Allegato
METODI DI DETERMINAZIONE
Metodi biologici.
Una serie di procedure per il test sui topi, che differiscono nel
materiale di prova (epatopancreas o corpo intero) e nei solventi
utilizzati per le fasi di estrazione e purificazione, puo' essere
utilizzata per la determinazione delle tossine di cui all'art. 1.
Sensibilita' e selettivita' dipendono dalla scelta dei solventi
utilizzati per le fasi di estrazione e purificazione e di cio'
occorre tenere conto in sede di decisione del metodo da utilizzare al
fine di coprire l'intera gamma di tossine.
Un unico test sui topi, che comporta estrazione con acetone, puo'
essere utilizzato per individuare acido okadaico, dinophysitossine,
pectenotossine e yessotossine. Il test puo' essere, se necessario,
completato mediante fasi di separazione liquido/liquido con acetato
d'etile/acqua o diclorometano/acqua per eliminare potenziali
interferenze. Per l'individuazione di azaspiracidi il test deve
essere condotto sul corpo intero.
Per ogni test occorre utilizzare tre topi. La morte di due topi
su tre entro 24 ore dall'inoculazione di un estratto equivalente a 5
gr di epatopancreas o 25 gr del corpo intero (in ciascun topo) deve
essere considerato un risultato positivo per la presenza di una o
piu' tossine di cui all'art. 1 a livelli superiori a quelli fissati
dagli articoli 2, 3 e 4.
Il test sul topo condotto con estrazione del materiale di prova
con acetone mediante separazione liquido/liquido con etere etilico
puo' essere utilizzato per individuare acido okadaico, tossine da
dinoflagellate e pectenotossine. Tale metodo non consente la
determinazione completa di yessotossine e azaspiracidi in quanto
perdite di tali tossine possono verificarsi nella fase di
separazione. Per ogni test occorre utilizzare tre topi. La morte di
due topi su tre entro 24 ore dall'inoculazione di un estratto
equivalente a 5 gr di epatopancreas o 25 gr del corpo intero (in
ciascun topo) deve essere considerato un risultato positivo della
presenza di acido okadaico, tossine da dinoflagellate e
pectenotossine a livelli superiori a quelli di cui all'art. 2.
Il test sui ratti puo' individuare acido okadaico, tossine da
dinoflagellate e azaspiracidi. Per ogni test occorre utilizzare tre
ratti. Una reazione diarreogena dei tre ratti e' considerata
risultato positivo della presenza di acido okadaico, tossine da
dinoflagellate e azaspiracidi a livelli superiori a quelli di cui
all'art. 2 e all'art. 4.
Metodi alternativi di determinazione.
Una serie di metodi quali la cromatografia liquida ad alto
rendimento (HPLC con determinazione fluorimetrica, la cromatografia
liquida (LC-spettrometria di massa (MS) immunosaggi, e test
funzionali quali il test di inibizione della fosfatasi possono essere
utilizzati come metodi alternativi o complementari ai metodi di prova
biologici a condizione che, da soli o in combinazione, siano in grado
di determinare almeno i seguenti analoghi:
acido okadaico e tossine da dinoflagellate: puo' risultare
necessaria una fase idrolitica per individuare la presenza di DTX3;
pectenotossine: PTX1 e PTX2;
yessotossine: YTX, 45 OH YTX, Homo YTX, e 45 OH Homo YTX;
azaspiracidi: AZA1, AZA2 e AZA3.
Se vengono scoperti nuovi analoghi che rivestono importanza per
la sanita' pubblica, occorre includerli nell'analisi.
Dovranno essere disponibili degli standard ai fini dell'analisi
chimica. La tossicita' complessiva e' calcolata avvalendosi di
fattori di conversione basati sui dati di tossicita' disponibili per
ciascuna tossina.
Le caratteristiche di rendimento di tali metodi devono essere
definite e convalidate da un protocollo concordato a livello
internazionale.
DETERMINAZIONE DI TOSSINE LIPOSOLUBILI
(AOs, DTXs, PTXs, YTXs e AZAs) Protocollo 1.
1. Scopo e applicazione.
Questa procedura ha lo scopo di determinare le tossine
liposolubili AOs, DTXs, PTXs, YTXs e AZAs nei molluschi bivalvi,
echinodermi, tunicati e gasteropodi marini. Il metodo e'
semiquantitativo. La quantita' minima di tossina capace di uccidere
un topo di 20 g entro le 24 ore, dopo iniezione intraperitoneo, e'
definita unita' topo (UT). Questa corrisponde, ad esempio, a circa 4
µg di acido okadaico (AOs) o a circa 3,6 µg di DTX1.
2. Specificita'.
Il metodo rileva tutte le componenti storicamente incluse nel
gruppo delle DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning): acido okadaico ed
analoghi (AOs), dinophysitossine (DTXs), pectenotossine (PTXs),
yessotossine (YTXs); tossine liposolubili diarroiche identificate
recentemente come azaspiracidi (AZAs).
Sono inoltre rilevate con lo stesso metodo: brevitossine;
gymnodimine, spirolidi, pinnatossine, ciguatossine, palytossine,
aplysiatossine e lyngyatossine.
La presenza di alcune di queste tossine liposolubili, non
riferibili all'AOs e DTXs, puo' essere sospettata osservando
attentamente i sintomi nel topo dopo iniezione intraperitoneale.
3. Precauzioni.
Devono essere adoperati i guanti per manipolare sia il materiale
che puo' contenere le tossine che gli animali.
4. Interferenze.
Gli acidi grassi liberi possono produrre interferenze.
5. Principio.
5.1 Il metodo si basa sull'effetto della tossicita' acuta
provocata in topi adulti dopo una inoculazione intraperitoneale di un
estratto di corpo intero edibile di molluschi bivalvi, echinodermi,
tunicati e gasteropodi marini. La procedura include:
prelievo della parte edibile;
omogeneizzazione;
estrazione delle tossine con acetone e con metanolo;
evaporazione degli estratti;
estrazione con dietiletere del residuo risospeso con acqua;
evaporazione dell'estratto in dietiletere;
risospensione del residuo lipidico in una soluzione acquosa
all'1% di Tween 60 (emulsionante);
inoculazione intraperitoneale in un topo dell'estratto lipidico
emulsionato;
determinazione de1 tempo di morte del topo e valutazione della
tossicita'.
