, con il metodo di analisi descritto al
paragrafo 6), dei tensioattivi non ionici (sulla base del tenore di
BIAS, con il metodo di analisi descritto al paragrafo 7) e dei saponi
(con un opportuno metodo).
Questa analisi del prodotto e' necessaria per poter calcolare le
quantita' di detersivo da sottoporre a estrazione e stabilire le
necessarie separazioni dei tensioattivi.
3.4.2. Estrazione e separazione dei tensioattivi anionici e non
ionici.
3.4.2.1. Preparazione dell'estratto.
La quantita' di tensioattivi necessaria alla prova di
biodegradabilita' e' di circa 50 g di MBAS e 25 g di BIAS, per il
metodo di conferma.
Di norma, nella preparazione degli estratti per le prove di
biodegradabilita' la quantita' di prodotto da usare non deve superare
i 1000 g (2000 g per i non ionici), ma puo' rivelarsi necessario
estrarre maggiori quantita' di campione e quindi effettuare
l'operazione 2 o piu' volte per ottenere il quantitativo sufficiente
per la prova di biodegradabilita'. L'esperienza ha dimostrato che e'
piu' vantaggioso ricorrere a varie piccole estrazioni anziche' ad
un'estrazione di grande quantita'. per quanto concerne gli
scambiatori, le quantita' specificate sono sufficienti a lavorare con
600-700 mmol di tensioattivi e saponi.
Per l'esecuzione della prova di biodegradabilita' con il solo
metodo di scelta, si operi su quantita' inferiori di prodotto da
estrarre, usando quantita' proporzionali dei vari solventi e
reagenti.
3.4.2.2. Isolamento dei composti solubili in alcool.
Aggiungere 250 g del detergente da analizzare a 1250 cm(Elevato al
Cubo) di etanolo e, agitando, portare la miscela all'ebollizione
sotto riflusso per un'ora. Filtrare la soluzione alcoolica bollente
attraverso un filtro a pori larghi posto su di un imbuto scaldato a
323 K (50 C) e aspirare rapidamente. Lavare la beuta e l'imbuto
filtrante con 200 cm(Elevato al Cubo) di etanolo caldo. Raccogliere
il filtrato e il liquido di lavaggio in una beuta per filtrazione a
vuoto.
In caso di prodotti pastosi o liquidi, accertarsi che il campione
non contenga piu di 55 g di tensioattivi anionici e 35 g di saponi.
Evaporare il campione pesato sino ad essiccazione. Disciogliere il
residuo in 2000 cm(Elevato al Cubo) di etanolo e procedere come
sopra.
Nel caso di polveri di debole densita' apparente (Q300 g/l/) si
raccomanda di aumentare la proporzione d'etanolo nel rapporto di 20:
1.
Far evaporare il filtrato di etanolo sino ad essiccazione, di
preferenza con un evaporatore rotante. Ripetere l'operazione se
occorre una maggiore quantita' di estratto. Disciogliere la totalita'
del residuo in 5000 cm(Elevato al Cubo) di una miscela di
isopropanolo/acqua.
3.4.3. Preparazione delle colonne di scambio ionico.
Colonna di scambio cationico.
Versare 600 cm(Elevato al Cubo) di resina scambiatrice di cationi
(3.2.6.) in un becher di 3000 cm(Elevato al Cubo) e aggiungere 2000
cm(Elevato al Cubo) di acido cloridrico (3.2.8.). Lasciare riposare
per circa due ore agitando ad intervalli. Decantare l'acido e
trasferire la resina nella colonna (3.3.4.) mediante acqua
deionizzata. La colonna deve contenere un tampone di lana di vetro.
Lavare la colonna con acqua deionizzata ad una velocita' di flusso di
10-30 cm(Elevato al Cubo)/minuto fino a che l'eluato sia esente da
cloruri. Spostare l'acqua con 2000 cm(Elevato al Cubo) di miscela
isopropanolo/acqua (3.2.3.) ad una velocita' di flusso di 10-30
cm(Elevato al Cubo)/minuto. La colonna di scambio e' ora pronta per
l'operazione.
Colonna di scambio anionico.
Versare 600 cm(Elevato al Cubo) di resina scambiatrice di anioni
(3.2.7.) in un becher di 3000 cm(Elevato al Cubo) e aggiungere 2000
cm(Elevato al Cubo) di acqua deionizzata; lasciar gonfiare la resina
per almeno due ore e trasferirla nella colonna mediante acqua
deionizzata. La colonna deve contenere un supporto di lana di vetro.
Lavare la colonna con una soluzione di bicarbonato di ammonio 0,3
M (3.2.5.) fino a completa eliminazione del cloruro. Questa
operazione richiede circa 5000 cm(Elevato al Cubo) di soluzione.
Lavare nuovamente con 2000 cm(Elevato al Cubo) di acqua deionizzata.
Spostare l'acqua con 2000 cm(Elevato al Cubo) di miscela
isopropanolo/acqua (3.2.3.) ad una velocita' di flusso di
10-30 cm(Elevato al Cubo)/minuto. La colonna scambiatrice e' ora in
forma OH e pronta per l'uso.
3.4.4. Metodo di scambio ionico.
Collegare le colonne scambiatrici in modo che la colonna
scambiatrice di cationi sia situata alla sommita' della colonna
scambiatrice di anioni. Riscaldare le colonne a 323 K (50 C) con
l'impiego di un termostato. Riscaldare 5000 cm(Elevato al Cubo) della
soluzione ottenuta al punto (3.4.2.) a 333 K (60 C) e filtrare la
soluzione attraverso la combinazione di scambiatori alla velocita' di
flusso di 20 cm(Elevato al Cubo)/minuto. Lavare le colonne con un
litro di miscela calda isopropanolo/acqua (3.2.3.).
Per ottenere i tensioattivi non ionici, raccogliere il filtrato e
i liquidi di filtrazione ed evaporare sino ad essiccazione
preferibilmente mediante un evaporatore rotante. Il residuo contiene
il BIAS. Aggiungere acqua deionizzata fino ad un volume determinato e
calcolare il tenore di BIAS in una frazione come indicato al
paragrafo 7.4. La soluzione viene impiegata come soluzione standard
di tensioattivi non ionici per la prova di biodegradabilita'.
Mantenere la soluzione ad un temperatura inferiore a 278 K (5 C).
Per ottenere i tensioattivi anionici (MBAS) disinserire la
collonna KAT. Con 5000 cm(Elevato al Cubo) di soluzione etanolo/CO2
riscaldata a 323 K (50 C) (3.2.4.) eluire gli acidi grassi dei
saponi dalla colonna AAT. Scartare l'eluato.
Eluire quindi le MBAS della colonna AAT con 5000 cm(Elevato al
Cubo) di soluzione di bicarbonato di ammonio (3.2.5.). Evaporare
l'eluato sino ad essiccazione su un bagno di vapore o in un
evaporatore rotante. Il residuo contiene MBAS (sotto forma di sali di
ammonio, da utilizzare nella prova di biodegradabilita') e gli
eventuali prodotti anionici non tensioattivi che non alterano la
prova di biodegradabilita'. Aggiungere acqua deionizzata sino ad un
volume determinato e calcolare il tenore di MBAS in una frazione come
indicato al paragrafo 6. La soluzione viene impiegata come soluzione
standard dei detergenti anionici per la prova di biodegradabilita'.
Mantenere la soluzione ad una temperatura inferiore a 278 K (5 C).
3.4.5. Rigenerazione delle resine scambiatrici.
Gettare lo scambiatore cationico dopo l'uso.
