ALLEGATO
METODI DIAGNOSTICI PER L'ACCERTAMENTO DELLA
ARTERITE VIRALE NEGLI EQUIDI RIPRODUTTORI MASCHI
Per gli accertamenti sierologici e virologici si applicano le
linee direttrici ed i criteri minimi di seguito riportati.
A) IDENTIFICAZIONE DEGLI ANTICORPI NEI CONFRONTI DEL VIRUS
DELL'ARTERITE VIRALE EQUINA IN CAMPIONI DI SANGUE
1. Raccolta dei campioni di sangue.
Per la diagnosi sierologica il prelievo di sangue deve essere
effettuato da riproduttori in buono stato di salute utilizzando
provette sterili.
Qualora fra gli equini mantenuti assieme ai riproduttori fossero
presenti soggetti con sintomatologia clinica riferibile a malattie
infettive, il prelievo di sangue dovra' essere effettuato trascorsi
quindici giorni dall'ultimo caso di malattia.
2. Prova di sieroneutralizzazione.
Si utilizzano cellule renali di coniglio in linea continua (RK 13)
e come terreno di crescita Eagle Minimum Essential Medium (MEM)
addizionato di antibiotici e siero fetale bovino al 5%.
La prova viene eseguita su piastre microtiter a 96 pozzetti a
fondo piatto.
I sieri, inattivati a 56 C per 30 minuti, vengono diluiti in base
2 da 1:2 a 1:256 in Eagle MEM, effettuando 4 repliche per ogni
campione.
Ad ogni diluizione viene aggiunto un eguale volume di sospensione
virale contenente 100 TCID50 dello stipite di referenza Bucyrus. Il
virus viene diluito in MEM antibiotato addizionato di complemento ad
una concentrazione pari al 10% della soluzione.
Dopo un contatto di 60 minuti a 37 C in atmosfera umida al 5% di
CO2, ad ogni pozzetto contenente la miscela siero-virus ed ai
relativi controlli viene aggiunto un volume di sospensione cellulare
contenente 2 x 10 '5 cellule/ml, pari a quello della miscela siero-
virus.
La lettura viene eseguita dopo 48-72 ore. 3. Interpretazione dei
risultati (con metodo statistico).
Una diluizione del siero e' positiva quando e' presente una
riduzione dell'effetto citopatico maggiore o uguale al 75%, comparata
a quella evidenziabile nei pozzetti della piu' bassa diluizione del
controllo del virus.
Uno stallone e' considerato sieropositivo se al test di
sieroneutralizzazione viene riscontrato un titolo anticorpale uguale
o superiore a 4.
B) ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE DEL VIRUS
DELL'ARTERITE VIRALE EQUINA IN COLTURE CELLULARI
1. Raccolta dei campioni di sperma.
Per l'isolamento del virus e' essenziale disporre dello sperma
degli stalloni.
Lo sperma deve essere raccolto mediante vagina artificiale a fondo
cieco (tipo Colorado o Missouri).
Per il lavaggio dei genitali dello stallone prima del prelievo non
devono essere impiegate soluzioni disinfettanti e la temperatura
interna della vagina artificiale non deve essere superiore a 40 C.
Ai fini dell'isolamento virale e' necessario raccogliere campioni
di sperma contenenti sia la parte liquida sia la frazione cellulare
dell'eiaculato.
Il campione deve essere quindi conservato in ghiaccio secco e
comunque trasportato immediatamente al laboratorio in regime di
refrigerazione.
2. Isolamento del virus.
L'isolamento del virus dai campioni di sperma, raccolti secondo le
indicazioni di cui al punto 1, viene effettuato su colture di cellule
renali di coniglio in linea continua sensibili (RK13, ATCC, CCL37).
Il campione di sperma deve essere sottoposto ad esame non appena
pervenuto al laboratorio oppure immediatamente congelato.
Dopo trattamento con ultrasuoni (3 cicli di 15 secondi a distanza
di 2 minuti) e centrifugazione (1000 RPM x 10 minuti), si effettuano
diluizioni logaritmiche in base 10 del plasma seminale con terreno
Eagle MEM addizionato di antibiotici e fungizone e si pongono ad
incubare a + 4 C x 2 ore.
Come controllo del sistema, si allestiscono diluizioni di un
campione positivo a titolo noto.
Le diluizioni da 10 ' - 1 a 10 ' - 4 del plasma seminale si
inoculano su monostrati cellulari confluenti della linea RK13,
precedentemente lavati con soluzione salina antibiotata, effettuando
almeno quattro repliche per diluizione.
Dopo un'ora di contatto in atmosfera umida al 5% di CO2 a 37 C
aggiungere terreno Eagle MEM antibiotato contenente
carbossimetilcellulosa allo 0,75% (a media viscosita') e siero fetale
bovino all'1%, senza asportare l'inoculo.
Le colture inoculate vengono esaminate per 6-7 giorni al fine di
evidenziare l'effetto citopatico del virus.
In caso di negativita' si inoculano colture cellulari fresche con
il sopranatante del primo passaggio.
In caso di positivita' si procede all'identificazione del virus
isolato mediante test di neutralizzazione o test di
immunofluorescenza diretta.
3. Interpretazione dei risultati.
Uno stallone sieropositivo viene considerato eliminatore quando il
virus, isolato da almeno uno dei tre campioni di sperma prelevati a
distanza di 10-15 giorni, viene identificato come virus dell'arterite
equina.
Uno stallone sieropositivo non e' da considerare eliminatore se
dai tre campioni di sperma, di cui al precedente paragrafo, non viene
isolato il virus dell'arterite equina.
C) PROVA DELL'ACCOPPIAMENTO (BREEDING TEST)
1. Modalita' della prova.
In alternativa alla ricerca diretta del virus dell'arterite equina
nei campioni di sperma degli stalloni risultati sieropositivi, lo
stato di eliminatore puo' essere accertato mediante la prova di
accoppiamento (breeding test).
Lo stallone risultato sieropositivo deve montare 2 cavalle
sieronegative almeno 2 volte al giorno per 2-4 giorni consecutivi.
Le cavalle devono essere mantenute in isolamento e controllate sia
clinicamente che sierologicamente, secondo la metodica descritta al
capo B), al 14 e 28 giorno dall'ultimo accoppiamento.
2. Interpretazione dei risultati.
Qualora nessuna delle cavalle manifesti alcun sintomo riferibile
ad arterite equina e risulti negativa al test sierologico del 28
giorno, lo stallone puo' essere considerato non eliminatore di virus.
Se vengono riscontrati sintomi di malattia e/o sieroconversione
nelle cavalle accoppiate con lo stallone sieropositivo, lo stallone
deve essere considerato eliminatore di virus.