6. Apparecchiatura.
6.1 Stabulario o armadio stabulario opportunamente climatizzati
per il benessere dei topi e relativi box per gli animali.
6.2 Cappa chimica.
6.3 Bilancia tecnica con sensibilita' di 0,1 g.
6.4 Omogenizzatore a lame rotanti.
6.5 Omogenizzatore ad immersione ad alta velocita'.
6.6 Agitatore magnetico.
6.7 Strumento ad ultrasuoni.
6.8 Centrifuga in grado di operare a 3000 r.p.m.
6.9 Essiccatore a vuoto rotante.
6.10 Bagnomaria in grado di operare tra 40 oC e 70 oC.
6.11 Pompa per vuoto meccanica o ad acqua.
6.12 Cronometro.
6.13 Forbici, pinze, coltelli, cucchiai, retina, propipette,
guanti monouso.
7. Vetreria.
7.1 Palloni in vetro da 1 o 2 l e 100 ml con relativi raccordi.
7.2 Imbuti separatori da 250 ml.
7.3 Cilindri da 50 mL e 100 ml.
7.4 Pipette graduate e Pasteur.
7.5 Bacinelle, portaprovette, contenitori vari, siringhe monouso
con ago da insulina.
7.6 Provettoni in vetro o di altro materiale resistente ai
solventi impiegati, da circa 500 ml.
7.7 Provette graduate con tappo.
8. Reagenti.
8.1 Tutti i reagenti devono essere di qualita' analitica.
8.1.2 Acqua distillata.
8.1.3 Acetone.
8.1.4 Metanolo.
8.1.5 Dietiletere.
8.1.6 Butanolo.
8.1.7 Tween 60.
9. Soluzioni.
9.1 Tween 60 all'1%: 1g di Tween 60 e' disciolto in 100 ml di
acqua distillata
10. Animali per il test.
10.1 Utilizzare topi albini di razza Swiss di peso compreso fra
18-20g.
Gli animali devono essere tenuti nelle strutture di stabulazione
(6.1) per almeno cinque giorni prima del saggio.
11. Procedimento.
11.1 Preparazione del campione.
11.1.1 Pulire esternamente con acqua una quantita' opportuna del
campione di prova. Prelevare il corpo intero edibile di ciascun
individuo ponendo la massima attenzione a non danneggiare le parti
molli. Risciacquare con acqua distillata, qualora ce ne fosse
bisogno, la parte intera edibile del campione da provare per
rimuovere eventuale materiale estraneo. Non si devono usare fonti di
calore o anestetici per prelevare il materiale edibile.
11.1.2 Prelevare circa 150 g del campione cosi' ottenuto e
trasferirli su una retina dove vengono lasciati sgocciolare per circa
5 minuti.
11.1.3 Omogeneizzare finemente.
11.2 Estrazione.
11.2.1 Effettuare le fasi di estrazione con solventi organici
sotto cappa chimica.
11.2.2 Pesare 100 ± 0,2 g di omogenato (11.1.3).
11.2.3 Aggiungere all'omogenato (11.2.2) 300 ml di acetone ed
estrarre con omogenizzatore ad immersione per 2 minuti.
11.2.4 Filtrare sotto pressione ridotta o centrifugare il
materiale (11.2.3) a 3000 rpm per 5 minuti e raccogliere il filtrato
o il surnatante in un pallone da 1000 ml.
11.2.5 Riprendere il residuo, riestrarlo con metanolo (300 ml)
con omogenizzatore ad immersione per 2 minuti e ripetere l'operazione
come descritta nel punto 11.2.4.
11.2.6 Evaporare sotto pressione ridotta l'estratto acetonico e
metanolico riuniti fino ad un volume di circa 50 ml (preferibilmente
in un pallone da 1 o 2 l). Puo' essere aggiunto del butanolo (non
piu' di 50 ml) per evitare la formazione di eccessiva schiuma.
11.2.7 Trasferire la soluzione condensata in un imbuto
separatore.
11.2.8 Sciacquare il pallone utilizzato per l'evaporazione con un
piccolo volume di acqua (minore di 5 (ml) e dietiletere (100 ml).
Aggiungere questa miscela nell'imbuto separatore e agitare
delicatamente.
11.2.9 Terminata la separazione delle due fasi, allontanare la
fase acquosa e conservarla.
11.2.10 Sciacquare ancora due volte la fase di dietiletere con
circa 50 ml acqua. A causa dell'emulsione, parte delle tossine
potrebbe rimanere nella fase acquosa. Sciacquare la fase acquosa con
20 ml di dietiletere e aggiungerlo all'estratto iniziale di
dietiletere.
11.2.11 Ridurre per evaporazione il volume di dietiletere in un
pallone.
11.2.12 Trasferire e completare l'evaporazione del solvente
(estratto lipidico) in una provetta graduata con tappo.
12. Preparazione dell'inoculo.
12.1 Portare il residuo lipidico (11.2.12) ad un volume finale di
4 ml con Tween 60 all'1% (9.1).
12.2 Curare la formazione di un'emulsione omogenea e senza grumi
eventualmente con l'uso di ultrasuoni o con ancoretta magnetica.
13. Inoculazione degli animali.
13.1 Pesare tre topi di 18-20 g.
13.2 Iniettare intraperitoneo a ciascuno dei tre topi pesati
(13.1) 1 ml dell'emulsione (12.2), equivalente a 25 g di tessuto di
parte edibile, utilizzando una siringa monouso con ago da insulina.
