ALLEGATO 1
PROVE SIEROLOGICHE PER LA DIAGNOSI
DELLA BRUCELLOSI OVI-CAPRINA
Le prove sierologiche per la diagnosi della brucellosi degli ovini
e caprini sono rappresentate dalle reazioni di siero-agglutinazione
rapida con antigene al rosa bengala e di fissazione del complemento.
La siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa bengala puo'
essere utilizzata come prova per il controllo degli allevamenti ovini
o caprini ai fini del rilascio della qualifica di allevamenti
ufficialmente indenni o indenni da brucellosi.
Allorche' nel corso di tale ricerca mediante la prova con antigene
al rosa bengala piu' del 5% degli animali dell'azienda da' esito
positivo, viene praticato un controllo complementare su ogni animale
dell'azienda mediante una prova di fissazione del complemento.
La fissazione del complemento deve essere impiegata per l'esame
individuale degli ovini e caprini.
La fissazione del complemento puo' essere impiegata per gli
allevamenti ovini e caprini allo scopo di stabilire la qualifica di
allevamenti ufficialmente indenni o indenni da brucellosi.
A) SIERO-AGGLUTINAZIONE RAPIDA CON ANTIGENE AL ROSA BENGALA (SAR-Ag:
RB)
La reazione di SAR-Ag: RB deve essere applicata secondo le
seguenti norme tecniche:
1. Il siero di riferimento comunitario e' rappresentato dal
secondo siero internazionale standard anti-Brucella abortus, fornito
dal Central Veterinary Laboratory di Weybridge, Surrey, Inghilterra,
contenente 1000 unita' internazionali agglutinanti per millilitro
(Second Internazional Standard anti-Brucella abortus Serum: 2nd
ISaBS).
2. Il siero nazionale standard per il controllo della reazione
deve essere calibrato sul secondo siero internazionale standard anti-
Brucella abortus di Weybridge.
3. Il siero di lavoro, di origine ovina, per il controllo
giornaliero della reazione deve essere calibrato sul siero nazionale
standard.
4. L'antigene al rosa bengala e' unico su tutto il territorio
nazionale e deve essere:
- preparato con il ceppo B.abortus 99 o 1119 (USDA) o qualunque
altro ceppo di sensibilita' equivalente, in fase S;
- sospeso in tampone deve avere pH 3,65 (Piu' o Meno) 0,05 e
essere colorato mediante rosa bengala;
- controllato nei confronti di otto sieri liofilizzati
riconosciuti rispettivamente positivi e negativi;
- standardizzato in modo da dare una agglutinazione visibile
alla dil. 1:47,5 e da non dare agglutinazione alle dil. 1:50 del 2nd
ISaBS di Weybridge, U.K.;
- fornito pronto per l'uso e riportare sull'etichetta di
confezionamento il periodo di validita'.
5. La reazione di SAR-Ag: RB deve essere effettuata nel modo
seguente:
- porre una goccia (0,03 ml) di antigene a fianco di una goccia
(0,03 ml) del siero nativo in esame su di una piastra bianca;
- mescolare i due reagenti con una bacchetta di vetro o
plastica, prima in linea retta, poi tracciando dei cerchi del
diametro di 20-30 mm. circa;
- agitare manualmente la piastra con movimenti circolari oppure
servendosi di un oscillatore a movimenti rotatori, a velocita' di
circa 30 movimenti al minuto, per almeno 4 minuti;
- leggere la reazione in buone condizioni di illuminazione: in
mancanza di agglutinati la reazione sara' considerata negativa mentre
in presenza di qualsiasi grado di agglutinazione la reazione e'
considerata positiva, salvo quando appare chiara una eccessiva
essiccazione ai margini della reazione.
6. La siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa bengala
puo' essere allestita con apparecchiature automatiche.
7. La sorveglianza ed il controllo del siero nazionale standard e
dell'antigene sono effettuati dall'Istituto superiore di sanita', su
ogni serie prodotta.
B) FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO (F.d.C.)
La reazione di fissazione del complemento deve essere applicata
secondo le seguenti tecniche:
1. Il siero di riferimento comunitario e' il secondo siero
internazionale standard anti-B. abortus (2nd ISaBS) di Weybridge,
contenente 1000 unita' internazionali fissanti il complemento per
millilitro (UICFT/ml).
2. Il siero nazionale standard per il controllo della reazione
deve essere calibrato sul secondo siero internazionale standard di
Weybridge come per il punto 2, sez. A.
3. Il siero di lavoro, di origine ovina, per il controllo
giornaliero della reazione deve essere calibrato sul siero nazionale
standard come per il punto 3, sez. A.
4. Un siero in esame che contiene 20 o piu' unita' internazionali
fissanti il complemento e' considerato positivo.
5. L'antigene e' unico su tutto il territorio nazionale e deve
essere:
- preparato con il ceppo B. abortus 99 o 1119 (USDA) o qualunque
altro ceppo di sensibilita' equivalente, in fase S;
- sospeso in soluzione fisiologica 0,85 NaCl e fenolato;
- standardizzato rispetto il secondo siero internazionale stand-
ard di Weybridge (2nd ISaBS);
- fornito concentrato e sull'etichetta di confezionamento
riportare coefficiente di dil. e data di scadenza.
6. La reazione di F.d.C. deve essere effettuata secondo il
seguente schema unificato:
a) inattivare i sieri in esame, nativi o prediluiti, a 60C per
30';
b) diluire per raddoppio i sieri inattivati;
c) distribuire l'antigene alla diluizione d'uso;
d) distribuire 2 unita' di complemento;
e) agitare e porre in incubazione a 37C per 30';
f) aggiungere il sistema emolitico contenente 2 unita' di
emolisina ed una concentrazione del 2% di globuli rossi lavati, pari
a 54 x 10(elevato a 7) cellule per millilitro;
g) allestire i seguenti controlli di reazione:
- controllo del potere anticomplementare dei sieri;
- controllo dell'antigene;
- controllo del sistema emolitico;
- controllo delle unita' di complemento utilizzate;
- controllo di lettura % di emolisi;
- controllo del siero nazionale standard e del siero di lavoro
positivo;
- controllo del siero negativo;
h) agitare e porre in incubazione a 37C per 30';
i) verificare la qualita' dei controlli;
l) leggere il titolo dei sieri in esame, rappresentato dalla
piu' alta diluizione che ha determinato il 50% di emolisi o di
fissazione, e trasformare il titolo in unita' internazionali fissanti
il complemento.
7. La reazione puo' essere allestita con apparecchiature
automatiche.
8. La sorveglianza ed il controllo del siero nazionale standard e
dell'antigene sono effettuati dall'Istituto superiore di sanita', su
ogni serie prodotta.