Rigenerare la resina scambiatrice di anioni facendo passare
un'ulteriore quantita' di soluzione di bicarbonato di ammonio
(3.2.5.) attraverso la colonna ad una velocita' di flusso
approssimativamente di 10 cm(Elevato al Cubo)/minuto sino a quando
l'eluato e' privo di tensioattivi anionici (prova al blu di
metilene). Lavare quindi lo scambiatore anionico facendovi passare
2000 cm(Elevato al Cubo) di miscela isopropanolo/acqua (3.2.3.). Lo
scambiatore anionico e' nuovamente pronto per l'uso.
4. PROVA DI BIODEGRADABILITA' CON IL METODO DI SCELTA (METODO
STATICO).
4.1. Campo di applicazione. Limiti del metodo.
La prova di biodegradabilita' con il presente metodo si effettua
sui tensioattivi anionici e non ionici come tali, oppure sui
tensioattivi anionici e non ionici isolati da formulazioni di
detersivi, operando secondo i procedimenti descritti al precedente
paragrafo 3.
Le sostanze chimiche presenti in soluzione o in aria, in grado di
inibire l'attivita' dei microrganismi, (come i composti fortemente
basici, i metalli tossici, i solventi organici, i prodotti
battericidi e gli stessi tensioattivi quando siano presenti ad una
concentrazione sufficientemente elevata) possono ostacolare i
processi di biodegradazione e pertanto influire sui risultati finali.
I composti alcalini ed altre sostanze presenti nei preparati per
lavare possono interferire sul valore del pH.
E' per i suddetti motivi che il metodo prescrive di lavorare in un
mezzo tamponato e su degli estratti purificati contenenti i
tensioattivi.
4.2. Principio del metodo.
Il metodo si basa sull'incubazione a 25 C della soluzione del
tensioattivo in esame con microorganismi aerobici.
Una quantita' determinata di tensioattivo o di prodotto
preliminarmente estratto corrispondente a 5 mg/l di sostanza attiva,
e' disciolta in una soluzione minerale (4.4.2.). Tale soluzione, dopo
aggiunta di una opportuna quantita' di microrganismi aerobici
rappresentativi di una popolazione mista, viene incubata a 25 (Piu'
o Meno) 1 C fino a che la concentrazione in sostanza attiva resti
approssimativamente costante.
L'efficacia del processo biologico e' controllata per mezzo di due
tensioattivi anionici di riferimento (paragrafo 4.5.).
4.3. Apparecchiatura.
4.3.1. Bicchieri da 100 cm(Elevato al Cubo).
4.3.2. Matracci tarati da 1000 cm(Elevato al Cubo).
4.3.3. Pipette tarate da 10 cm(Elevato al Cubo) e da 25 cm(Elevato al
Cubo).
4.3.4. Matracci di Erlenmeyer da 3000 cm(Elevato al Cubo) e 5000
cm(Elevato al Cubo).
4.3.5. Matracci di Erlenmeyer da 2000 cm(Elevato al Cubo) a collo
stretto.
4.3.6. Agitatore che permetta l'utilizzazione di matracci di
Erlenmeyer da 2000 cm(Elevato al Cubo) con regolazione della
temperatura; nel caso l'agitatore non abbia una propria regolazione
impiegare un bagno termostatico in grado di assicurare una tempertura
costante di 25 (Piu' o Meno) 1 C.
4.3.7. Cilindri graduati da 100 cm(Elevato al Cubo) e da 1000
cm(Elevato al Cubo).
4.3.8. Ovatta di cotone.
Tuttavia la vetreria deve essere accuratamente lavata prima
dell'uso con acqua distillata, risciacquata con alcool etilico ed
asciugata, al fine di evitare la contaminazione dovuta a residui di
saggi precedenti.
4.4. Reattivi.
4.4.1. Acqua deionizzata (o distillata) esente da sostanze tossiche
(specialmente rame).
4.4.2. Soluzione minerale.
Si prepara prelevando 1 cm(Elevato al Cubo) di ciascuna delle
seguenti quattro soluzioni (da "a" a "d") e portando il volume ad un
litro con acqua deionizzata o distillata:
(a) KH2PO4 p.a. 8,5g;
K2HPO4 p.a. 21,75g;
NA2HPO4. 2H2O p.a. 33,4g;
NH4Cl p.a. 1,7g.
Sciogliere e portare a 1000 cm(Elevato al Cubo) con acqua
deionizzata o distillata. Il pH di questa soluzione deve essere di
circa 7,2.
(b) MgSO4. 7H2O p.a. 22,5g disciolti in 1000 cm(Elevato al Cubo) di
acqua deionizzata o distillata.
(c) CaCl2 p.a. 27,5g disciolti in 1000 cm(Elevato al Cubo) di acqua
deionizzata o distillata.
(d) FeCl3. 6H2O p.a. 0,25g disciolti in 1000 cm(Elevato al Cubo) di
acqua deionizzata o distillata.
La soluzione minerale deve essere preparata immediatamente prima
dell'uso, in quantita' sufficiente (almeno 8 litri).
4.4.3. Soluzione di cloruro mercurico.
Soluzione di HgCl2 in acqua all'1%.
4.5. Tensioattivi di riferimento.
4.5.1. Tensioattivo biodegradabile.
Si impiega un alchilbenzensolfonato sodico lineare (del tipo
dodecilbenzensolfonato sodico). La biodegradabilita' di questo
prodotto, determinata con il presente metodo, deve essere compresa
tra il 90 ed il 95%, ottenuta nel periodo massimo di quattordici
giorni (solitamente tale risultato si ottiene gia' nei primi 7-10
giorni).
4.6. Inoculo.
In linea di principio puo' essere utilizzato qualsiasi veicolo
contenente microrganismi aerobici rappresentanti una popolazione
mista. La quantita' di inoculo necessaria per ottenere con i
tensioattivi di riferimento la biodegradabilita' indicata al
paragrafo 4.5 dipende principalmente, dall'attivita' biologica del
veicolo prescelto e quindi e' essenziale che l'attivita' dell'inoculo
sia determinata sperimentalmente quando il metodo e' utilizzato per
la prima volta o quando si apporta un qualunque cambiamento alla
natura dell'inoculo stesso. (A tale scopo, si studia il comportamento
dei due tensioattivi di riferimento per mezzo di saggi preliminari in
cui vengono impiegate quantita' variabili dell'inoculo scelto);
generalmente e' sufficente una quantita' di 0,5 cm(Elevato al Cubo)
di inoculo per litro di soluzione di prova. Si raccomanda di
confermare saltuariamente questi risultati, soprattutto se vengono
osservate delle variazioni che concernono la velocita' ed il tasso di
biodegradabilita' dei tensioattivi di riferimento.
4.6.1. Preparazione dell'inoculo.
L'inoculo sara' di preferenza realizzato per mezzo di un effluente
prelevato da un impianto di depurazione biologica efficiente che
tratti principalmente reflui di origine domestica. Tale effluente,
comunemente detto effluente secondario, deve essere mantenuto in
condizioni aerobiche durante il periodo precedente la sua
utilizzazione.
Si preleva il campione che va filtrato su filtro di carta soffice
a filtrazione rapida; si eliminano i primi 200 cm(Elevato al Cubo) di
filtrato; il rimanente e' mantenuto in aereazione fino al momento
dell'impiego. Questo inoculo deve essere utilizzato il giorno stesso
in cui e' stato prelevato.