13.3 Tenere gli animali in osservazione per 24 ore.
14. Interpretazione dei risultati.
14.1 La morte di due dei tre topi entro le 24 ore indica la
presenza di una o piu' tossine appartenenti ai seguenti gruppi: AOs,
DTXs, PTXs, YTXs e AZAs, a livelli superiori a quelli stabiliti nella
decisione della Commissione 2002/225/CE del 15 marzo 2002 ed il test
e' considerato positivo.
La sopravvivenza di almeno due topi oltre le 24 ore indica
l'assenza delle tossine sopra menzionate o la loro presenza a livelli
inferiori a quelli stabiliti nella decisione della Commissione
2002/225/CE del 15 marzo 2002; il test e' considerato negativo. In
caso di test positivo i molluschi non sono idonei al consumo umano.
15. Note.
15.1 La soluzione di acetone e metanolo sviluppa molta schiuma,
pertanto si consiglia l'utilizzo di grandi palloni per l'evaporazione
(1-2 l). L'aggiunta di circa 50 ml di butanolo evita la formazione di
schiuma e accelera il processo di evaporazione dell'acqua formando
una miscela azeotropica. Non aggiungere un volume eccessivo di
butanolo, poiche' esso potrebbe rimanere nel condensato.
15.2 Le YTXs portano alla morte del topo persino anche a livelli
inferiori a 1 mg /Kg di parte edibile. Se i topi muoiono con spasmi e
convulsioni, e' sospetta la presenza di tali tossine, sebbene i
sintomi delle PTXs e delle AZAs ad alte concentrazioni siano molto
simili. Nel caso sia sospetta la presenza di YTXs deve essere usato
il protocollo 2.
15.3 Quando i solventi utilizzati per la prova (acetone,
metanolo, dietiletere e butanolo) non sono usati da lungo tempo e'
opportuno verificare la loro idoneita' al test con una prova in
bianco.
16. Bibliografia.
16.1 Metodo sviluppato dal Prof. Yasumoto T., JPRL, basato sul
metodo: Yasumoto T., Murata M., Oshima Y., Matsumoto G.K., and Clardy
J. (1984) - Diarrhetic Shellfish Poisoning. In: "E.P. Ragelis (Ed):
Seafood Toxins, p 207-214. American Chemical Society.
DETERMINAZIONE DI TOSSINE LIPOSOLUBILI
(AOs, DTXs, PTXs, AZAs e YTXs)
Protocollo 2.
1. Scopo e applicazione.
Questa procedura ha lo scopo di determinare le tossine
liposolubili AOs, DTXs, PTXs, YTXs e AZAs ai molluschi bivalvi,
echinodermi, tunicati e gasteropodi marini. Il metodo e'
semiquantitativo. La quantita' minima di tossina capace di uccidere
un topo di 20 g entro le 24 ore, dopo iniezione intraperitoneo, e'
definita unita' topo (UT). Questa corrisponde, ad esempio, a circa 4
µg di acido okadaico (AOs) o a circa 3,6 µg di DTX1.
2. Specificita'.
Il metodo rileva tutte le componenti storicamente incluse nel
gruppo delle DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning): acido okadaico ed
analoghi (AOs), dinophysitossine (DTXs), pectenotossine (PTXs),
yessotossine (YTXs); tossine liposolubili diarretiche identificate
recentemente come azaspiracid (AZAs).
Sono inoltre rilevate con lo stesso metodo: brevitossine;
gymnodimine, spirolidi, pinnatossine, ciguatossine, palytossine,
aplysiatossine e lyngyatossine.
La presenza di alcune di queste tossine liposolubili, non
riferibili all'AOs e DTXs, puo' essere sospettata osservando
attentamente i sintomi sul topo dopo iniezione intraperitoneale.
3. Precauzioni.
Devono essere adoperati i guanti per manipolare sia il materiale
che puo' contenere le tossine che gli animali.
4. Interferenze.
Gli acidi grassi liberi possono produrre interferenze.
5. Principio.
5.1 Il metodo si basa sull'effetto della tossicita' acuta
provocata in topi adulti dopo una inoculazione intraperitoneale di un
estratto di corpo intero edibile di molluschi bivalvi, echinodermi,
tunicati e gasteropodi marini. La procedura include:
prelievo della parte edibile;
omogeneizzazione;
estrazione delle tossine con acetone e con metanolo;
evaporazione degli estratti;
risospensione del residuo con diclorometano: metanolo
60% (1:2);
evaporazione dell'estratto in diclorometano (Step 1);
risospensione del residuo lipidico in una soluzione acquosa
all'1% di Tween 60 (emulsionante);
inoculazione intraperitoneale in un topo dell'estratto lipidico
emulsionato;
determinazione del tempo di morte del topo e valutazione della
tossicita';
evaporazione di una aliquota dell'estratto metanolico (Step 2);
risospensione del residuo metanolico in una soluzione acquosa
all'1% di Tween 60 (emulsionante);
inoculazione intraperitoneale in un topo dell'estratto lipidico
emulsionato;
determinazione del tempo di morte del topo e valutazione della
tossicita'.
6. Apparecchiatura.
6.1 Stabulario o armadio stabulario opportunamente climatizzati
per il benessere dei topi e relativi Box per gli animali.
6.2 Cappa chimica.
6.3 Bilancia tecnica con sensibilita' di 0,1 g.
6.4 Omogenizzatore a lame rotanti.
6.5 Omogenizzatore ad immersione ad alta velocita'.
6.6 Agitatore magnetico.
6.7 Strumento ad ultrasuoni.
6.8 Centrifuga in grado di operare a 3000 r.p.m.
6.9 Essiccatore a vuoto rotante.
6.10 Bagnomaria in grado di operare tra 40 oC e 70 oC.
6.11 Pompa per vuoto meccanica o ad acqua.
6.12 Cronometro.
6.13 Forbici, pinze, coltelli, cucchiai, retina, propipette,
guanti monouso.
7. Vetreria.
7.1 Palloni in vetro da 1 o 2 l e 100 ml con relativi raccordi.
7.2 Imbuti separatori da 250 ml.
7.3 Cilindri da 50 ml e 100 ml.
7.4 Pipette graduate e Pasteur.
7.5 Bacinelle, portaprovette, contenitori vari, siringhe monouso
con ago da insulina.
