Allegato I MATERIALI E METODI 1. Isolamento ed identificazione. 1.1. Prelievo dei tessuti infetti dal materiale sintomatico. Nel corso della stagione vegetativa il materiale sintomatico puo' consistere in fiori, frutti, foglie, germogli, branche e tronchi, in presenza od in assenza di essudato. In presenza di essudato, prelevarne con ansa qualche gocciola e sospenderlo in 3 ml di acqua distillata sterile fino ad ottenere una sospensione leggermente opalescente. In assenza di essudato, si trova il limite delle lesioni e si asportano con bisturi sterile 5 pezzetti di corteccia al bordo dei tessuti infetti, dopo aver asportato gli strati superficiali suberificati. Si preferiscano aree umide ed isole arrossate su branche e tronchi, aloni idropici su fiori e frutti. 1.2. Isolamento. Macerare 5 pezzetti di tessuto (isodiametrici, di circa 3 mm) in acqua distillata sterile in mortaio, dapprima in 0,1 ml e poi dopo aggiunta di 0,4 ml. Preparare una diluizione decimale in acqua distillata sterile (1:9; v:v) della sospensione dei pezzetti o delle gocce di essudato. Inseminare le sospensioni concentrate e le loro diluizioni decimali su piastre di agar nutritivo al saccarosio (ANS) e mettere le piastre ad incubare in aerobiosi a 27 C. Dopo 48 ore individuare le colonie biancastre, aventi 3-5 mm di diametro, elevate a forma di cupola, lucenti e di aspetto mucoso. Siffatte colonie diconsi comunemente levaniformi. Purificare le colonie levaniformi su piastre di ANS con almeno due trapianti successivi di colonia singola a morfologia tipica. Ottenere da ogni isolamento almeno 5 colture pure. Conservare le colture pure a --80 C in brodo nutritivoglicerina (15%) od a 4 C liofilizzate. 1.3. Identificazione. Sottoporre le colture pure ai saggi: presenza di ossidasi, produzione di pigmento fluorescente, ipersensibilita' su foglie di tabacco, patogenicita' su pere ed agglutinazione su vetrino con antisiero specifico per Erwinia amylovora. Le colture a colonie levaniformi, ossidasi negative, non producenti pigmento fluorescente, causanti ipersensibilita' su tabacco, marciume ed essudato su pere ed agglutinate dall'antisiero specifico possono essere identificate provvisoriamente come Erwinia amylovora. L'identificazione provvisoria e' necessaria e sufficiente per la definizione di una zona contaminata. 1.4. Conferma della identificazione. Chiunque identifichi come Erwinia amylovora un batterio isolato da materiale vegetale deve inviare la coltura pura ad uno dei seguenti centri diagnostici nazionali per la conferma della identificazione. Istituto di patologia vegetale - Laboratorio di fitobatteriologia Via Filippo Re, 8 - 40126 Bologna Istituto di patologia vegetale Via Valdisavoia, 5 - 95123 Catania Dipartimento di protezione delle piante dalle malattie Via Amendola, 165/A - 70126 Bari Per la spedizione ogni coltura pura, fresca o liofilizzata, deve essere imballata entro un incavo di pannello di polistirolo di adeguato spessore, pressato ai lati da due pezzi di cartone incollati tra loro lungo i bordi mediante nastro adesivo. La coltura pura imballata deve essere messa in sacchetto di polietilene sigillato e spedito con urgenza entro busta foderata. Una spedizione puo' comprendere piu' colture. Il centro diagnostico deve essere informato della spedizione con almeno tre giorni di anticipo. Il direttore dell'istituto, cui afferisce il centro diagnostico, comunica per iscritto agli interessati l'esito dei saggi di conferma entro 14 giorni dal ricevimento delle colture pure. La risposta puo' essere ritardata di 7 giorni in caso di contaminazione delle colture. Presso i centri diagnostici la identificazione e' confermata mediante saggi comparativi dei profili elettroforetici delle proteine cellulari totali o dei profili degli esteri metilici dei grassi cellulari totali o per la presenza di peculiari sequenze nucleotidiche mediante loro ampliflicazione con reazione a catena della polimerasi conformemente alle tecniche piu' aggiornate ed affidabili indicate dalla letteratura specialistica. 