ALLEGATO I
MATERIALI E METODI
1. Isolamento ed identificazione.
1.1. Prelievo dei tessuti infetti dal materiale sintomatico.
Nel corso della stagione vegetativa il materiale sintomatico puo'
consistere in fiori, frutti, foglie, germogli, branche e tronchi, in
presenza od in assenza di essudato. In presenza di essudato,
prelevarne con ansa qualche gocciola e sospenderlo in 3 ml di acqua
distillata sterile fino ad ottenere una sospensione leggermente
opalescente. In assenza di essudato, si trova il limite delle lesioni
e si asportano con bisturi sterile cinque pezzetti di corteccia al
bordo dei tessuti infetti, dopo aver asportato gli strati
superficiali suberificati. Si preferiscano aree umide ed isole
arrossate su branche e tronchi, aloni idropici su fiori e frutti.
1.2. Isolamento.
Macerare cinque pezzetti di tessuto (isodiametrici, di circa 3 mm)
in acqua distillata sterile in mortaio, dapprima in 0,1 ml e poi dopo
aggiunta di 0,4 ml. Preparare una diluizione decimale in acqua
distillata sterile (1:9; v:v) della sospensione dei pezzetti o delle
gocce di essudato. Inseminare le sospensioni concentrate e le loro
diluizioni decimali su piastre di agar nutritivo al saccarosio (ANS)
e mettere le piastre ad incubare in aerobiosi a 27 C. Dopo
quarantotto ore individuare le colonie biancastre, aventi 3-5 mm di
diametro, elevate a forma di cupola, lucenti e di aspetto mucoso.
Siffatte colonie diconsi comunemente levaniformi. Purificare le
colonie levaniformi su piastre di ANS con almeno due trapianti
successivi di colonia singola a morfologia tipica. Ottenere da ogni
isolamento almeno cinque colture pure.
Conservare le colture pure a XX 80 C in brodo nutritivo-glicerina
(15%) od a 4 C liofilizzate.
1.3. Identificazione.
Sottoporre le colture pure ai saggi: presenza di ossidasi,
produzione di pigmento fluorescente, ipersensibilita' su foglie di
tabacco, patogenicita' su pere ed agglutinazione su vetrino con
antisiero specifico per Erwinia amylovora.
Le colture a colonie levaniformi, ossidasi negative, non producenti
pigmento fluorescente, causanti ipersensibilita' su tabacco, marciume
ed essudato su pere ed agglutinate dall'antisiero specifico possono
essere identificate provvisoriamente come Erwinia amylovora.
L'identificazione provvisoria e' necessaria e sufficiente per la
definizione di una zona contaminata.
1.4. Conferma della identificazione.
Chiunque identifichi come Erwinia amylovora un batterio isolato da
materiale vegetale deve inviare la coltura pura ad uno dei seguenti
centri diagnostici nazionali per la conferma della identificazione:
Istituto di patologia vegetale
Laboratorio di fitobatteriologia
Via Filippo Re, 8 - 40126 - Bologna
Istituto di patologia vegetale
Via Valdisavoia, 5 - 95123 - Catania
Per la spedizione ogni coltura pura, fresca o liofilizzata, deve
essere imballata entro un incavo di pannello di polistirolo di
adeguato spessore, pressato ai lati da due pezzi di cartone incollati
tra loro lungo i bordi mediante nastro adesivo. La coltura pura
imballata deve essere messa in sacchetto di polietilene sigillato e
spedito con urgenza entro busta foderata. Una spedizione puo'
comprendere piu' colture. Il centro diagnostico deve essere informato
della spedizione con almeno tre giorni di anticipo.
Il direttore dell'istituto, cui afferisce il centro diagnostico,
comunica per iscritto agli interessati l'esito dei saggi di conferma
entro 14 giorni dal ricevimento delle colture pure. La risposta puo'
essere ritardata di 7 giorni in caso di contaminazione delle colture.
Presso i centri diagnostici la identificazione e' confermata
mediante saggi comparativi dei profili elettroforetici delle proteine
cellulari totali o dei profili degli esteri metilici dei grassi
cellulari totali o per la presenza di peculiari sequenze
nucleotidiche mediante loro amplificazione con reazione a catena
della polimerasi conformemente alle tecniche piu' aggiornate ed
affidabili indicate dalla letteratura specialistica.