7.6 Provettoni in vetro o di altro materiale resistente ai
solventi impiegati, da circa 500 ml.
7.7 Provette graduate con tappo.
8. Reagenti.
8.1 Tutti i reagenti devono essere di qualita' analitica.
8.1.1 Acqua distillata.
8.1.2 Acetone.
8.1.3 Diclorometano.
8.1.4 Metanolo.
8.1.5 Butanolo.
8.1.6 Tween 60.
9. Soluzioni.
9.1 Tween 60 all'1%: 1g di Tween 60 e' disciolto in 100 ml di
acqua distillata.
9.2 Metanolo al 60% (metanolo: acqua 6:4).
9.3 Diclorometano-metanolo presaturati (diclorometano: metanolo
60% 1 : 2).
10. Animali per il test.
10.1 Utilizzare topi albini di razza Swiss di peso compreso fra
18-20 g.
Gli animali devono essere tenuti nelle strutture di stabulazione
(6.1) per almeno 5 giorni prima del saggio.
11. Procedimento.
11.1 Preparazione del campione.
11.1.1 Pulire esternamente con acqua una quantita' opportuna del
campione di prova. Prelevare il corpo intero edibile di ciascun
individuo ponendo la massima attenzione a non danneggiare le parti
molli. Risciacquare con acqua distillata, qualora ce ne fosse
bisogno, la parte intera edibile del campione da provare per
rimuovere eventuale materiale estraneo. Non si devono usare fonti di
calore o anestetici per prelevare il materiale edibile.
11.1.2 Prelevare circa 150 g di corpo intero edibile del campione
e trasferirli su una retina dove sono lasciati sgocciolare per circa
5 minuti.
11.1.3 Omogeneizzare finemente.
11.2 Estrazione.
11.2.1 Effettuare le fasi di estrazione con solventi organici
sotto cappa chimica.
11.2.2 Pesare 100 ± 0,2 g di omogenato (11.1.3) in un tubo da
centrifuga.
11.2.3 Aggiungere all'omogenato (11.2.2) 300 ml di acetone ed
estrarre con omogenizzatore ad immersione per 2 minuti.
11.2.4 Filtrare sotto pressione ridotta o centrifugare il
materiale (11.2.3) a 3000 rpm per 5 minuti e raccogliere il filtrato
od il surnatante in un pallone da 1000 ml.
11.2.5 Riprendere il residuo, riestrarlo con metanolo (300 ml)
con omogenizzatore ad immersione per 2 minuti e ripetere l'operazione
come descritta nel punto 11.2.4.
11.2.6 Evaporare sotto pressione ridotta l'estratto acetonico e
metanolico riuniti (preferibilmente in un pallone da 1 o 2 l). Puo'
essere aggiunto del butanolo (non piu' di 50 ml) per evitare la
formazione di eccessiva schiuma.
11.2.7 Trasferire il residuo in un imbuto separatore con 30 ml di
diclorometano e 60 ml di metanolo al 60% (metanolo:acqua = 6:4). E'
essenziale che i due solventi siano presaturati, altrimenti si
potrebbe ottenere un'emulsione troppo densa.
11.2.8 Agitare l'imbuto separatore delicatamente. Terminata la
separazione delle due fasi, prendere l'estratto di diclorometano e
conservare quello di metanolo.
11.2.9 Estrarre la soluzione di diclorometano per due volte con
60 ml di metanolo al 60%.
11.2.10 Unire gli estratti di metanolo.
11.2.11 Note:
La presenza di AOs, DTXs, PTXs e AZ e' evidenziata nella fase di
diclorometano.
La presenza di YTXs e' evidenziata nella fase di metanolo 60%.
12. Determinazione di AOs, DTXs, PTXs e AZAs (Step 1).
12.1 Ridurre per evaporazione, in un pallone, il volume della
fase di diclorometano.
12.2 Trasferire e completare l'evaporazione del solvente in una
provetta graduata con tappo.
13. Preparazione dell'inoculo.
13.1 Portare il residuo lipidico (12.2) ad un volume finale di 4
ml con Tween 60 all'1% (9.1).
13.2 Curare la formazione di un'emulsione omogenea e senza grumi
eventualmente con l'uso di ultrasuoni o con ancoretta magnetica.
14. Inoculazione degli animali.
14.1 Pesare tre topi di 18-20 g.
14.2 Iniettare intraperitoneo a ciascuno dei tre topi pesati
(13.1) 1 ml dell'emulsione (13.2), equivalente a 25 g di tessuto,
utilizzando una siringa monouso con ago da insulina.
14.3 Tenere gli animali in osservazione per 24 ore.
15. Interpretazione dei risultati.
15.1 La morte di due dei tre topi entro le 24 ore indica la
presenza di una o piu' tossine appartenenti ai seguenti gruppi: AOs,
DTXs, PTXs e AZAs, a livelli superiori a quelli stabiliti nella
decisione della Commissione 2002/225/CE del 15 marzo 2002 ed il test
e' considerato positivo.
La sopravvivenza di almeno due topi oltre le 24 ore indica
l'assenza delle tossine sopra menzionate o la loro presenza a livelli
inferiori a quelli stabiliti nella decisione della Commissione
2002/225/CE del 15 marzo 2002; il test e' considerato negativo. In
caso di test positivo i molluschi non sono idonei al consumo umano.
16. Determinazione di YTXs (step 2).
16.1 Portare gli estratti metanolici 60% raccolti a 200 ml con
metanolo.
16.2 Prendere 16 ml della soluzione metanolica acquosa (16.1) ed
evaporarli quasi completamente.
16.3 Trasferire e completare l'evaporazione dei solventi in una
provetta graduata con tappo.
17. Preparazione dell'inoculo.
17.1 Portare il residuo lipidico (16.4) ad un volume finale di 4
ml con Tween 60 all'1% (9.1).
17.1.1 Curare la formazione di un'emulsione omogenea e senza
grumi eventualmente con l'uso di ultrasuoni o con ancoretta
magnetica.
