Allegato 3 Dopo l'Allegato 3 dell'ordinanza del Ministro della salute 28 maggio 2015 e' inserito il seguente: "Allegato 3-bis PROVE DIAGNOSTICHE PER LA RICERCA DI ANTICORPI ANTI-RB51 Il test sierologico per la ricerca di anticorpi anti-RB51 e' la prova della Fissazione del Complemento (FdC-RB51) specifica per RB51. Tutti i capi dell'allevamento in cui si sospetti l'uso illecito di vaccino devono essere sottoposti a prelievo ufficiale di sangue da parte della ASL competente per territorio e saggiati mediante la prova FdC-RB51. La FdC-RB51, se eseguita durante i primi mesi dopo l'ultima somministrazione di vaccino RB51, ha una sensibilita' elevata, cioe' un'elevata probabilita' di identificare correttamente un animale vaccinato. Questa sensibilita' nei bovini e nei bufali e' prossima o superiore al 90% nei primi 4 mesi, per scemare poi progressivamente, in animali vaccinati in eta' prepubere e con tripla dose con richiamo. La specificita' della prova, cioe' la sua capacita' di identificare correttamente animali non vaccinati, e' stata stimata usando sieri di campo di bovini e bufali non sottoposti a vaccinazione con RB51 ed e' risultata pari a 99.9% (C.I. 99.73-99.96%). Per l'esecuzione della prova deve essere utilizzato l'antigene omologo prodotto con vaccino RB51 titolato con siero di riferimento di bovino e di bufalo. La FDC deve essere effettuata nel seguente modo: 1) inattivare i sieri bovini/bufalini, nativi o prediluiti, a 58°C per trenta minuti; 2) distribuire 0,025 ml di ciascun siero in esame inattivato in micropiastra e diluirli per raddoppio, dalla diluizione 1:4 alla diluizione 1:128; 3) distribuire 0,025 ml di antigene liofilizzato e pronto all'uso, in ciascun pozzetto contenente il siero diluito ed inattivato; 4) distribuire 0,025 ml di complemento precedentemente titolato a 2 Unita' fissanti il complemento al 100%; 5) agitare e porre in incubazione a 37°C per trenta minuti in bagnomaria o in termostato; 6) dopo la prima incubazione, aggiungere 0,025 ml di sistema emolitico contenente due unita' di emolisina (siero iperimmune di coniglio anti-globuli rossi di montone) precedentemente titolate, ed una sospensione di globuli rossi di montone al 2%; 7) agitare e porre in incubazione a 37°C per trenta minuti in bagnomaria o in termostato; 8) dopo la seconda incubazione, centrifugare la micropiastra e procedere con la lettura. Verificare che i controlli presentino la reattivita' attesa; 9) leggere e registrare il titolo dei sieri in esame, che e' rappresentato dalla piu' alta diluizione del siero che ha determinato fissazione del complemento. Il valore soglia per la positivita' della prova e' 1:4 al 100% di fissazione. La prova intradermica della Brucellina (BST), se eseguita durante i primi mesi dopo l'ultima somministrazione di RB51, ha una sensibilita' piuttosto bassa, inferiore alla FdC-RB51, che pero' si mantiene costante nel tempo invece di scemare rapidamente. Inoltre, la specificita' della BST (cioe' la probabilita' di dare risultato negativo in un animale non vaccinato) e' molto alta. L'effetto combinato di questa bassa sensibilita' e alta specificita' rende la prova inadatta a certificare che un animale non e' stato vaccinato (o nel caso dell'infezione da brucella selvaggia, che l'animale e' sano), quindi si tratta di una prova inadatta per la certificazione degli animali nel commercio internazionale. Contemporaneamente, data l'elevata specificita', se un animale risulta positivo alla BST ha un'elevata probabilita' di essere venuto a contatto con l'antigene brucellare (vaccinale o selvaggio che sia). Procedere nel modo seguente: - Tosare l'area da sottoporre ad inoculo tra il terzo distale del collo e la spalla facendo attenzione a non lesionare la cute. L'area di inoculo non deve essere raggiungibile dalle corna ne' deve essere soggetta al contatto ripetuto con eventuali strutture dell'allevamento. - Misurare lo spessore della cute, sollevata in plica, mediante cutimetro. - Registrare lo spessore della cute rilevata sul modello 2/33 - Inoculare per via intradermica di 0,1 ml di Brucellergene OCB® con una siringa da insulina, sollevando in plica la cute dell'area da inoculare. Inserire l'ago parallelamente alla cute in modo da effettuare una inoculazione intradermica. Dopo inoculazione della brucellina si osservera' la comparsa di un piccolo pomfo. Evidenziare l'area di inoculo mediante apposizione di simbolo colorato. - Dopo 72h, lo stesso personale che ha eseguito l'inoculo si recera' di nuovo in azienda per la verifica dell'eventuale reazione intradermica effettuando le seguenti operazioni: o Osservazione del punto di inoculo per evidenziare l'eventuale comparsa di una reazione cutanea visibile e palpabile; o Misurazione dello spessore della cute dell'area di inoculo con cutimetro o Un aumento dello spessore della cute uguale o maggiore ai 2 mm e' considerato come esito positivo alla prova di intradermoreazione. ======================================= | Numero animali | Numero massimo | | esaminati |animali positivi | +===================+=================+ |1,131 |1 | +-------------------+-----------------+ |132,303 |2 | +-------------------+-----------------+ |304,506 |3 | +-------------------+-----------------+ |507,73 |4 | +-------------------+-----------------+ |731,968 |5 | +-------------------+-----------------+ |969,1218 |6 | +-------------------+-----------------+ |1219,1475 |7 | +-------------------+-----------------+ |1476,174 |8 | +-------------------+-----------------+ |1741,2011 |9 | +-------------------+-----------------+ |2012,2286 |10 | +-------------------+-----------------+ |2287,2566 |11 | +-------------------+-----------------+ |2567,285 |12 | +-------------------+-----------------+ |2851,3137 |13 | +-------------------+-----------------+ |3138,3426 |14 | +-------------------+-----------------+ |3427,3719 |15 | +-------------------+-----------------+ |3720,4014 |16 | +-------------------+-----------------+ |4015,4311 |17 | +-------------------+-----------------+ |4312,461 |18 | +-------------------+-----------------+ |4611,4912 |19 | +-------------------+-----------------+ |4913,5214 |20 | +-------------------+-----------------+