4.7. Procedimento.
4.7.1. Preparazione dei campioni.
I tensioattivi sono esaminati tal quali dopo averne determinato il
contenuto in MBAS o BIAS; nel caso di prodotti formulati si procede
alla estrazione e separazione dei tensioattivi anionici e non ionici,
come indicato al paragrafo 3.4., e si determina il contenuto di MBAS
o di BIAS dell'estratto.
4.7.2. Biodegradabilita' dei tensioattivi anionici.
La determinazione della biodegradabilita' dei campioni in esame e
dei tensioattivi di riferimento (4.5.) viene effettuata
simultaneamente ed "in doppio". Si pesa in un bicchiere da 100
cm(Elevato al Cubo) un quantitativo di tensioattivo che, in base a
prove preliminari, corrisponda a circa 1 g di MBAS; si discioglie in
una piccola quantita' di acqua distillata, riscaldando eventualmente
a circa 60 C, si trasferisce quantitativamente in un matraccio
tarato da 1000 cm(Elevato al Cubo) e si porta a volume (soluzione
madre). A partire dalla soluzione madre si prepara in un matraccio da
3000 cm(Elevato al Cubo) un'altra soluzione (soluzione di prova M)
aggiungendo a 2000 cm(Elevato al Cubo) della soluzione minerale
(4.4.2.) 10 cm(Elevato al Cubo) di soluzione madre ed una quantita'
appropriata di inoculo, di solito 0,5 cm(Elevato al Cubo)/l. Si
omogeneizza cercando di evitare la formazione di schiuma. Si
prelevano quindi due aliquote della soluzione di prova M di 900
cm(Elevato al Cubo) e si travasano ciascuna in un matraccio di
Erlenmeyer da 2000 cm(Elevato al Cubo).
Si determina su ciascun matraccio il contenuto di MBAS; la media
dei due valori ottenuti, che deve essere compresa tra 4,5 e 5,5 mg
MBAS/l e arrotondata a 0,1 mg MBAS/l, costituisce la concentrazione
iniziale del tensioattivo (Co). Se la concentrazione non rientra nei
limiti suddetti si prepara una nuova soluzione prelevando, invece di
10 cm(Elevato al Cubo), un volume minore o maggiore di soluzione
madre.
Analogamente si procede per il tensioattivo standard
biodegradabile e per quello bioresistente, determinando per entrambi
la concentrazione media iniziale.
I sei matracci sono chiusi con cotone in modo da non impedire lo
scambio di aria tra il matraccio e l'atmosfera circostante e sono
messi in incubazione sotto agitazione alla temperatura di 25 (Piu' o
Meno) 1 C che deve essere mantenuta costante durante tutta la durata
del metodo; i matracci devono essere inoltre collocati al riparo
dalla luce diretta e l'ambiente deve essere sempre esente da sostanze
inquinanti e tossiche (solventi clorurati, ecc.).
Si ripete il dosaggio della MBAS di ciascun matraccio
(genericamente Ct) ed il calcolo della corrispondente percentuale
della degradazione (At) al quinto e all'ottavo giorno di incubazione
e successivamente ogni due giorni fino a che la differenza di
concentrazione riscontrata in due prelievi effettuati dallo stesso
matraccio alla distanza di quattro giorni risulti inferiore a 0,15 mg
MBAS/l. La concentrazione riscontrata al primo di tali prelievi viene
considerata la concentrazione finale (Ce) relativa a quel matraccio.
Si traccia la curva della percentuale di degradazione in funzione del
tempo (vedi figura 2); essa presenta un tratto orizzontale che ha
inizio in corrispondenza a Ce.
Il programma di prelievo potra' essere modificato facendo in modo
che si possa individuare con precisione il punto di flesso della
curva; in ogni caso la durata della prova non deve superare i
diciannove giorni.
Per i dosaggi si evitera' di effettuare dei prelievi troppo
consistenti: all'inizio del saggio sono sufficienti prelievi da 10 a
20 cm(Elevato al Cubo), il loro volume puo' essere aumentato fino a
100 cm(Elevato al Cubo) alla fine del saggio. In ogni caso i prelievi
vanno effettuati in assenza di schiuma e dopo accurata
omogeneizzazione.
Se i campioni prelevati non sono analizzati entro le tre ore suc-
cessive al prelievo, essi saranno conservati aggiungendovi 5
cm(Elevato al Cubo)/l della soluzione di cloruro mercurico (4.4.3.)
in modo da ottenere una concentrazione di 50 mg di HgCl2 per litro.
4.7.3. Biodegradabilita' dei tensioattivi non ionici.
La determinazione della biodegradabilita' dei campioni in esame e
dei tensioattivi anionici di riferimento (4.5.) viene effettuata
simultaneamente e "in doppio". Si pesa in un bicchiere da 100
cm(Elevato al Cubo) un quantitivo di tensioattivo che, in base a
prove preliminari, corrisponde a circa 1 g di BIAS; si discioglie in
una piccola quantita' di acqua distillata riscaldando eventualmente a
circa 60 C, si trasferisce quantitativamente in un matraccio tarato
da 1000 cm(Elevato al Cubo) e si porta a volume (soluzione madre). A
partire dalla soluzione madre si prepara un'altra soluzione
(soluzione di prova M) aggiungendo a 5000 cm(Elevato al Cubo) della
soluzione minerale (4.4.2.) 25 cm(Elevato al Cubo) della soluzione
madre e la quantita' appropriata di inoculo, di solito 0,5 cm(Elevato
al Cubo)/l. Si omogeneizza cercando di evitare la formazione di
schiuma, e si esegue, in doppio, la determinazione del contenuto di
BIAS. La media dei due valori ottenuti, che deve essere compresa tra
4,5 e 5,5 mg di BIAS/l e deve essere arrotondata a 0,1 mg BIAS/l,
viene considerata come la concentrazione iniziale Co del tensioattivo
campione.
Per quanto riguarda i due tensioattivi anionici di riferimento si
prepara per ciascuno di essi la soluzione madre contenente 1 g/l di
MBAS e quindi la soluzione di prova aggiungendo, in un matraccio da
3000 cm(Elevato al Cubo), a 2000 cm(Elevato al Cubo) della soluzione
minerale 10 cm(Elevato al Cubo) della soluzione madre e la quantita'
appropriata di inoculo; su entrambe le soluzioni di prova si esegue,
in doppio, la determinazione del contenuto di MBAS; le medie dei due
valori ottenuti per ciascun tensioattivo di riferimento, che devono
essere comprese fra 4,5 e 5,5 mg di MBAS/l, vengono considerate come
concentrazioni iniziali dei tensioattivi di riferimento.
In quattro matracci di Erlenmeyer da 2000 cm(Elevato al Cubo) di
introducono 1200 cm(Elevato al Cubo), per ciascuno, della soluzione
di prova M contenente il tensioattivo non ionico; in due matracci si
introducono 900 cm(Elevato al Cubo), per ciascuno, della soluzione di
prova dello standard biodegradabile; in altri due matracci si
introducono 900 cm(Elevato al Cubo) dello standard bioresistente.
Gli otto matracci sono chiusi con del cotone, in modo da non
impedire lo scambio d'aria con l'atmosfera circostante, e messi poi
in incubazione sull'agitatore a 25 C (Piu' o Meno) 1 C, temperatura
che deve essere mantenuta costante durante tutta la durata del
saggio. I matracci devono essere inoltre al riparo dalla luce diretta
e l'ambiente deve essere sempre esente da sostanze inquinanti e
tossiche (solventi clorurati, ecc.).