18. Inoculazione degli animali.
18.1 Pesare tre topi di 18-20 g.
18.2 Iniettare intraperitoneo a ciascuno dei tre topi pesati
(18.1) 1 ml dell'emulsione (17.2), equivalente a 2 g di tessuto di
parte edibile, utilizzando una siringa monouso con ago da insulina.
18.3 Tenere gli animali in osservazione per 6 ore.
19. Interpretazione dei risultati.
19.1 La morte di due dei tre topi entro le 5 ore indica la
presenza di YTXs, a livelli superiori a quelli stabiliti nella
decisione della Commissione 2002/225/CE del 15 marzo 2002 ed il test
e' considerato positivo. La sopravvivenza di almeno due topi oltre le
5 ore indica l'assenza delle tossine sopra menzionate o la loro
presenza a livelli inferiori a quelli stabiliti nella decisione della
Commissione 2002/225/CE del 15 marzo 2002; il test e' considerato
negativo. Se si verifica la sopravvivenza di due topi oltre le 5 ore
ma il terzo ha un tempo di sopravvivenza inferiore alle tre ore il
test deve essere ripetuto. Si determina quindi la mediana dei sei
tempi di sopravvivenza registrati complessivamente se questa e'
inferiore alle 5 ore il test si considera positivo. In caso di test
positivo i molluschi non sono idonei al consumo umano.
19.2 Quando i solventi utilizzati per la prova (acetone,
metanolo, diclorometano e butanolo) non sono usati da lungo tempo e'
opportuno verificare la loro idoneita' al test con una prova in
bianco.
20. Bibliografia.
20.1 Metodo sviluppato dal Prof. Yasumoto T., JPRL, basato sul
metodo:
Yasumoto T., Murata M., Oshima Y., Matsumoto G.K., and Clardy
J. (1984) - Diarrhetic Shellfish Poisoning. In: "E.P. Ragelis (Ed):
Seafood Toxins, p 207-214. American Chemical Society.
DETERMINAZIONE DELLE BIOTOSSINE ALGALI PSP
(PARALYTIC SHELLFISH POISON)
1. Principio.
1.1 Il metodo si basa sulla inoculazione intraperitoneale di un
estratto di molluschi in topi adulti. La presenza di tossina PSP
provoca la morte degli animali.
2. Materiali.
2.1 Si utilizzano topi albini di razza Swiss di peso compreso fra
i 19 e 21 g. Se il peso e' maggiore di 21 o minore di 19 si applica
il fattore di correzione del peso. Non si possono utilizzare topi con
peso maggiore di 23 g e topi gia' usati.
3. Preparazione del campione.
3.1 I molluschi da analizzare vengono puliti esternamente
lavandoli con acqua. Si aprono tagliando i muscoli adduttori e si
rimuovono i tessuti molli (polpa) del mollusco dalla conchiglia. Non
si debbono usare ne' calore ne' anestetici prima di aprire il
mollusco e bisogna evitare di danneggiare o tagliarne il corpo.
3.2 Circa 100-150 g di polpa vengono trasferiti su una retina di
plastica, dove vengono lasciati scolare per 5'.
3.3 Si omogeneizza il campione in frullatore elettrico.
4. Estrazione del campione.
4.1 Si pesano 100 g di materiale omogeneizzato.
4.2 Si aggiungono 100 ml di HCl 0,25 N, si agita e si verifica
che il pH sia compreso fra 2 e 2,5.
4.3 La miscela viene portata ad ebollizione e si lascia bollire
lentamente per 5'.
4.4 Si lascia raffreddare a temperatura ambiente e si verifica
nuovamente il valore del pH che deve essere compreso fra 2 e 2,5. Per
abbassarlo si aggiunge HCl 5 N, agitando fino ad ottenere il valore
del pH voluto. Per alzare il pH si aggiunge alla miscela NaOH 0,1 N
lasciandola cadere a gocce ed agitando costantemente per prevenire
una alcalinizzazione locale e di conseguenza la distruzione della
tossina.
4.5 Si trasferisce la miscela in un cilindro graduato da 200 ml e
si porta a volume con acqua.
4.6 Si centrifuga la miscela a 3000 r.p.m. per 5'.
4.7 Il sopranatante viene trasferito in una beuta e si controlla
di nuovo il pH.
5. Inoculazione degli animali.
5.1 Si inocula nel peritoneo di ciascun topo test 1 ml di
estratto acido.
5.2 Si annota con un cronometro il tempo all'inizio della
inoculazione e si osserva attentamente il topo per stabilire il tempo
di morte indicato dall'ultimo respiro.
5.3 Si puo' usare per l'iniziale determinazione un topo solo, ma
e' preferibile usarne 2 o 3.
5.4 Se tutti i topi inoculati sopravvivono oltre i 60 minuti la
prova deve ritenersi terminata in quanto la concentrazione delle
tossine e' da considerarsi non determinabile (N.D.).
5.4 Se il tempo di morte o la mediana dei tempi di morte dei topi
e' minore di 5 minuti si fa una diluizione per ottenere un tempo di
morte compreso tra 5 e 7 minuti.
5.5 Se il tempo di morte di 1 o 2 topi a cui e' stato iniettato
l'estratto non diluito risulta maggiore di 7 minuti, tre o piu' topi
devono essere inoculati per stabilire la tossicita' del campione.
5.6 Se e' necessaria una elevata diluizione, si aggiusta il pH
della soluzione aggiungendo gocce di HCl (0,1 o 0,01 N) per portare
il pH ad un valore tra 2 e 2,5.
5.7 Si inoculano tre topi con la diluizione che da' un tempo di
morte di 5-7 minuti.
6. Interpretazione dei risultati.
6.1 Si determina il tempo mediano di morte dei topi tenendo
presente anche quelli sopravvissuti e tramite la tabella 2 si
determinano i corrispondenti valori di unita' topo.
