Allegato V
I. RICERCA DELLA SALMONELLA NELLE FECI
1. Le feci, prelevate con cucchiai sterili o mediante tamponi e
poste in adatti recipienti, devono essere seminate entro due ore dal
prelievo, altrimenti devono essere conservate in terreni di trasporto
fra i quali si consiglia quello di Amies (6 ml) che viene mescolato
con un egual volume di feci, mentre i tamponi vengono direttamente
immersi in esso.
In laboratorio il campione di feci viene direttamente seminato in
terreno di arricchimento Rappaport-Vassiliadis (RV) nel rapporto di
1:10 e nel brodo selenite - cistina (10/100) mentre i tamponi vengono
immersi direttamente in provette con 10 ml degli stessi terreni.
Se il campione e' in terreno di trasporto, semimare 2 ml di
sospensione feci+terreno in 10 ml di Rappaport - Vassiliadis.
I terreni seminati vengono incubati a 41 C per 15 - 18 ore; segue
un isolamento su Brilliant green agar (BGA) ed un altro terreno
selettivo - differenziale a scelta fra i seguenti:
Desossicolato-citratolattosio agar (DCLA), Hektoen agar (HA), Xilosio
- lattosio-desossicolato - agar (XLDA), incubando le piastre per 24 -
48 ore a 37 C ed effettuando una prima lettura a 24 ore.
II. RICERCA DELLA SALMONELLA NEGLI ORGANI
1. Gli organi prelevati da soggetti morti o sacrificati (fegato,
rene, ovaie, intestino cieco, ovidutto) vengono raccolti in pool per
soggetto o per organo (almeno 25 g), pesati ed omogeneizzati in mixer
con 9 parti di acqua peptonata tamponata (BPW). L'omogenato si versa
in una beuta sterile da 300 ml e si incuba a 37 C per 24 ore. Segue
un arricchimento in Rappaport - Vassiliadis (0,1 ml / 10) e Brodo
selenito - cistina (10 ml / 100), incubando il primo a 41 C per 15 -
18 ore e il secondo a 37 C per lo stesso tempo. Dai due terreni di
arricchimento si esegue un isolamento su BGA e su un altro terreno a
scelta, come indicato per le feci, incubando a 37 C per 48 ore ed
eseguendo una prima lettura a 24 ore.
III. RICERCA DELLA SALMONELLA NELLE UOVA
1. Lavare e disinfettare il guscio delle uova, quindi separare
sterilmente il contenuto dell'uovo dal guscio facendolo defluire
attraverso la camera d'aria; omogeneizzare in mixer con BPW nel
rapporto di 1:10 ed incubare a 37 C per 18 - 24 ore
(prearricchimento).
L'arricchimento e l'isolamento si eseguono come indicato al punto
II.
IV. RICERCA DELLA SALMONELLA NEI MANGIMI
1. Il prelievo dei mangimi dai grossi recipienti, (silos, sacchi
etc.) si effettua con particolari sonde (sonda Nobbe) per piccoli
recipienti e sufficiente la tecnica del sacchetto rovesciato. Dai
campione si prelevano 50 g e si versano in una beuta da 1000 ml
contenente 500 ml di BPW, incubando per 24 ore a 37 C, dopo aver
omogeneizzato la sospensione per 1 ora su shaker. Segue un
arricchimento in Rappaport - Vassiliadis (0,1 / 10) e in brodo
selenito - cistina (10 / 100) incubando il primo a 41 C per 15 - 18
ore e il secondo a 37 C per lo stesso tempo, quindi un isolamento su
BGA e un altro terreno a scelta, come indicato al punto II.
V. ANALISI DELLE COLONIE E IDENTIFICAZIONE
Su BGA le colonie di salmonella si presentano di dimensioni medio
- grandi, biancorosate, traslucide, con intenso alone di viraggio
rosso - viola per alcalinizzazione del terreno. Le specie del genere
Proteus appaiono ugualmente biancorosate ma sono piu' gracili e con
alone di viraggio meno intenso.
I coliformi lattosio positivo appaiono gialli.