1.5. Standard di riferimento. Ogni saggio morfologico, fisiologico, patogenetico, immunologico e molecolare di identificazione deve essere fatto in presenza di appropriati controlli positivi e negativi, rappresentati da colture pure o loro estratti. I protocolli della tecnica di isolamento e dei saggi di identificazione sono oggetto di corsi di addestramento a numero chiuso presso i centri diagnostici, che provvedono a predisporre, conservare ed inviare su richiesta gli standard di riferimento. Le spese per la partecipazione ai corsi di addestramento e per l'acquisizione degli standard di riferimento sono a carico degli interessati. 2. Formulario e protocolli. 2.1. Agaracqua. Ha la seguente composizione: Agar 0,5 g; Acqua distillata, 100 ml. Sterilizzare in autoclave a 121 C per 15 minuti. 2.2. YDC-agar. Ha la seguente composizione: Estratto di lievito, 1 g; Glucosio, 2 g; Carbonato di calcio (Polvere finissima; Merck 2063), 2 g; Agar 1,5 g; Acqua distillata, 100 ml. Sterilizzare in autoclave a 121 C per 15 minuti. Agitare bene per tenere in sospensione il carbonato di calcio prima di farla solidificare a becco di clarino in tubo. 2.3. Colture batteriche. Le colture pure dei batteri isolati e le colture di riferimento possono essere coltivate ordinariamente su strisci di YDC-agar in tubo incubate a 25-27 C e conservate temporaneamente a temperature ambiente o piu' a lungo a 4 C. Su YDC agar Erwinia amylovora ha buona crescita gia' dopo 24 ore. Per il saggio presenza di ossidasi si allevino le colture su strisci di KB agar (vedi produzione di pigmento fluorescente). 2.4. Agar nutritivo al saccarosio (ANS). Aggiungere 50 g di saccarosio ad ogni litro di agar CM3 (Oxoid) e sterilizzare in autoclave a 121 C per 15 minuti; alternativamente preparare il substrato aggiungendo 8 g di Bacto-Nutrient Broth (Difco; Cat. 0003-17-8), 50 g di saccarosio e 15 g di Agar ad 1 lt di acqua distillata. Dopo aver sciolto l'agar a 100 C, regolare a pH 7 con aggiunta di 3N NaOH. Sterilizzare in autoclave a 121 C per 15 minuti. Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae. Controllo negativo: Pseudomonas fluorescens. Erwinia amylovora e Pseudomonas syringae pv. syringae producono su ANS colonie levaniformi. 2.5. Presenza di ossidasi. Preparare 10 ml di soluzione 1% di tetrametilpfenilendiammonio cloruro (es. Merck 821102) (TMFD) in acqua distillata entro un tubo accuratamente pulito. Ritagliare pezzetti (circa 3 X 3 cm) di carta Whatman n. 1 pulita e riporli entro una capsula petri sterile. Dopo aver posto un pezzetto di carta su una superficie di vetro pulita sterile, depositare al centro del pezzetto una goccia della soluzione di TMFD. Mentre la soluzione sta diffondendo radialmente e la carta e' ben impregnata, spalmare al centro della area umida una ansata della coltura pura da identificare, avente 18-24 ore di eta'. Usare una ansa di platino. In presenza di ossidasi, entro 10 secondi compare una macchia porpora violacea scura nell'areola dove e' stata deposta la massa batterica. Si ha reazione debolmente positiva quando la macchia compare dopo 10-30 secondi. Se non compare macchia entro 30 secondi, la reazione e' negativa. Controllo negativo: Pseudomonas syringae pv. syringae. Controllo positivo: Pseudomonas fluorescens. 