Si ripete il dosaggio di BIAS per i tensioattivi non ionici al 5
e al 19 giorno di incubazione su una miscela ottenuta prelevando
volumi uguali dai due matracci: il volume della miscela sara' di 400
cm(Elevato al Cubo) (200 cm(Elevato al Cubo) da ciascun matraccio)
per il dosaggio del quinto giorno, e di 1000 cm(Elevato al Cubo) (500
cm(Elevato al Cubo) da ciascun matraccio) per il dosaggio del
diciannovesimo giorno.
Questa procedura permette di determinare tassi di biodegradabilita'
dell'ordine del 95%; nei casi di sostanze aventi un tasso di
biodegradabilita' inferiore all'80% il volume prelevato potrebbe
essere ridotto (600 cm(Elevato al Cubo)).
Per i tensioattivi di riferimento, si ripete il dosaggio di MBAS
seguendo la procedura indicata per i tensioattivi anionici (4.7.2.).
Tutti i prelievi vanno effettuati previa eliminazione della
schiuma ed accurata omogeneizzazione delle soluzioni.
Se i campioni non sono analizzati entro le tre ore seguenti il
prelievo, saranno conservati aggiungendovi 5 cm(Elevato al Cubo)/l
della soluzione di cloruro mercurico (4.4.3.), in modo da ottenere
una concentrazione di 50 mg di HgCl2 per litro.
4.8. Espressione dei risultati.
La percentuale di degradazione del campione (A) e la percentuale
di degradazione dei tensioattivi di riferimento (As) sono calcolati
applicando la seguente formula:
Co - Ct
At = -------- .100
Co
dove:
At = percentuale di degradazione al tempo t;
Co = concentrazione iniziale media, espressa in mg MBAS/l o mg
BIAS/l;
Ct = concentrazione al tempo t, espressa in mg MBAS/l o mg
BIAS/l.
Il tasso di biodegradabilita' (A) del campione e' la media
aritmetica delle due percentuali di degradazione Ae corrispondenti
alle due concentrazioni finali Ce per esso determinate.
Nel caso di tensioattivi anionici Ce e' la concentrazione definita
al paragrafo 4.7.2., corrispondente all'inizio del tratto orizzontale
della curva di biodegradazione. Per i prodotti che non presentano un
tratto orizzontale nella suddetta curva Ce e' la concentrazione
ottenuta alla fine del metodo, cioe' al 19 giorno.
Nel caso di tensioattivi non ionici Ce e' la concentrazione
ottenuta al 19 giorno; il dosaggio effettuato al 5 giorno serve a
verificare che la degradazione si effettui ad una velocita'
soddisfacente.
I risultati sono calcolati allo 0,1% circa ed il valore dei tassi
di biodegradabilita' e' arrotondato all'unita' (i risultati
corrispondenti a 0,5 sono arrotondati all'unita' inferiore).
4.9. Validazione dei risultati.
I risultati sono validi se il tasso di biodegradabilita' del
tensioattivo di riferimento biodegradabile, calcolato secondo le
condizioni definite al paragrafo 4.7., e' compreso tra il 90 e il 95%
durante un periodo di 14 giorni (in generale e' necessario un periodo
fra i sette e i dieci gioni), e se il tensioattivo di riferimento
bioresistente non e' degradato a piu' del 35% circa.
Se queste condizioni non sono soddisfatte e' necessario ripetere
le prove.
4.10. Tollerenza del metodo.
Fermo restando che la biodegradabilita' media di ciascuna
categoria di tensioattivi contenuta nel detergente deve essere non
inferiore al 90%, tuttavia, tenuto conto dell'incertezza del metodo
analitico, i tensioattivi anionici e non ionici sono considerati
rispondenti alla normativa vigente se il valore del tasso di
biodegradabilita' determinato con il presente metodo non risulta
comunque inferiore all'80%.
5. PROVA DI BIODEGRADABILITA' CON IL METODO DI CONFERMA (METODO
DINAMICO).
Il metodo di conferma e' basato sulla riproduzione delle
condizioni esistenti in una stazione di depurazione biologica di
acque di scarico.
5.1. Apparecchiatura.
Piccolo impianto di fanghi attivi, schematizzato nella figura 3 e
descritto in modo piu' particolareggiato nella figura 4, composto da:
un recipiente di alimentazione A contenente l'effluente
sintetico;
una pompa dosatrice B;
un serbatoio di aerazione C, contenente, in cima al cono interno,
un setto poroso in vetro G, destinato all'aerazione;
un sedimentatore D;
una pompa ad aria compressa E per riciclare i fanghi attivi;
un recipiente F per la raccolta dell'effluente trattato;
un flussimetro H per la misura della quantita' di aria immessa
dal dispositivo di aerazione.
I recipienti A ed F devono essere di vetro o di un idoneo
materiale plastico trasparente ed avere una capacita' di almeno
ventiquattro litri. La pompa B alimentera' regolarmente di effluente
sintetico il serbatoio d'aerazione, che, in condizioni di
funzionamento normale, conterra' tre litri della miscela.
5.2. Effluente sintetico.
Per effettuare questa prova preparare l'effluente sintetico, nella
quantita' richiesta giornalmente (almeno 30 litri per il primo giorno
e 24 litri per i giorni successivi), sciogliendo per ogni litro di
acqua potabile, esente da cloro, le seguenti sostanze:
160 mg di peptone, per batteriologia;
110 mg di estratto di carne, per batteriologia;
30 mg di urea (CO(NH2)2), pura per analisi;
7 mg di cloruro di sodio (NaCl), puro per analisi;
4 mg di cloruro di calcio (CaCl2.2H2O) puro per analisi;
2 mg di solfato di magnesio (MgSO4.7H2O) puro per analisi;
28 mg di fosfato bipotassico (K2HPO4), puro per analisi;
tensioattivo in esame corrispondente a 20(Piu' o Meno)2 mg di
MBAS o 10(Piu' o Meno)1 mg di BIAS.
L'effluente sintetico va rinnovato ogni giorno; inoltre,
immediatamente prima dell'uso, e' opportuno determinarne il contenuto
in MBAS o BIAS (in mg/l).
5.3. Preparazione dei campioni.
I tensioattivi anionici e non ionici possono essere esaminati tal
quali. Si procede alla determinazione in essi del contenuto di MBAS o
BIAS per poter preparare l'effluente sintetico (5.2.).
Nel caso di prodotti formulati si procede alla estrazione e
separazione dei tensioattivi anionici e non ionici, come indicato al
paragrafo 3.4., quindi si determina il contenuto di MBAS o BIAS
dell'estratto per poter preparare l'effluente sintetico (5.2.).
5.4. Funzionamento dell'impianto.
Riempire anzitutto il serbatoio d'aerazione C e il sedimentatore D
con effluente sintetico. Fissare il sedimentatore D ad un'altezza
tale che il volume di liquido nel serbatoio d'aerazione C sia di
circa tre litri. Immettere nel serbatoio di aerazione C 3 cm(Elevato
al Cubo) di inoculo, preparato come indicato al paragrafo 4.6.
Iniziare quindi l'immissione di aria attraverso il flussimetro H e il
setto poroso G; azionare la pompa ad aria compressa E e la pompa
dosatrice B, regolata per la portata di 1 litro/ora, cosi' che
l'effluente sintetico passa nel serbatoio d'aerazione C permanendovi
circa tre ore.
