(Allegato 1)
                             ALLEGATO 1 
                 PROVE SIEROLOGICHE PER LA DIAGNOSI 
                    DELLA BRUCELLOSI OVI-CAPRINA 
   Le prove sierologiche per la diagnosi della brucellosi degli ovini
e caprini sono rappresentate dalle reazioni  di  siero-agglutinazione
rapida con antigene al rosa bengala e di fissazione del complemento. 
   La siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa  bengala  puo'
essere utilizzata come prova per il controllo degli allevamenti ovini
o caprini  ai  fini  del  rilascio  della  qualifica  di  allevamenti
ufficialmente indenni o indenni da brucellosi. 
   Allorche' nel corso di tale ricerca mediante la prova con antigene
al rosa bengala piu' del 5%  degli  animali  dell'azienda  da'  esito
positivo, viene praticato un controllo complementare su ogni  animale
dell'azienda mediante una prova di fissazione del complemento. 
   La fissazione del complemento deve essere  impiegata  per  l'esame
individuale degli ovini e caprini. 
   La fissazione  del  complemento  puo'  essere  impiegata  per  gli
allevamenti ovini e caprini allo scopo di stabilire la  qualifica  di
allevamenti ufficialmente indenni o indenni da brucellosi. 
 A) SIERO-AGGLUTINAZIONE RAPIDA CON ANTIGENE AL ROSA BENGALA (SAR-Ag:
RB) 
   La reazione  di  SAR-Ag:  RB  deve  essere  applicata  secondo  le
seguenti norme tecniche: 
    1. Il siero  di  riferimento  comunitario  e'  rappresentato  dal
secondo siero internazionale standard anti-Brucella abortus,  fornito
dal Central Veterinary Laboratory di Weybridge, Surrey,  Inghilterra,
contenente 1000 unita'  internazionali  agglutinanti  per  millilitro
(Second  Internazional  Standard  anti-Brucella  abortus  Serum:  2nd
ISaBS). 
    2. Il siero nazionale standard per il  controllo  della  reazione
deve essere calibrato sul secondo siero internazionale standard anti-
Brucella abortus di Weybridge. 
    3. Il siero  di  lavoro,  di  origine  ovina,  per  il  controllo
giornaliero della reazione deve essere calibrato sul siero  nazionale
standard. 
    4. L'antigene al rosa bengala e' unico  su  tutto  il  territorio
nazionale e deve essere: 
     - preparato con il ceppo B.abortus 99 o 1119 (USDA) o  qualunque
altro ceppo di sensibilita' equivalente, in fase S; 
     - sospeso in tampone deve avere pH 3,65 (Piu'  o  Meno)  0,05  e
essere colorato mediante rosa bengala; 
     -  controllato  nei  confronti  di   otto   sieri   liofilizzati
riconosciuti rispettivamente positivi e negativi; 
     - standardizzato in modo da  dare  una  agglutinazione  visibile
alla dil. 1:47,5 e da non dare agglutinazione alle dil. 1:50 del  2nd
ISaBS di Weybridge, U.K.; 
     -  fornito  pronto  per  l'uso  e  riportare  sull'etichetta  di
confezionamento il periodo di validita'. 
    5. La reazione di SAR-Ag: RB  deve  essere  effettuata  nel  modo
seguente: 
     - porre una goccia (0,03 ml) di antigene a fianco di una  goccia
(0,03 ml) del siero nativo in esame su di una piastra bianca; 
     - mescolare  i  due  reagenti  con  una  bacchetta  di  vetro  o
plastica, prima  in  linea  retta,  poi  tracciando  dei  cerchi  del
diametro di 20-30 mm. circa; 
     - agitare manualmente la piastra con movimenti circolari  oppure
servendosi di un oscillatore a movimenti  rotatori,  a  velocita'  di
circa 30 movimenti al minuto, per almeno 4 minuti; 
     - leggere la reazione in buone condizioni di  illuminazione:  in
mancanza di agglutinati la reazione sara' considerata negativa mentre
in presenza di qualsiasi  grado  di  agglutinazione  la  reazione  e'
considerata  positiva,  salvo  quando  appare  chiara  una  eccessiva
essiccazione ai margini della reazione. 
    6. La siero-agglutinazione rapida con antigene  al  rosa  bengala
puo' essere allestita con apparecchiature automatiche. 
    7. La sorveglianza ed il controllo del siero nazionale standard e
dell'antigene sono effettuati dall'Istituto superiore di sanita',  su
ogni serie prodotta. 
 B) FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO (F.d.C.) 
   La reazione di fissazione del complemento  deve  essere  applicata
secondo le seguenti tecniche: 
    1. Il siero  di  riferimento  comunitario  e'  il  secondo  siero
internazionale standard anti-B. abortus  (2nd  ISaBS)  di  Weybridge,
contenente 1000 unita' internazionali  fissanti  il  complemento  per
millilitro (UICFT/ml). 
    2. Il siero nazionale standard per il  controllo  della  reazione
deve essere calibrato sul secondo siero  internazionale  standard  di
Weybridge come per il punto 2, sez. A. 
    3. Il siero  di  lavoro,  di  origine  ovina,  per  il  controllo
giornaliero della reazione deve essere calibrato sul siero  nazionale
standard come per il punto 3, sez. A. 
    4. Un siero in esame che contiene 20 o piu' unita' internazionali
fissanti il complemento e' considerato positivo. 
    5. L'antigene e' unico su tutto il territorio  nazionale  e  deve
essere: 
     - preparato con il ceppo B. abortus 99 o 1119 (USDA) o qualunque
altro ceppo di sensibilita' equivalente, in fase S; 
     - sospeso in soluzione fisiologica 0,85 NaCl e fenolato; 
     - standardizzato rispetto il secondo siero internazionale stand-
ard di Weybridge (2nd ISaBS); 
     -  fornito  concentrato  e  sull'etichetta  di   confezionamento
riportare coefficiente di dil. e data di scadenza. 
    6. La reazione  di  F.d.C.  deve  essere  effettuata  secondo  il
seguente schema unificato: 
      a) inattivare i sieri in esame, nativi o prediluiti, a 60›C per
30'; 
      b) diluire per raddoppio i sieri inattivati; 
      c) distribuire l'antigene alla diluizione d'uso; 
      d) distribuire 2 unita' di complemento; 
      e) agitare e porre in incubazione a 37›C per 30'; 
      f) aggiungere il  sistema  emolitico  contenente  2  unita'  di
emolisina ed una concentrazione del 2% di globuli rossi lavati,  pari
a 54 x 10(elevato a 7) cellule per millilitro; 
      g) allestire i seguenti controlli di reazione: 
      - controllo del potere anticomplementare dei sieri; 
      - controllo dell'antigene; 
      - controllo del sistema emolitico; 
      - controllo delle unita' di complemento utilizzate; 
      - controllo di lettura % di emolisi; 
      - controllo del siero nazionale standard e del siero di  lavoro
positivo; 
      - controllo del siero negativo; 
      h) agitare e porre in incubazione a 37›C per 30'; 
      i) verificare la qualita' dei controlli; 
      l) leggere il titolo dei sieri in  esame,  rappresentato  dalla
piu' alta diluizione che ha  determinato  il  50%  di  emolisi  o  di
fissazione, e trasformare il titolo in unita' internazionali fissanti
il complemento. 
    7.  La  reazione  puo'  essere  allestita   con   apparecchiature
automatiche. 
    8. La sorveglianza ed il controllo del siero nazionale standard e
dell'antigene sono effettuati dall'Istituto superiore di sanita',  su
ogni serie prodotta.