2.6. Produzione di pigmento fluorescente. Si saggia sull'agar nutritivo B di King, Ward e Raney (KB agar) avente la seguente composizione: Proteose Peptone (Difco, Cat. 0122-17-4), 20 g; Glicerina 10 g; K 2 HPO 4 , 1,5 g; MgSO 4 .7H 2 O, 1,5 g; Agar 15 g; Acqua distillata, 1 litro. Dopo aver sciolto l'agar a 100 (elevato a)0 C, regolare a pH 7,2 con aggiunta di 3N NaOH. Sterilizzare in autoclave a 121 (elevato a)0 C per 15 minuti. Attorno alle colonie delle pseudomonadi fluorescenti cresciute su questo substrato si ha diffusione radiale di pigmenti gialli o verdi o bruni che a luce ultravioletta hanno fluorescenza verde o bleu. L'alone fluorescente e' visibile spesso anche alla luce normale di laboratorio. Si tenga presente che certi isolati di Pseudomonas syringae non producono pigmento fluorescente su KB agar o lo producono con ritardo e la loro reazione puo' essere interpretata come negativa. La presenza di aloni fluorescenti deve essere osservata dopo almeno 3 giorni di incubazione a 27 C. Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae. Controllo negativo: Xanthomonas campestris pv. pruni. 2.7. Patogenicita' su pera. Si usino pere immature di cv. Passa Crassana o Conference da 1-2 settimane dopo la caduta dei petali fino a 2-3 settimane prima della maturita' fisiologica. Le piccole pere verdi (maggior diametro di 2-3 cm) possono essere raccolte, immerse in soluzione di ipoclorito sodico per 5 minuti, sciacquate in acqua distillata sterile, asciugate con carta bibula sterile e conservate in frigorifero a 4 C entro contenitori chiusi per parecchi mesi (non oltre gennaio dell'anno successivo). Durante questo periodo esse tendono a maturare gradualmente e divengono man mano meno idonee al saggio. Possono esser usate anche pere delle stesse cultivar conservate nei frigoriferi industriali. Per il saggio si usino perine intere immature oppure fette trasversali tagliate, capsule Petri aventi sul fondo carta bibula immersa in 2-3 mm di acqua distillata. Le perine siano deposte sulla cavita' di piccole capsule Petri gia' predisposte sulla carta bibula in modo che il frutticino non sia a contatto con l'acqua. Le fette di pera, aventi spessore di circa 1 cm, vanno adagiate su uno strato di agar acqua sterile solidificato al fondo di capsule Petri di adeguate dimensioni. La conservazione entro queste capsule Petri assicura alle perine (od alle fette) una adeguata camera umida postinoculazione. Per l'inoculazione si conficchi per 3-4 mm la punta di un ago attraverso una goccia di 10 m l di sospensione batterica (concentrazione 10(elevato a)8 batteri/ml) entro i tessuti della perina (o della fetta). Su ogni perina (o fetta) possono aversi 4 punti di inoculazione per isolato. Dopo l'inoculazione le capsule Petri siano conservate a 27 C entro sacchetti di polietilene chiusi. In presenza di Erwinia amylovora si puo' osservare sulle perine (o sulle fette) dopo 3-5 giorni la presenza di gocciole lattiginose di essudato. Una perina inoculata con Erwinia amylovora tende a marcire per intero entro una settimana. L'area di perina che Erwinia amylovora riesce ad infettare a seguito di inoculazione sperimentale e' tanto piu' grande quanto piu' giovane e' il frutto; di conseguenza le lesioni tendono ad essere circoscritte man mano si avvicina la maturita' di raccolta. Gli isolati di Pseudomonas syringae causano entro 1-7 giorni sulle perine (o sulle fette) aree imbrunite di aspetto secco attorno al foro d'inoculazione, senza alcuna produzione di essudato. Per gli isolati di piante ospiti diverse da biancospino e pero e' opportuno ripetere a dose doppia le prove di patogenicita' su perine o fette di pera, nei casi in cui la prima inoculazione non causa alcun sintomo riferibile ad Erwinia amylovora. Controllo positivo: Erwinia amylovora (Ceppo padano). Controllo negativo I: Pseudomonas syringae pv. syringae. Controllo negativo II: Acqua distillata. 2.8. Antisiero. Si usi un antisiero od anticorpi monoclonali preparati usando come antigene una coltura pura o molecola purificata di Erwinia amylovora, messi a punto per la reazione di agglutinazione, di cui sia stata saggiata la specificita' con un congruo numero di batteri saprofiti associati a pomacee. Antisiero o anticorpi monoclonali possono essere richiesti ai centri diagnostici od acquistati in commercio da ditte specializzate. L'antisiero e gli anticorpi monoclonali devono essere conservati ed usati secondo le indicazioni dei centri diagnostici o delle ditte produttrici. 