1.5. Standard di riferimento.
Ogni saggio morfologico, fisiologico, patogenetico, immunologico e
molecolare di identificazione deve essere fatto in presenza di
appropriati controlli positivi e negativi, rappresentati da colture
pure o loro estratti.
I protocolli della tecnica di isolamento e dei saggi di
identificazione sono oggetto di corsi di addestramento a numero
chiuso presso i centri diagnostici, che provvedono a predisporre,
conservare ed inviare su richiesta gli standard di riferimento.
Le spese per la partecipazione ai corsi di addestramento e per
l'acquisizione degli standard di riferimento sono a carico degli
interessati.
2. Formulario e protocolli.
2.1. Agar-acqua.
Ha la seguente composizione: agar 0,5 g; acqua distillata, 100 ml.
Sterilizzare in autoclave a 121 C per quindici minuti.
2.2. YDC-agar.
Ha la seguente composizione: estratto di lievito, 1 g; glucosio, 2
g; carbonato di calcio (polvere finissima; Merck 2063) 2 g; agar 1,5
g; acqua distillata, 100 ml. Sterilizzare in autoclave a 121 C per
quindici minuti. Agitare bene per tenere in sospensione il carbonato
di calcio prima di farla solidificare a becco di clarino in tubo.
2.3. Colture batteriche.
Le colture pure dei batteri isolati e le colture di riferimento
possono essere coltivate ordinariamente su strisci di YDC-agar in
tubo incubate a 25-27 C e conservate temporaneamente a temperature
ambiente o piu' a lungo a 4 C. Su YDC agar Erwinia amylovora ha
buona crescita gia' dopo ventiquattro ore. Per il saggio presenza di
ossidasi si allevino le colture su strisci di KB agar (vedi
produzione di pigmento fluorescente).
2.4. Agar nutritivo al saccarosio (ANS).
Aggiungere 50 g di saccarosio ad ogni litro di agar CM3 (Oxoid) e
sterilizzare in autoclave a 121 C per quindici minuti;
alternativamente preparare il substrato aggiungendo 8 g di
Bacto-Nutrient Broth (Difco; cat. 0003-17-8), 50 g di saccarosio e 15
g di agar ad 1 lt di acqua distillata. Dopo aver sciolto l'agar a 100
C, regolare a pH 7 con aggiunta di 3N NaOH. Sterilizzare in
autoclave a 121 C per quindici minuti.
Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo: Pseudomonas fluorescens.
Erwinia amylovora e Pseudomonas syringae pv. syringae producono su
ANS colonie levaniformi.
2.5. Presenza di ossidasi.
Preparare 10 ml di soluzione 1% di tetrametil-p-fenilendiammonio
cloruro (es. Merck 821102) (TMFD) in acqua distillata entro un tubo
accuratamente pulito. Ritagliare pezzetti (circa 3 x 3 cm) di carta
Whatman n. 1 pulita e riporli entro una capsula petri sterile. Dopo
aver posto un pezzetto di carta su una superficie di vetro pulita
sterile, depositare al centro del pezzetto una goccia della soluzione
di TMFD. Mentre la soluzione sta diffondendo radialmente e la carta
e' ben impregnata, spalmare al centro dell'area umida una ansata
della coltura pura da identificare, avente 18-24 ore di eta'. Usare
una ansa di platino. In presenza di ossidasi, entro dieci secondi
compare una macchia porpora violacea scura nell'areola dove e' stata
deposta la massa batterica. Si ha reazione debolmente positiva quando
la macchia compare dopo 10-30 secondi. Se non compare macchia entro
30 secondi, la reazione e' negativa.
Controllo negativo: Pseudcmonas syringae pv. syringae.
Controllo positivo: Pseudomonas fluorescens.
2.6. Produzione di pigmento fluorescente.
Si saggia sull'agar nutritivo B di King, Ward e Raney (KB agar)
avente la seguente composizione: Proteose Peptone (Difco, cat.
0122-17-4), 20 g; glicerina 10 g; K2HP04, 1,5 g; MgS04. 7H20, 1,5 g;
agar 15 g; acqua distillata, 1 litro.