Regolare il ritmo di aerazione in modo che il contenuto del
serbatoio C si mantenga costantemente in sospensione e che il tenore
di ossigeno disciolto sia almeno di 2 mg/l. Impedire la formazione di
schiuma con mezzi adeguati; astenersi pero' dall'usare agenti
antischiuma che esercitino un'azione inibitrice sui fanghi attivi o
che contengano MBAS o BIAS. Regolare la pompa E in modo che nel
serbatoio di aerazione C la rimessa in circolazione dei fanghi attivi
provenienti dal sedimentatore D sia continua e regolare. Rimettere in
circolazione almeno una volta al giorno, mediante spazzolatura o con
qualsiasi altro mezzo idoneo i fanghi accumulatisi sui bordi del
serbatoio di aerazione C, nel fondo del sedimentatore D, o nel
circuito di circolazione. Se il fango non decanta favorirne la
sedimentazione aggiungendo, ripetutamente se necessario, 2 cm(Elevato
al Cubo) di una soluzione al 5% di cloruro ferrico.
Raccogliere per 24 ore nel serbatoio F l'effluente uscente dal
sedimentatore D; dopo tale periodo omogeneizzare l'effluente raccolto
e prelevarne un campione per la determinazione della concentrazione
di MBAS o BIAS, con un'approssimazione di 0,1 mg/l. (La
determinazione va effettuata subito dopo il prelievo; se cio' non e'
possibile il campione va conservato preferibilmente per
congelamento). Eliminare il resto dell'effluente e pulire quindi
accuratamente il serbatoio F.
Continuare la prova immettendo nel serbatoio A altri 24 litri di
effluente sintetico preparato di fresco, assicurandosi che non si
verifichino interruzioni nell'alimentazione dell'impianto. Procedere
cosi' per almeno 21 giorni dopo il periodo iniziale (vedi fig. 5),
effettuando ogni 24 ore l'analisi dell'effluente trattato.
5.5. Controllo del funzionamento del processo.
Per controllare il buon funzionamento del processo, misurare
almeno due volte alla settimana il COD (domanda chimica di ossigeno)
o il DOC (carbonio organico disciolto) dell'effluente sintetico
trattato (cioe' quello accumulatosi nel serbatoio F) e dell'effluente
sintetico prima del trattamento (cioe' quello contenuto nel serbatoio
A). I campioni prelevati da A e da F vanno preventivamente filtrati
attraverso fibre di vetro. La diminuzione del COD e del DOC si
stabilizza quando la degradazione quotidiana del tensioattivo e'
regolare, vale a dire alla fine del periodo iniziale indicato nella
figura 5.
Ugualmente determinare due volte alla settimana il tenore, in g/l,
di sostanza secca in sospensione nei fanghi attivi raccolti nel
serbatoio di aerazione. Se tale valore supera i 2,5 g/l, eliminare
l'eccesso di fanghi attivi.
Eseguire la prova di biodegradabilita' a temperatura ambiente;
tale temperatura deve essere costante e mantenuta tra 292 K e 297 K
(19 - 24 C).
5.6. Calcolo della biodegradabilita'.
Calcolare ogni giorno la percentuale di biodegradazione A delle
MBAS o del BIAS, con una approssimazione dello 0,1%, secondo la for-
mula:
Co - Ct
At = -------- .100
Co
dove:
At = percentuale di biodegradazione al tempo t;
Co = concentrazione, in mg/l, di MBAS o BIAS dell'effluente
sintetico prima del trattamento (serbatoio A);
Ct = concentrazione, in mg/l, di MBAS o BIAS dell'effluente
sintetico dopo il trattamento (serbatoio F).
Riportare in grafico i valori di biodegradazione ottenuti in
funzione del tempo, come nella figura 5.
Si assume come "biodegradabilita'" del tensioattivo in esame la
media aritmetica dei valori di biodegradazione ottenuti in 21 giorni
consecutivi, successivi al periodo iniziale di assestamento,
facilmente definibile sul grafico. Durante tale periodo la
biodegradazione deve essere stata regolare e l'impianto deve aver
funzionato senza inconvenienti. In nessun caso la durata del periodo
iniziale dovra' superare le sei settimane.
In alcuni casi la frequenza dei prelievi puo' essere ridotta, per
esempio un prelievo ogni due o tre giorni; per calcolare la
biodegradabilita' utilizzare pero' i risultati di almeno 14 prelievi
quotidiani distribuiti nel periodo di 21 giorni che fa seguito al
periodo iniziale.
6. DOSAGGIO DEI TENSIOATTIVI ANIONICI NELLA PROVA DI
BIODEGRADABILITA'.
6.1. Principio.
La concentrazione dei tensioattivi anionici viene determinata con
il metodo colorimetrico al blu di metilene, basato sul fatto che il
blu di metilene (colorante cationico) forma con i tensioattivi
anionici dei sali blu, estraibili mediante cloroformio; essa e'
espressa in mg/litro di MBAS (methylene blue active substance =
sostanza attiva al blu di metilene).
Per eliminare eventuali interferenze, l'estrazione viene
effettuata dapprima mediante una soluzione alcalina e l'estratto
viene quindi trattato con una soluzione acida al blu di metilene.
L'assorbimento della fase organica viene misurato fotometricamente
alla lunghezza d'onda di assorbimento massimo, pari a 650 nm.
6.2. Reattivi.
6.2.1. Soluzione tampone pH 10: disciogliere 24 g di bicarbonato di
sodio (NaHCO3) p.a. e 27 g di carbonato di sodio anidro (Na2CO3) p.a.
in acqua deionizzata e diluire a 1000 cm(Elevato al Cubo).
6.2.2. Soluzione neutra al blu di metilene: disciogliere 0,35 g di
blu di metilene p.a. in acqua deionizzata e diluire a 1000 cm(Elevato
al Cubo). Preparare la soluzione almeno ventiquattro ore prima
dell'uso. L'assorbimento della fase cloroformica della prova in
bianco, misurato contro cloroformio puro, non deve superare 0,015
impiegando una cella con un cammino ottico di 1 cm a 650 nm.
6.2.3. Soluzione acida al blu di metilene: disciogliere 0,35 g di blu
di metilene p.a. in 500 cm(Elevato al Cubo) di acqua deionizzata e
mescolare con 6,5 cm(Elevato al Cubo) di H2SO4 (d = 1,84 g/cm(Elevato
al Cubo)). Diluire a 1000 cm(Elevato al Cubo) con acqua deionizzata.
Preparare la soluzione almeno ventiquattro ore prima dell'uso.
L'assorbimento della fase cloroformica della prova in bianco,
misurato contro cloroformio puro, non deve superare 0,015 impiegando
una cella con un cammino ottico di 1 cm a 650 nm.
6.2.4. Cloroformio (triclorometano) CHCl3 p.a., di recente
distillazione.
6.2.5. Estere metilico dell'acido dodecilbenzensolfonico.
6.2.6. Soluzione etanolica di idrossido di potassio, KOH 0,1 M.
6.2.7. Etanolo puro, C2H5OH.
6.2.8. Acido solforico, H2SO4 0,5 M.
6.2.9. Soluzione di fenolftaleina: sciogliere un grammo di
fenolftaleina in 50 cm(Elevato al Cubo) di etanolo e aggiungere 50
cm(Elevato al Cubo) di acqua deionizzata agitando continuamente.
Eliminare mediante filtrazione l'eventuale precipitato ottenuto.
6.2.10. Soluzione metanolica di acido cloridrico: diluire 250
cm(Elevato al Cubo) di acido cloridrico concentrato p.a. e 750
cm(Elevato al Cubo) di metanolo.