Su DCLA le salmonelle si presentano piccole, rugiadose, incolori e
con centro nero. I coliformi lattosio positivi lenti fermentatori
danno colonie incolori con centro rosso, i lattosio positivi rapidi
danno colonie rosse, le specie del genere Proteus danno colonie
incolori, le klebsielle danno colonie mucose, grandi, rosse. Su
Hektoen agar le salmonelle appaiono blu-verdi, con o senza centro
nero.
Su XLDA le salmonelle appaiono rosse.
Da entrambi i terreni scelti per l'isolamento si prelevano almeno
5 colonie fra le piu' tipiche e si seminano su terreno di Kligler per
infissione nel fondo e rigo centrale sulla parte inclinata. Incubare
per 24 ore a 37 C. La salmonella su tale terreno fermenta il glucosio
facendo virare al giallo il fondo mentre la parte inclinata resta
invariata o alcalinizza leggermente. Si osserva spesso annerimento
diffuso per la produzione di H 2 S. Colture in KIigler con reazione
diversa devono essere scartate. La conferma della diagnosi di
salmonella viene fatta biochimicamente con le gallerie API 20 E e
sierologicamente con i sieri immuni anti - salmonella reperibili in
commercio.
VI. CONTROLLI IGIENICI SULLE UOVA:
CARICA MESOFILA TOTALE
Partendo dalla sospensione 1 / 10 utilizzata per il
prearricchimento in BPW, effettuare alcune diluizioni in base 10 con
soluzione fisiologica triptonata e seminare 1 ml di ciascuna
diluizione in doppio in piastre di tryptose agar o trypticase agar,
incubando per 48 ore a 37 C. Le uova, conservate in buone condizioni
igieniche, sono quasi sterili.
VII. CONTROLLI SIEROLOGICI
Come indicato nel paragrafo III - Controlli sanitari -
dell'allegato II vengono effettuati prelievi di sangue da almeno 30
soggetti per seguire l'andamento della produzione di anticorpi a
seguito della vaccinazione.
A tale scopo usare una delle seguenti tecniche a seconda del
vaccino utilizzato:
1) test rapido di agglutinazione su vetrino con antigene colorato
per pullurosi che cross - reagisce con salmonella enteritidis,
prelevando almeno 2 ml di sangue con siringa dalla piega dell'ala e
lasciando sierare;
2) test di sieroagglutinazione lenta in provetta o in
micrometodo. Diluire i sieri per raddoppio fino a 1/320, in doppia
serie, quindi aggiungere a parti uguali (0,25+0,25) l'antigene
somatico e l'antigene flagellare ciascuno per ogni serie. Il primo si
allestisce raccogliendo la patina batterica di una coltura del ceppo
in esame su agar nutritivo con 2 ml di alcol assoluto, facendo agire
per 4 - 6 ore a temperatura ambiente, quindi centrifugando e
sostituendo l'alcol con soluzione fisiologica fenolata 0,5% in modo
da ottenere una concentrazione di circa 10(elevato a)8 /ml; il
secondo si prepara esaltando la mobilita' del ceppo su agar molle
(0,3%), coltivando in brodo nutritivo per 12 - 18 ore a 37 C ed
inattivando con formaldeide (0,5%).
3) test Elisa per salmonella enteritidis.
Allestire un test Elisa indiretto aderendo l'antigene ai pozzetti
di una piastrina microtiter. Esistono in commercio svariati tipi di
antigene, quali LPS, antigeni flagellari, antigeni fimbriali,
proteine esterne di membrana, etc. Il piu' usato e' il
lipolisaccaride (LPS). Saturare le piastrine con sieroalbumina bovina
(BSA) al 2% in PBS. Distribuire quindi i sieri da testare diluiti
serialmente e i rispettivi controlli positivi e negativi; aggiungere
anti - gammaglobuline di pollo coniugate con fosfatasi alcalina ed il
relativo substrato. Bloccare la reazione con una soluzione stoppante
e leggere l'assorbenza con un lettore automatico a 450 nm.
Controlli. Allestire un siero di controllo positivo mediante
inoculazione intramuscolare di 4 pulcini SPF di una settimana con una
sospensione 10(elevato a)6 di S. enteritidis; allestire un siero di
controllo negativo costituito da un pool di sieri provenienti da
almeno 50 pulcini di una settimana sicuramente indenni da infezione
da salmonella.