Dopo aver sciolto l'agar a 100 C, regolare a pH 7,2 con aggiunta
di 3N NaOH. Sterilizzare in autoclave a 121 C per 15 minuti.
Attorno alle colonie delle pseudomonadi fluorescenti cresciute su
questo substrato si ha diffusione radiale di pigmenti gialli o verdi
o bruni che a luce ultravioletta hanno fluorescenza verde o bleu.
L'alone fluorescente e' visibile spesso anche alla luce normale di
laboratorio. Si tenga presente che certi isolati di Pseudomonas
syringae non producono pigmento fluorescente su KB agar o lo
producono con ritardo e la loro reazione puo' essere interpretata
come negativa.
La presenza di aloni fluorescenti deve essere osservata dopo
almeno tre giorni di incubazione a 27 C.
Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo: Xanthomonas campestris pv. pruni.
2.7. Patogenicita' su pera.
Si usino pere immature di cv. Passa Crassana o Conference da 1-2
settimane dopo la caduta dei petali fino a 2-3 settimane prima della
maturita' fisiologica. Le piccole pere verdi (maggior diametro di 2-3
cm) possono essere raccolte, immerse in soluzione di ipoclorito
sodico per cinque minuti, sciacquate in acqua distillata sterile,
asciugate con carta bibula sterile e conservate in frigorifero a 4C
entro contenitori chiusi per parecchi mesi (non oltre gennaio
dell'anno successivo). Durante questo periodo esse tendono a maturare
gradualmente e divengono man mano meno idonee al saggio. Possono
essere usate anche pere delle stesse cultivar conservate nei
frigoriferi industriali. Per il saggio si usino perine intere
immature oppure fette trasversali tagliate, capsule Petri aventi sul
fondo carta bibula immersa in 2-3 mm di acqua distillata. Le perine
siano deposte sulla cavita' di piccole capsule Petri gia' predisposte
sulla carta bibula in modo che il frutticino non sia a contatto con
l'acqua. Le fette di pera, aventi spessore di circa 1 cm, vanno
adagiate su uno strato di agar acqua sterile solidificato al fondo di
capsule Petri di adeguate dimensioni. La conservazione entro queste
capsule Petri assicura alle perine (od alle fette) una adeguata
camera umida post-inoculazione.
Per l'inoculazione si conficchi per 3-4 mm la punta di un ago
attraverso una goccia di 10 (Micron(l di sospensione batterica
(concentrazione 108 batteri/ml) entro i tessuti della perina (o della
fetta). Su ogni perina (o fetta) possono aversi 4 punti di
inoculazione per isolato. Dopo l'inoculazione le capsule Petri siano
conservate a 27 C entro sacchetti di polietilene chiusi. In presenza
di Erwinia amylovora si puo' osservare sulle perine (o sulle fette)
dopo 3-5 giorni la presenza di gocciole lattiginose di essudato. Una
perina inoculata con Erwinia amylovora tende a marcire per intero
entro una settimana. L'area di perina che Erwinia amylovocra riesce
ad infettare a seguito di inoculazione sperimentale e' tanto piu'
grande quanto piu' giovane e' il frutto; di conseguenza le lesioni
tendono ad essere circoscritte man mano si avvicina la maturita' di
raccolta.
Gli isolati di Pseudomonas syringae causano entro 1-7 giorni sulle
perine (o sulle fette) aree imbrunite di aspetto secco attorno al
foro d'inoculazione, senza alcuna produzione di essudato. Per gli
isolati di piante ospiti diverse da biancospino e pero e' opportuno
ripetere a dose doppia le prove di patogenicita' su perine o fette di
pera, nel caso in cui la prima inoculazione non causa alcun sintomo
riferibile ad Erwinia amylovora.
Controllo positivo: Erwinia amylovora (ceppo padano).
Controllo negativo I: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo II: acqua distillata.
2.8. Antisiero.
Si usi un antisiero od anticorpi monoclonali preparati usando come
antigene una coltura pura o molecola purificata di Erwinia amylovora,
messi a punto per la reazione di agglutinazione, di cui sia stata
saggiata la specificita' con un congruo numero di batteri saprofiti
associati a pomacee.