6.3. Apparecchiatura.
6.3.1. Imbuto separatore da 250 cm(Elevato al Cubo).
6.3.2. Matraccio tarato da 50 cm(Elevato al Cubo).
6.3.3. Matraccio tarato da 500 cm(Elevato al Cubo).
6.3.4. Matraccio tarato da 1000 cm(Elevato al Cubo).
6.3.5. Pallone a fondo tondo con tappo conico di vetro smerigliato e
condensatore a riflusso da 250 cm(Elevato al Cubo); granuli per
facilitare l'ebollizione.
6.3.6. pH-metro.
6.3.7. Fotometro per misurazioni a 650 nm, con celle da 1-5 cm.
6.3.8. Carta da filtro qualitativa.
Dopo accurato lavaggio con acqua, la vetreria utilizzata per
l'analisi deve essere risciacquata a fondo, prima dell'uso, con
soluzione metanolica di acido cloridrico (6.2.10.) e quindi con acqua
deionizzata.
6.4. Taratura.
6.4.1. Soluzione concentrata di MBAS a titolo noto.
Si prepara una soluzione concentrata di tensioattivo a titolo noto
usando l'estere metilico dell'acido dodecilbenzensolfonico (tipo
tetrapropilene PM 340) dopo saponificazione a sale di potassio. La
MBAS e' calcolata come dodecilbenzensolfonato di sodio (PM = 348).
Pesare da 400 a 450 mg di estere metilico dell'acido
dedecilbenzensolfonico (6.2.5.), con un'approssimazione di 0,1 mg, in
un pallone a fondo tondo ed aggiungere 50 cm(Elevato al Cubo) di
soluzione etanolica di idrossido di potassio (6.2.6) ed alcuni
granuli di pomice per facilitare l'ebollizione. Dopo avere montato il
condensatore a riflusso, far bollire per un'ora. Raffreddare e lavare
il condensatore ed il giunto di vetro smerigliato con circa 30
cm(Elevato al Cubo) (Elevato al Cubo)di etanolo, ed aggiungere queste
acque di lavaggio alla soluzione contenuta nel pallone. Neutralizzare
la soluzione risultante con acido solforico 0,5 M in presenza di
fenolftaleina fino a scomparsa della colorazione. Trasferire questa
soluzione in un matraccio tarato da 1000 cm(Elevato al Cubo)
(6.3.4.), portare a volume con acqua deionizzata e mescolare.
6.4.2. Soluzione "standard" di MBAS a titolo noto.
Prelevare esattamente 25 cm(Elevato al Cubo) della soluzione
concentrata di MBAS, trasferirla in un matraccio da 500 cm(Elevato al
Cubo) (Elevato al Cubo)(6.3.3.) e portare a volume con acqua
deionizzata, quindi mescolare.
Questa soluzione standard contiene:
E. 1,023
--------- . mg di MBAS per cm(Elevato al Cubo)
20.000
dove:
E = e' il peso in mg dell'estere metilico dell'acido
dodecilbenzensolfonico (PM = 340), prelevato per la saponificazione;
MBAS = e' espressa come dodecilbenzensolfonato di sodio (PM 348);
1,023 = e' il rapporto 348/340.
6.4.3. Curva di taratura.
Per costruire la curva di taratura, prelevare frazioni di 1, 2, 4,
6, 8 cm(Elevato al Cubo) della soluzione standard e diluire ciascuna
di queste frazioni fino a 100 cm(Elevato al Cubo) con acqua
deionizzata. Introdurre le frazioni in una serie di imbuti separatori
da 250 cm(Elevato al Cubo) e aggiungere in ciascuno di essi 10
cm(Elevato al Cubo) di soluzione tampone (6.2.1.), 5 cm(Elevato al
Cubo) di soluzione neutra al blu di metilene (6.2.2.) e 15 cm(Elevato
al Cubo) di cloroformio (6.2.4.). Agitare uniformemente la miscela,
ma non troppo energicamente, per un minuto e lasciare stratificare;
dopo la separazione delle fasi, versare lo strato di cloroformio in
una seconda serie di imbuti separatori contenenti 110 cm(Elevato al
Cubo) di acqua deionizzata e 5 cm(Elevato al Cubo) di soluzione acida
al blu di metilene (6.2.3.). Agitare la miscela per un minuto e
lasciare stratificare. Filtrare le fasi cloroformiche in matracci
tarati da 50 cm(Elevato al Cubo) (6.3.2.) attraverso filtri di ovatta
idrofila previamente trattati con alcol e inumiditi di cloroformio.
Estrarre le soluzioni alcaline e acide tre volte, utilizzando 10
cm(Elevato al Cubo) di cloroformio per la seconda e la terza
estrazione. Filtrare gli estratti cloroformici attraverso gli stessi
filtri di ovatta idrofila nei rispettivi matracci da 50 cm(Elevato al
Cubo). Questi vengono portati a volume con il cloroformio utilizzato
per il lavaggio dei filtri di ovatta idrofila.
Misurare con un fotometro l'assorbimento della soluzione
cloroformica a 650 nm in cellette da 1-5 cm, rispetto al cloroformio
puro.
Effettuare una determinazione del bianco ottenuto operando nelle
stesse condizioni in una prova condotta parallelamente in assenza
della sostanza di riferimento.
Riportare in grafico i valori dell'assorbimento delle soluzioni
(in ordinata) in funzione delle loro concentrazioni (in ascissa).
6.5. Procedimento.
Si introduce in un imbuto separatore da 250 cm(Elevato al Cubo)
(6.3.1.) la soluzione del campione da analizzare. (Nel caso di
prelievo dall'impianto a fanghi attivi filtrare l'affluente e
l'effluente immediatamente dopo la campionatura, scartando i primi
100 cm(Elevato al Cubo) del filtrato).
Il volume di soluzione da prelevare e' di 5-50 cm(Elevato al Cubo)
se il contenuto presunto di tensioattivo nel campione va da 20 a 1
mg/l MBAS, di 50-100 cm(Elevato al Cubo) se il contenuto presunto di
tensioattivo e' inferiore. Se il volume di soluzione prelevato e'
inferiore a 100 cm(Elevato al Cubo) diluire a 100 cm(Elevato al Cubo)
con acqua deionizzata.
Aggiungere al campione 10 cm(Elevato al Cubo) di soluzione tampone
(6.2.1.), 5 cm(Elevato al Cubo) di soluzione neutra al blu di
metilene (6.2.2.) e 15 cm(Elevato al Cubo) di cloroformio (6.2.4.) e
procedere come indicato al paragrafo 6.4.3., fino alla misura
dell'assorbimento a 650 nm.
6.6. Calcolo dei risultati.
Dalla misura dell'assorbimento della soluzione del campione in
esame e dalla curva di taratura si risale ai mg di MBAS contenuti nel
volume prelevato e di qui alla concentrazione di MBAS in mg/l della
soluzione in esame secondo la formula:
m x 1.000
MBAS mg/l = -----------
V
dove:
V = volume in cm(Elevato al Cubo) (Elevato al Cubo)della soluzione
del campione impiegata per l'analisi;
m = mg di tensioattivo contenuti nel volume V, desunti dalla curva
di taratura.
6.7. Espressione dei risultati.
Esprimere i risultati come MBAS (mg/1) con un'approssimazione
dello 0,1.
7. DOSAGGIO DEI TENSIOATTIVI NON IONICI NELLA PROVA DI
BIODEGRADABILITA'.
7.1. Principio.
La concentrazione dei tensioattivi non ionici viene determinata
con il metodo di Wickbold, basato sulla formazione da parte di tali
tensioattivi di un precipitato con il tetraiodiobismutato di bario;
essa e' espressa in mg/l di BIAS (= sostanza attiva allo
iodiobismutato).