6.2 Se il peso degli animali e' minore di 19 g o maggiore di 21 g
si opera una correzione per ciascun topo moltiplicando le unita' topo
corrispondenti al tempo di morte per il fattore di correzione del
peso per quel topo ricavato in base alla tabella 3 ed infine si
sceglie il valore mediano delle unita' topo corrette per gruppo
(considerare il tempo di morte dei sopravvissuti come minore di 60
minuti o equivalente a minore di 0,875 U.T. nel calcolo della
mediana).
6.3 Si convertono le U.T. in microprogrammi (µg) di tossina/ml
moltiplicandole per il valore del fattore di conversione (C.F.).
Quest'ultimo e' dato dal rapporto tra microgrammi di tossina PSP
della soluzione di riferimento inoculata in peritoneo e l'U.T.
corretta: µg di tossina/100 g di polpa (µ/ml) x fattore di diluizione
x 200.
7. Standardizzazione del metodo biologico.
7.1 Preparare una soluzione standard di lavoro di PSP,
utilizzando una soluzione madre USA, fino ad ottenere una
concentrazione di µg/ml. Si ottiene portando 1 ml di soluzione
standard madre a 100 ml con acqua distillata. Questa soluzione e'
stabile numerose settimane a 3-4 oC.
7.2 Calcolo del valore del C.F. (fattore di conversione).
7.2.1 Si diluiscono aliquote di 10 ml di soluzione standard di
lavoro (1 µg/ml) con 10-15-20-25-30 ml di H2O. Il pH delle diluizioni
deve essere compreso fra 2 e 2,5.
7.2.2 Viene scelta quella diluizione che iniettata in tre o piu'
topi per via intraperitoneale alla dose di 1 ml determina la morte
degli animali in un tempo mediano di 5-7 minuti.
7.2.3 La diluizione scelta viene provata con variazioni di +1 ml
di H2O (ad esempio se 10 ml di standard diluiti con 25 ml di H2O
uccidono i topi in 5-7 minuti, si provano soluzioni diluite 10 + 24 e
10 + 26). Si inietta un gruppo di topi con 1 ml di ciascuna delle 2 o
3 diluizioni che determinano la morte nel tempo mediano di 5-7
minuti.
7.2.4 Si inietta una dose di 1 ml a ciascun topo per via
intraperitoneale e si determina il tempo di morte corrispondente al
tempo trascorso fra l'esecuzione della iniezione e l'ultimo respiro
del topo.
7.2.5 Si ripete la prova 1 o 2 giorni piu' tardi usando le
diluizioni preparate come sopra descritto, che differiscono per
variazioni di + 1 ml di H2O rispetto alla diluizione usata.
7.2.6 Si ripete poi l'intero test partendo con nuove diluizioni
ottenute dalla soluzione standard di lavoro (1 µg/ml) preparata
fresca prima dell'uso.
7.2.7 Si calcola il tempo mediano di morte per ciascun gruppo di
10 topi utilizzati e per ciascuna delle diluizioni preparate. Se
tutti i gruppi di 10 topi iniettati con qualunque diluizione danno
tempi mediani di morte minore di 5 o minore di 7 minuti non si tiene
conto dei risultati di questa diluizione nei calcoli successivi.
D'altra parte, se anche per uno solo dei gruppi di 10 topi iniettati
con una qualsiasi diluizione si verifica un tempo mediano di morte
compreso tra 5 e 7, minuti si includono nei calcoli tutti i gruppi di
10 topi usati con questa diluizione, anche se alcuni dei tempi
mediani di morte sono minore di 5 o minore di 7 minuti.
7.2.8 Dal tempo mediano di morte per ciascun gruppo di 10 topi di
ciascuna delle diluizioni selezionate si determina il tempo mediano
di U.T./ml tramite la tabella 2.
7.2.9 Si dividono i microgrammi di tossina calcolati per 1 ml per
le U.T./ml al fine di ottenere il fattore di conversione (C.F.) il
quale esprime i microgrammi di tossina equivalenti ad 1 U.T.
7.2.10 Si calcola il valore medio del C.F. e si usa tale valore
come punto di riferimento per controllare le prove di routine.
7.2.11 I valori di C.F. possono variare in modo significativo
nell'ambito dello stesso laboratorio se le tecniche e i topi non sono
rigidamente controllati.
8. Uso dello standard per prove di routine sui molluschi.
8.1 Si controlla periodicamente il valore del C.F.
8.1.1 Se i molluschi sono analizzati meno di una volta a
settimana, si determina il valore del C.F. in ciascun giorno in cui
sono effettuate le prove, iniettando 5 topi con opportune diluizioni
dello standard di lavoro.
8.1.2 Se le prove vengono effettuate in giorni diversi
nell'ambito di una settimana, e' necessario fare soltanto un
controllo settimanale con diluizioni di standard tali che il tempo
mediano di morte risulti compreso tra 5 e 7 minuti. Il valore del
C.F. cosi' determinato dovrebbe essere compreso nel valore medio del
C.F. ± 20%.
8.1.3 Se il controllo non cade in questo ambito, si completa un
gruppo di 10 topi (aggiungendone 5 ai 5 gia' iniettati) e si inocula
un secondo gruppo di 10 topi con la stessa diluizione di standard.
8.1.4 Si media il valore del C.F. per il secondo gruppo con
quello del primo e si prende il risultato come nuovo valore di C.F.
Variazioni del C.F. minore di 20% rappresentano una significativa
modificazione della risposta dei topi alla tossina o alle tecniche di
laboratorio. Modificazioni di questo tipo richiedono un cambiamento
del valore del C.F.
8.1.5 Controlli ripetuti del valore di C.F. di solito conducono a
risultati compresi in una variazione del ± 20%. Se si riscontrano
frequentemente variazioni piu' ampie sarebbe opportuno procedere ad
un controllo di tutta la tecnica prima di continuare con le normali
prove di routine.