Antisiero o anticorpi monoclonali possono essere richiesti ai
centri diagnostici od acquistati in commercio da ditte specializzate.
L'antisiero e gli anticorpi monoclonali devono essere conservati
ed usati secondo le indicazioni dei centri diagnostici o delle ditte
produttrici.
2.9. Agglutinazione su vetrino.
Si usino vetrini portaoggetto per microscopia, trasparenti,
puliti, ma non troppo sgrassati per evitare che le gocce d'acqua
depositate sopra si espandano troppo e creino un film troppo sottile.
Depositare separatamente su uno stesso vetrino una goccia di
antisiero specifico diluito circa da 1:20 a 1:30 (v:v) con soluzione
fisiologica (0,85 g di NaCl in 100 ml di acqua distillata) ed una
goccia di sospensione densa di cellule del batterio da identificare.
La sospensione deve essere lattiginosa, ben visibile ad occhio nudo,
ed avere una concentrazione dell'ordine di 1010 batteri/ml. Mescolare
delicatamente con ansa sterile le due gocce e poi imprimere al
vetrino un movimento di oscillazione. In caso di agglutinazione, si
nota la formazione di flocculi biancastri entro 1-2 minuti.
Se la flocculazione e' immediata, i flocculi sono vistosi e
grossolani. Se la flocculazione e' ritardata (dopo circa trenta
secondi), i flocculi sono piccoli e minuti, osservabili facendo
scorrere a film lungo il vetrino la mistura di reazione.
Controllo positivo: Erwinia amylovora (ceppo padano).
2.10. Ipersensibilita' su foglie di tabacco.
Il saggio si effettua su foglie adulte di piante di tabacco
(Nicotiana tabacum L.), preferibilmente delle cultivar Samsun o White
Burley.
Si prepari in acqua distillata sterile in provetta di vetro una
sospensione di coltura pura, avente concentrazione dell'ordine di 108
batteri/ml. La coltura deve essere ben cresciuta ed avere 24h di
eta'. Questa concentrazione e' riconoscibile con buona
approssimazione allorche' osservando controluce si nota che la
torbidita' e' uniforme ed intensa e che, agitando la provetta, i
vortici generati dalle cellule sospese sono facilmente distinguibili;
i vortici non sono piu' osservabili quando la concentrazione e' di
107 batteri/ml o di 109 batteri/ml.
Al mattino, con siringa da 1 ml ed ago sottile (numeri da 16 a 20)
si infiltri la sospensione appena preparata in zona circoscritta di
una area internervale di foglia; piu' colture possono essere
infiltrate in altrettante aree internervali di una stessa foglia.
L'area internervale infiltrata deve essere marcata con appropriata
etichetta autoadesiva al bordo della foglia.
Durante l'infiltrazione e' opportuno disporre sotto alle foglie ed
attorno alla pianta fogli di materiale assorbente (es. carta bibula,
giornali pluristratificati) in modo da raccogliere eventuali gocce
disperse.
Dopo l'infiltrazione, asciugata la superficie della foglia da
eventuali gocce residue di sospensione batterica con pezzetti di
carta bibula, le piante siano conservate a temperatura di 22-28 C
con alternanza di ore di luce (da 8 a 14) e di buio.
In caso di ipersensibilita', gia' dopo ventiquattro ore si osserva
che la intera zona internervale infiltrata con la coltura pura e'
collassata ed imbrunita. Questa risposta e' comunemente indicata come
necrosi ipersensibile confluente. Nei giorni successivi la zona
ipersensibile dissecca ulteriormente ed assume consistenza papiracea.
Erwinia amylovora e Pseudomonas syringae pv. syringae (od altre
patovar), ma non i batteri saprofiti, causano necrosi confluente
ipersensibile.
Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo: Acqua distillata.
2.11. Distruzione dei materiali infetti o contaminati.
I campioni di piante infette le piante o le foglie di tabacco, le
perine o le fette di pera usati per gli' isolamenti e
l'identificazione, tutti i materiali assorbenti contaminati e
qualsiasi altro oggetto venuto in contatto con i germi di Erwinia
amylovora devono essere raccolti in sacchetti autoclavabili e
sterilizzati in autoclave a 121 C per quindici minuti.