Il metodo si applica ai tensioattivi non ionici che contengono da
6 a 30 gruppi di ossido di etilene.
I tensioattivi sono concentrati e isolati dal campione mediante
"stripping" gassoso; il tensioattivo cosi' estratto e' quindi
disciolto in acetato di etile. Dopo separazione delle fasi ed
evaporazione del solvente, il tensioattivo non ionico viene
precipitato in soluzione acquosa con il reattivo di Dragendorff
modificato (KBiIfB0124 + BaClfB0122 + acido acetico glaciale). Il
precipitato viene filtrato, lavato con acido acetico glaciale e
sciolto in una soluzione di tartrato di ammonio. Si titola quindi
potenziometricamente il bismuto presente nella soluzione con una
soluzione di pirrolidinditiocarbammato a pH 4-5, usando un elettrodo
indicatore al platino brillante ed un elettrodo di riferimento al
calomelano oppure ad argento/cloruro di argento.
7.2. Reattivi.
I reattivi devono essere preparati in acqua deionizzata.
7.2.1. Acetato di etile, puro e di recente distillazione.
7.2.2. Bicarbonato di sodio (NaHCO3) p.a.
7.2.3. Acido cloridrico (HCl) diluito (20 cm(Elevato al Cubo) di
acido cloridrico concentrato p.a. diluito a 1000 cm(Elevato al Cubo)
con acqua).
7.2.4. Metanolo p.a. di recente distillazione, tenuto in bottiglia di
vetro.
7.2.5. Porpora di bromocresolo (0,1 g in 100 cm(Elevato al Cubo) di
metanolo).
7.2.6. Agente precipitante: l'agente precipitante e' costituito da
una miscela di due volumi di soluzione A e un volume di soluzione B.
La miscela e' raccolta in una bottiglia scura e puo' essere usata
sino ad una settimana dopo la sua preparazione.
7.2.6.1. Soluzione A: sciogliere 1,7 g di nitrato basico di bismuto
p.a. (BiO . NO3 H2O) in 20 cm(Elevato al Cubo) di acido acetico
glaciale e portare con acqua ad un volume di 100 cm(Elevato al Cubo).
Sciogliere quindi 65 g di ioduro di potassio p.a. in 200 cm(Elevato
al Cubo) di acqua. Mescolare le due soluzioni in un matraccio tarato
da 1000 cm(Elevato al Cubo), aggiungere 200 cm(Elevato al Cubo) di
acido acetico glaciale (7.2.7.) e portare a 1000 cm(Elevato al Cubo)
con acqua.
7.2.6.2. Soluzione B: sciogliere 290 g di cloruro di bario (BaCl2 .
2H2O) p.a. in acqua distillata; trasferire in matraccio da 1000
cm(Elevato al Cubo) e portare a volume.
7.2.7. Acido acetico glaciale 99-100% (concentrazioni inferiori sono
inadeguate).
7.2.8. Soluzione di tartrato di ammonio: mescolare 12,4 g di acido
tartarico p.a. con 12,4 cm(Elevato al Cubo) di ammoniaca p.a. (d =
0,910 g/cm(Elevato al Cubo)) e portare a 1000 cm(Elevato al Cubo) con
acqua (oppure usare la quantita' equivalente di tartrato di ammonio
p.a.).
7.2.9. Soluzione di ammoniaca diluita: 40 cm(Elevato al Cubo) di
ammoniaca p.a. (d = 0,910 g/cm(Elevato al Cubo)) portati a 1000
cm(Elevato al Cubo) con acqua.
7.2.10. Soluzione tampone standard all'acetato: sciogliere 40 g di
idrossido di sodio p.a. in 500 cm(Elevato al Cubo) di acqua in un
becher e fare raffreddare. Aggiungere 120 cm(Elevato al Cubo) di
acido acetico glaciale (7.2.7.). Mescolare energicamente, far
raffreddare, trasferire in un pallone tarato da 1000 cm(Elevato al
Cubo) e portare a volume aggiungendo acqua.
7.2.11. Soluzione di pirrolidinditiocarbammato ("soluzione di
carbato"): sciogliere 103 mg di pirrolidinditiocarbammato sodico
(C5H8NNaS2 . 2H2O) in 500 cm(Elevato al Cubo) circa di acqua,
aggiungere 10 cm(Elevato al Cubo) di alcole n-amilico p.a. e 0,5 di
NaHCO3 p.a., e portare a 1000 cm(Elevato al Cubo) con acqua.
7.2.12. Soluzione di solfato di rame (per standardizzazione della
soluzione di cui al punto 7.2.11.).
Soluzione concentrata: mescolare 1,249 g di solfato di rame p.a.
(CuSO4 . 5H2O) con 50 cm(Elevato al Cubo) di acido solforico 0,5 M e
portare a 1000 cm(Elevato al Cubo) con acqua.
Soluzione standard: mescolare 50 cm(Elevato al Cubo) di soluzione
concentrata con 10 cm(Elevato al Cubo) di H2SO4 0,5 M e portare a
1000 cm(Elevato al Cubo) con acqua.
7.2.13. Cloruro di sodio p.a.
7.3. Apparecchiatura.
7.3.1. Apparecchiatura per "stripping" gassoso (vedi figura 6).
Il diametro del disco sinterizzato deve essere identico a quello del
diametro interno del cilindro.
7.3.2. Imbuto separatore da 250 cm(Elevato al Cubo).
7.3.3. Agitatore magnetico con magnete 25-30 mm.
7.3.4. Crogiolo di Gooch, diametro della base perforata: 25 mm, tipo
G 4.
7.3.5. Filtri circolari in fibra di vetro, aventi un diametro di 27
mm, con diametro delle fibre di 0,5-1,5 (Micron(m.
7.3.6. Due beute per filtrazione a vuoto con adattatori e anelli di
gomma, rispettivamente di 500 cm(Elevato al Cubo) e 250 cm(Elevato al
Cubo).
7.3.7. Potenziometro registratore, munito di un elettrodo indicatore
al platino e di un elettrodo di riferimento al calomelano oppure ad
argento/cloruro di argento con una gamma di misura di 250 mV, con
buretta automatica della capacita' di 20-25 cm(Elevato al Cubo). In
alternativa puo' essere usato un dispositivo manuale analogo.
7.4. Metodo.
7.4.1. Concentrazione e separazione del tensioattivo.
Filtrare la soluzione contenente il campione attraverso una carta
da filtro per analisi qualitativa. Eliminare i primi 100 cm(Elevato
al Cubo) del filtrato.
Introdurre nell'apparecchio di "stripping", precedentemente
risciacquato con acetato di etile, un volume misurato di soluzione
tale da contenere 250-800 (Micron g di tensioattivo non ionico. Per
migliorare la separazione, aggiungere nell'apparecchio di stripping
100 g di cloruro di sodio e 5 g di bicarbonato di sodio,
preventivamente disciolti in 400 cm(Elevato al Cubo) di acqua; se
pero' il volume del campione supera i 500 cm(Elevato al Cubo),
aggiungere questi sali in forma solida all'apparecchio di "stripping"
e scioglierli facendovi passare dell'azoto o dell'aria.
Aggiungere acqua per portare il livello sino al rubinetto
superiore di scarico.
Aggiungere con cautela 100 cm(Elevato al Cubo) di acetato di etile
alla superficie della fase acquosa; con acetato di etile riempire
anche per due terzi il flacone di lavaggio del gas (azoto o aria).