Tabella 2
----> Vedere Tabella 2 di pag. 21 <----
Tabella 3
----> Vedere Tabella 3 di pag. 22 <----
METODO PER L'IDENTIFICAZIONE
E LA DETERMINAZIONE DELL'ACIDO DOMOICO
NEI MOLLUSCHI EDULI LAMELLIBRANCHI
1. Scopo e campo di applicazione.
Il metodo descritto permette l'identificazione e la
determinazione dell'acido domoico nei molluschi eduli lamellibranchi.
Il limite di rivelazione del metodo e' di 0,2 µg di acido domoico per
g di tessuto edibile.
2. Principio del metodo.
L'acido domoico e' estratto dalla polpa dei molluschi con
soluzione metanolo: acqua, 1:1 (v:v), e, dopo ultrafiltrazione, e'
determinato mediante cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC)
su colonna C18, con rivelazione spettrofotometrica UV, alla
lunghezza d'onda di 242 nm.
3. Reagenti.
3.1 Tutti i reagenti impiegati devono essere di qualita'
analitica.
3.2 L'acqua usata deve essere bidistillata.
3.3 Acetonitrile.
3.4 Acido domoico.
3.5 Metanolo.
3.6 Acido trifluoroacetico (TFA) per spettroscopia.
4. Apparecchiature.
4.1 Vetreria di laboratorio.
4.2 Bilancia tecnica.
4.3 Bilancia analitica.
4.4 Omogeneizzatore a lame rotanti.
4.5 Omogeneizzatore ad immersione.
4.6 Centrifuga.
4.7 Unita' filtro di tipo Millipore Ultrafree-MC, membrana PLGC,
a basso assorbimento, da 10.000 NMWL, o unita' filtro equivalenti.
4.8 Sistema per degassaggio eluenti.
4.9 Pompa per HPLC.
4.10 Valvola d'iniezione con loop fisso.
4.11 Sistema di termostatazione colonne.
4.12 Pre-colonna per HPLC impaccata con 5 µm di ODS.
4.13 Colonna analitica per HPLC (250 x 4.6 mm), impaccata con 5
µm di ODS, termostatata a 40o C (4.11).
4.14 Rivelatore spettrofotometrico UV.
4.15 Sistema per l'acquisizione e l'elaborazione dei dati.
5. Soluzioni.
5.1 Soluzione acetonitrile: acqua, 10:90 (v:v).
5.2 Soluzione concentrata di acido domoico [100 µg/ml]. Pesare
0,5 mg di acido domoico (3.4) e disciogliere in 5,0 ml di soluzione
acetonitrile: acqua, 10:90 (v:v) (5.1).
5.3 Soluzioni di riferimento. Diluire la soluzione concentrata di
acido domoico (5.2) con soluzione acetonitrile: acqua, 10:90 (v:v)
(5.1) in modo da ottenere soluzioni di concentrazioni di 0,4 µg/ml,
2,0 µg/ml, 4,0 µg/ml e 8,0 µg/ml di acido domoico.
5.4 Soluzione estraente di acqua: metanolo, 1:1 (v:v).
5.5 Fase mobile. Miscelare 100 ml acetonitrile (3.3) con 400 ml
di acqua (3.2); aggiungere 0,2 ml TFA (3.6), e portare a volume con
acqua (3.2) in matraccio tarato da 1000 ml. Assicurare il degassaggio
della fase mobile.
6. Procedimento.
6.1 Preparazione dei campioni.
6.1.1 Pulire esternamente, lavandoli con acqua, i molluschi da
analizzare.
6.1.2 Aprire i molluschi tagliando i muscoli adduttori e
rimuovere i tessuti molli (polpa) del mollusco dalla conchiglia. Non
si devono usare ne' calore, ne' anestetici prima di aprire il
mollusco e nel corso dell'operazione bisogna evitare di danneggiare o
tagliare il corpo.
6.1.3 Prelevare un campione di ca. 100 g di polpa (6.1.2) e
trasferirlo su una retina di plastica, lasciando scolare per 5
minuti.
6.1.4 Omogeneizzare il campione (6.1.3) con omogeneizzatore a
lame rotanti (4.4).
Nota: Conservare la polpa residua (6.1.3) a temperatura minore o
uguale a -10 oC.
6.2 Estrazione.
6.2.1 Pesare accuratamente un'aliquota di 4 g di campione
omogeneizzato (6.1.4) e trasferirla in un tubo da centrifuga
graduato.
6.2.2 Aggiungere all'omogeneizzato (6.2.1) 16,0 ml di soluzione
estraente (5.4) ed estrarre con omogeneizzatore ad immersione (4.5)
per 3 mm a 10.000 rpm.
6.2.3 Centrifugare (4.6) l'estratto (6.2.2) a 3000 rpm per 10
min.
6.3 Ultrafiltrazione.
6.3.1 Prelevare dalla fase liquida (6.2.3) un'aliquota di 0,1 ml
e trasferirla nell'unita' di ultrafiltrazione (4.7).
6.3.2 Ultrafiltrare centrifugando per 30 minuti a 9000 rpm.
Note: Analizzare l'estratto filtrato (6.3.2) in un breve
intervallo di tempo.
Conservare gli estratti residui (6.3.1) a temperatura minore o
uguale a -10 oC.
6.4 Determinazione HPLC-UV.
6.4.1 Condizioni cromatografiche:
separazione mediante eluizione isocratica, a 40 oC (4.11);
a fase mobile: (5.5);
flusso: 1 ml/min;
volume iniettato 20 µl;
rivelazione spettrofotometrica a 242 nm.
6.4.2 Costruzione della curva di taratura.
Iniettare le soluzioni di riferimento (5.3);
costruire una curva di taratura di tipo y = ax + b,
dove: y = area del picco dell'acido domoico; x = concentrazione
della soluzione di riferimento (5.3) in µg/ml; a = coefficiente
angolare; b = intercetta sull'asse delle y.
6.4.3 analisi dei campioni per la ricerca di acido domoico:
iniettare 20 µl di estratto filtrato (6.3.2) per la determinazione
HPLC-UV.
Nota: Eseguire prima di ogni serie analitica la determinazione
del "bianco-reagente" applicando l'intero metodo di analisi omettendo
la porzione di campione per l'analisi. Nel cromatogramma del
bianco-reagente non dovrebbero essere presenti picchi interferenti
con l'acido domoico, oppure presenti a livelli trascurabili.