2.9. Agglutinazione su vetrino. Si usino vetrini portaoggetto per microscopia, trasparenti, puliti, ma non troppo sgrassati per evitare che le gocce d'acqua depositate sopra si espandano troppo e creino un film troppo sottile. Depositare separatamente su uno stesso vetrino una goccia di antisiero specifico diluito circa da 1:20 a 1:30 (v:v) con soluzione fisiologica (0,85 g di NaCI in 100 ml di acqua distillata) ed una goccia di sospensione densa di cellule del batterio da identificare. La sospensione deve essere lattiginosa, ben visibile ad occhio nudo, ed avere una concentrazione dell'ordine di 10(elevato a)10 batteri/ml. Mescolare delicatamente con ansa sterile le due gocce e poi imprimere al vetrino un movimento di oscillazione. In caso di agglutinazione, si nota la formazione di flocculi biancastri entro 1-2 minuti. Se la flocculazione e' immediata, i flocculi sono vistosi e grossolani. Se la flocculazione e' ritardata (dopo circa 30 secondi), i flocculi sono piccoli e minuti, osservabili facendo scorrere a film lungo il vetrino la mistura di reazione. Controllo positivo: Erwinia amylovora (ceppo padano). 2.10. Ipersensibilita' su foglie di tabacco o baccelli verdi di fagiolo. Il saggio si effettua su foglie adulte di piante di tabacco (Nicotiana tabacum L.), preferibilmente delle cultivar Samsun o White Burley. Si prepari in acqua distillata sterile in provetta di vetro una sospensione di coltura pura, avente concentrazione dell'ordine di 10(elevato a)8 batteri/ml. La coltura deve essere ben cresciuta ed avere 24h di eta'. Questa concentrazione e' riconoscibile con buona approssimazione allorche' osservando controluce si nota che la torbidita' e' uniforme ed intensa e che, agitando la provetta, i vortici generati dalle cellule sospese sono facilmente distinguibili; i vortici non sono piu' osservabili quando la concentrazione e' di 10(elevato a)7 batteri/ml o di 10(elevato a)9 batteri/ml. Al mattino, con siringa da 1 ml ed ago sottile (numeri da 16 a 20) si infiltri la sospensione appena preparata in zona circoscritta di una area internervale di foglia; piu' colture possono essere infiltrate in altrettante aree internervali di una stessa foglia. L'area internervale infiltrata deve essere marcata con appropriata etichetta autoadesiva al bordo della foglia. Durante l'infiltrazione e' opportuno disporre sotto alle foglie ed attorno alla pianta fogli di materiale assorbente (es. carta bibula, giornali pluristratificati) in modo da raccogliere eventuali gocce disperse. Dopo l'infiltrazione, asciugata la superficie della foglia da eventuali gocce residue di sospensione batterica con pezzetti di carta bibula, le piante siano conservate a temperatura di 22-28 C con alternanza di ore di luce (da 8 a 14) e di buio. In caso di ipersensibilita', gia' dopo 24 ore si osserva che la intera zona internervale infiltrata con la coltura pura e' collassata ed imbrunita. Questa risposta e' comunemente indicata come necrosi ipersensibile confluente. Nei giorni successivi la zona ipersensibile dissecca ulteriormente ed assume consistenza papiracea. Erwinia amylovora e Pseudomonas syringae pv. syringae (od altre patovar), ma non i batteri saprofiti, causano necrosi confluente ipersensibile. Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae. Controllo negativo: Acqua distillata. 2.11. Distruzione dei materiali infetti o contaminati. I campioni di piante infette, le piante o le foglie di tabacco, le perine o le fette di pera usati per gli isolamenti e l'identificazione, tutti i materiali assorbenti contaminati e qualsiasi altro oggetto venuto in contatto con i germi di Erwinia amylovora devono essere raccolti in sacchetti autoclavabili e sterilizzati in autoclave a 121 C per 15 minuti.