Far passare attraverso l'apparecchio una corrente gassosa di 30-60
l/h; si raccomanda di usare un rotametro. La portata del gas deve
essere aumentata gradatamente all'inizio e deve essere regolata in
modo che le fasi rimangano chiaramente separate per ridurre al minimo
la miscelazione tra di esse e la dissoluzione dell'acetato di etile
nell'acqua. Arrestare il flusso di gas dopo cinque minuti.
Qualora la fase organica si disciolga in acqua in percentuale
superiore al 20%, l'operazione va ripetuta regolando con maggiore
attenzione il flusso del gas.
Raccogliere la fase organica in un imbuto separatore e
reintrodurre nell'apparecchio di "stripping" l'eventuale fase acquosa
presente nell'imbuto separatore (dovrebbero essere solo pochi
centimetri cubici). Filtrare la fase organica di acetato di etile
attraverso una carta asciutta da filtro per analisi qualitativa in un
becher da 250 cm(Elevato al Cubo).
Effettuare una seconda estrazione rimettendo altri 100 cm(Elevato
al Cubo) di acetato di etile nell'apparecchio di "stripping" e
facendovi nuovamente scorrere azoto o aria per cinque minuti.
Raccogliere la fase organica nell'imbuto separatore usato per la
prima separazione, scartare la fase acquosa e far passare la fase
organica attraverso lo stesso filtro usato per la prima porzione di
acetato di etile. Sciacquare l'imbuto separatore ed il filtro con 20
cm(Elevato al Cubo) circa di acetato di etile, che si aggiunge agli
estratti.
Evaporare l'estratto di acetato di etile sino ad essiccazione
completa, su bagnomaria (sotto cappa). Dirigere una leggera corrente
d'aria sulla superficie della soluzione per accelerare
l'evaporazione.
7.4.2. Precipitazione e filtrazione.
Riprendere il residuo secco di cui al punto 7.4.1. con 5
cm(Elevato al Cubo) di metanolo, aggiungere 40 cm(Elevato al Cubo) di
acqua e 0,5 cm(Elevato al Cubo) di acido cloridrico diluito (7.2.3.);
agitare quindi la soluzione con un agitatore magnetico.
Aggiungere a questa soluzione 30 cm(Elevato al Cubo) di agente
precipitante (7.2.6.) con un cilindro graduato. Il precipitato si
forma dopo ripetuta agitazione. Agitare per dieci minuti e lasciare
quindi la miscela a riposo per almeno cinque minuti.
Filtrare la miscela attraverso un crogiolo di Gooch, la cui base
sia costituita da un filtro di fibra di vetro. Lavare quindi il
filtro sotto aspirazione con circa 2 cm(Elevato al Cubo) di acido
acetico glaciale.
Lavare poi a fondo il becher, il magnete ed il crogliolo con 40 o
50 cm(Elevato al Cubo) di acido acetico glaciale. Non e' necessario
trasferire quantitativamente nel filtro il precipitato che aderisce
alle pareti del becher in quanto la titolazione viene effettuata
nello stesso recipiente.
7.4.3. Dissoluzione del precipitato.
Montare il crogiolo filtrante sulla beuta da vuoto da 250
cm(Elevato al Cubo). Sciogliere il precipitato nel crogiolo
aggiungendo tre porzioni separate di dieci cm(Elevato al Cubo)
ciascuna di una soluzione calda (circa 353 K - 80 C) di tartrato di
ammonio (7.2.8.). Lasciare a riposo ciascuna porzione nel crogiolo
per aluni minuti prima di filtrarla nella beuta da vuoto.
Mettere il contenuto della beuta nel becher usato per la
precipitazione. Sciacquare le pareti del becher con altri 20
cm(Elevato al Cubo) di soluzione di tartrato per sciogliere i residui
del precipitato.
Lavare accuratamente il crogiolo, l'adattatore e la beuta per
filtrazione con 150-200 cm(Elevato al Cubo) di acqua e raccogliere
l'acqua di lavaggio nel becher usato per la precipitazione.
7.4.4. Titolazione.
Aggiungere alcune gocce di porpora di bromocresolo (7.2.5.),
azionare un agitatore magnetico (7.3.3.), aggiungere la soluzione di
ammoniaca diluita (7.2.9.) fino ad ottenere una colorazione violetta
(la soluzione e' leggermente acida a causa del residuo di acido
acetico usato per il risciacquo).
Aggiungere quindi 10 cm(Elevato al Cubo) di una soluzione tampone
standard all'acetato (7.2.10.), immergere gli elettrodi nella
soluzione e titolare potenziometricamente con la "soluzione standard
di carbato" (7.2.11.), mentre l'estremita' della buretta e' immersa
nella soluzione. La velocita' di titolazione non deve superare 2
cm(Elevato al Cubo)/minuto, poiche' la reazione e' molto lenta; dopo
ogni aggiunta di soluzione titolante attendere che il potenziale si
sia completamente stabilizzato.
Il punto finale e' l'intersezione delle tangenti ai due rami della
curva potenziale. Si osservera' in tale occasione che l'inflessione
della curva potenziale tende ad appiattirsi; cio' puo' essere evitato
pulendo accuratamente l'elettrodo al platino (levigando con carta
vetrata).
7.4.5. Determinazione del bianco.
Eseguire contemporaneamente una determinazione del bianco con 5
cm(Elevato al Cubo) di metanolo e 40 cm(Elevato al Cubo) di acqua,
operando come indicato al punto 7.4.2. e successivi. Il consumo della
soluzione titolante non deve essere superiore a 1 cm(Elevato al
Cubo); in caso contrario deve essere controllata la purezza dei
reattivi (7.2.3., 7.2.7., 7.2.8., 7.2.9., 7.2.10.), soprattutto per
il loro contenuto di metalli pesanti.
In questo caso i reagenti devono essere sostituiti.
7.4.6. Controllo del fattore della "soluzione di carbato".
Determinare ogni giorno prima dell'impiego il fattore f della
soluzione di carbato. A tal fine, titolare potenziometricamente 10
cm(Elevato al Cubo) della soluzione di solfato di rame (7.2.12.) con
una soluzione di carbato previa aggiunta di 100 cm(Elevato al Cubo)
di acqua e di 10 cm(Elevato al Cubo) di soluzione tampone standard
all'acetato (7.2.10.). Il fattore f si calcola con la formula:
10
f = ------
a
dove:
a = cm(Elevato al Cubo) della soluzione di carbato consumati.
7.5. Calcolo dei risultati.
Poiche' ogni tensioattivo non ionico ha un fattore proprio,
determinato in funzione della composizione e in particolare della
lunghezza della catena di ossido di alchene, le concentrazioni in
tensioattivi non ionici sono espresse rapportandole ad una sostanza
di riferimento, che e' il nonilfenolo con 10 moli di ossido di
etilene (abbreviato NP 10); per essa il fattore di conversione,
ottenuto empiricamente e' 0,054.
Grazie a questo fattore, la quantita' in mg di tensioattivi
presenti nel campione si ottiene, espressa come NP 10, nel modo
seguente:
mg di tensioattivo non ionico = 0,054 (b - c) . f
dove:
b = cm(Elevato al Cubo) di "soluzione di carbato" consumati nella
titolazione del campione;
c = cm(Elevato al Cubo) di "soluzione di carbato" consumati nella
titolazione del bianco;
f = fattore della "soluzione di carbato".
7.6. Espressione dei risultati.
Esprimere il risultato in mg/l, come NP 10, con due cifre decimali
se inferiore a 1 mg/l, con una cifra decimale se superiore ad 1 mg/l.
----> Vedere da Pag. 15 a Pag. 20 della G.U. <----