7. Identificazione.
7.1 L'identificazione dell'acido domoico si ottiene per confronto
del tempo di ritenzione del picco del campione ed il tempo di
ritenzione del picco dello standard di acido domoico.
7.2 Per informazioni supplementari ricorrere alla
co-cromatografia.
7.2.1 Ripartire l'estratto (6.3.2) in 2 aliquote:
a) su un aliquota effettuare direttamente la determinazione
HPLC-UV (6.4);
b) addizionare all'altra aliquota un volume trascurabile di
soluzione standard di acido domoico (5.2 o 5.3) in modo tale da
ottenere una concentrazione finale di acido domoico nell'estratto
pari a circa il doppio della concentrazione che si ritiene presente
nell'estratto in esame.
7.2.2 L'identificazione del picco dell'acido domoico
nell'aliquota (7.2.1.b) e' basata sulla presenza di un picco, la cui
area incrementa, rispetto all'area del picco dell'estratto non
addizionato (7.2.1, a) in modo proporzionale alla quantita' di
analita addizionato. La larghezza del picco (7.2.1, b), misurata a
meta' altezza, deve essere 90-110 % della larghezza ottenuta per il
picco dell'estratto non addizionato (7.2.1, a) ed il tempo di
ritenzione deve coincidere con quello del picco ottenuto per
l'estratto non addizionato (7.2.1, a).
8. Determinazione.
8.1 La determinazione quantitativa e' realizzata mediante
interpolazione dell'area del picco dell'acido domoico nell'estratto
campione sulla curva di taratura (6.4.2).
8.2 Per campioni ad elevate concentrazioni di acido domoico e'
opportuno procedere a diluizioni dell'estratto filtrato (6.3.2) prima
della determinazione cromatografica, al fine di ottenere una
concentrazione di analita compresa nell'intervallo di linearita'
verificato (6.4.2).
8.3 Espressione dei risultati.
La concentrazione C di acido domoico, espressa µg di acido
domoico per g di polpa, e' calcolata secondo la seguente equazione:
----> Vedere formula di pag. 23 <----
dove:
y = Area del picco di acido domoico dell'estratto campione
(6.4.3).
b = Intercetta della curva (6.4.2) sull'asse delle y.
a = Coefficiente angolare della curva di taratura (6.4.2).
R in base m = Recupero medio (%), calcolato come al punto 9.2.9.
V = Volume finale dell'estratto (6.2.2).
m = Massa in g dell'aliquota di campione (6.2.1).
D = Fattore di diluizione (se e' stata operata una diluizione
dell'estratto) (8.2).
9. Valutazione del metodo.
9.1 Limite di rivelazione.
Il limite di rivelazione del metodo, ca1colato con un S/N = 5:1,
e pari a 0,2 µg di acido domoico per g di polpa.
9.2 Calcolo del recupero
9.2.1 Valutare il recupero del metodo effettuando prove di
recupero su "biancocampione" di molluschi per il quale attraverso
precedenti determinazioni cromatografiche sia stata dimostrata
l'assenza del picco dell'acido domoico o di picchi interferenti
nell'intorno del tempo di ritenzione dell'acido domoico.
9.2.2 Preparare il bianco-campione come descritto in 6.1 fino ad
ottenere un omogeneizzato di bianco-campione.
9.2.3 Suddividere il bianco-campione omogeneizzato (9.2.2) in un
numero di aliquote corrispondenti ai livelli di fortificazione, piu'
un'aliquota per la prova in bianco.
9.2.4 Fortificare le aliquote (9.2.3), ad eccezione dell'aliquota
destinata alla prova in bianco, con ridotti volumi di soluzione
concentrata di acido domoico (5.2) in modo da ottenere in ogni
aliquota una diversa concentrazione di acido domoico (livello di
fortificazione). I livelli di fortificazione devono essere almeno 2.
9.2.5 Procedere con l'estrazione e l'analisi dei campioni
fortificati e della prova in bianco, come descritto in 6.2 - 6.4.
9.2.6 Verificare l'assenza di picchi nell'intorno tempo di
ritenzione dell'acido domoico nella prova in bianco.
9.2.7 Calcolare il recupero in percentuale (R), sui campioni
fortificati, come segue:
----> Vedere formula di pag. 23 <----
dove:
y = Area del picco di acido domoico dell'estratto campione
(6.4.3).
b = Intercetta della curva (6.4.2) sull'asse delle y.
a = Coefficiente angolare della curva di taratura (6.4.2).
C in base r = Concentrazione teorica di acido domoico
nell'aliquota di campione fortificato (9.2.4).
V = Volume finale dell'estratto (6.2.2).
m = Massa in g dell'aliquota di campione (6.2.1).
9.2.8. Eseguire le prove di recupero, per ciascun livello di
fortificazione, in triplicato, per due giorni consecutivi (n maggiore
o uguale a 12).
9.2.9 Stima dell'accuratezza e precisione.
Analizzare statisticamente i valori di recupero (9.2.7) ottenuti
nelle diverse prove (9.2.8) per ottenere il recupero medio (R in
base m) e la deviazione standard del metodo.
Nota: Valori indicativi di recupero medio (%) per i livelli di
fortificazione di 2 e 20 µg/g sono rispettivamente di 91,9 ± 6,2 e
96,3 ± 3,8 con un valore medio di 94,3 ± 5,3.
10. Sicurezza.
L'acido domoico e' una neurotossina e deve essere maneggiata con
cautela.
Acetonitrile e metanolo sono solventi tossici e volatili.
L'acido trifluoroacetico e' tossico, volatile e corrosivo e deve
essere maneggiato sotto cappa.
Tutte queste sostanze sono nocive se ingerite, inalate o
assorbite per via cutanea.
12. Riferimenti.
Quilliam, M. A., Xie, M., and Hardstoff, W. R. (1995) J. AOAC
Int. 78, 543-554.