IL MINISTRO DELLA SANITA'
Visto il decreto legislativo 25 gennaio 1992, n. 105, recante
disposizioni per l'attuazione della direttiva n. 80/777/CEE relativa
alla utilizzazione e alla commercializzazione delle acque minerali
naturali.
Visto in particolare l'art. 2, terzo comma, del citato decreto n.
105, che, ai fini del riconoscimento delle acque minerali naturali,
prevede l'emanazione di norme concernenti i metodi di analisi per la
valutazione delle caratteristiche microbiologiche e di composizione
delle acque minerali stesse e le modalita' per i relativi
prelevamenti di campioni.
Visto l'art. 34 del regio decreto 28 settembre 1919, n. 1924.
Visto l'art. 6, lettera t), della legge 23 dicembre 1978, n. 833.
Visti gli articoli 1 e 3 del D.C.G. 7 novembre 1939, n. 1856.
Sentito il parere del Consiglio superiore di sanita' in data 24
giugno 1992.
Decreta:
Art. 1.
Ai fini del riconoscimento delle acque minerali naturali, le
analisi microbiologiche debbono essere eseguite secondo le seguenti
modalita':
1) Carica microbica.
Seminare in Plate Count Agar (tecnica agar germi) aliquote da 1 ml
del campione in quattro piastre di Petri. Incubare due piastre a 37
C (Piu' o Meno) 1 per 24h (Piu' o Meno) 2h e due piastre a 20 C
(Piu' o Meno) 1 per 72h (Piu' o Meno) 2h. Procedere alla conta delle
colonie.
2) Coliformi in 250 ml:
A) Metodo con terreno liquido. Seminare due beute provviste di
campanula, contenenti ml 125 di brodo lattosato a tripla
concentrazione, rispettivamente con ml 250 del campione. Incubare a
37 C (Piu' o Meno) 1 per 48h (Piu' o Meno) 2h. Le beute positive
(torbidita' e presenza di gas) debbono essere sottoposte a subcolture
in brodo lattosato-bile verde brillante da incubare a 37 C (Piu' o
Meno) 1 per 48h (Piu' o Meno) 2h ed a 44 C (Piu' o Meno) 0,5 per
48h (Piu' o Meno) 2h. Dalle colture positive procedere 2h ed a 44 C
(Piu' o Meno) 0,5 per 48h (Piu' o Meno) 2h. Dalle colture positive
procedere all'isolamento su agar Mac Conkey e alle prove biochimiche
di conferma (H2S, indolo, ornitina decarbossilasi).
B) Metodo con membrane filtranti. Filtrare due aliquote di 250 ml
ciascuna di campione attraverso membrane filtranti (0.45u). Porre le
due membrane, rispettivamente, su piastre di "agar lattosato al
tergitolo 7" da incubare a 36 C (Piu' o Meno) 1 per 24h (Piu' o
Meno) 2h e di "agar lattosato al tergitolo 7 + cloruro di
trifeniltetrazolio" da incubare a 44 C (Piu' o Meno) 0,5 per 24h
(Piu' o Meno) 2h. Prelevare le colonie gialle su AT7 e quelle dal
giallo al rosso su AT7 + TTC e seminarle in brodo lattosato-bile
verde brillante da incubare rispettivamente a 36 C (Piu' o Meno) 1
per 48h (Piu' o Meno) 2h e a 44 C (Piu' o Meno) 0,5 per 48h (Piu' o
Meno) 2h. Dalle colture positive procedere alle prove di conferma
come per il metodo in terreno liquido.
3) Streptococchi fecali in 250 ml:
A) Metodo con terreno liquido. Seminare 2 beute contenenti ml 125
di brodo glucosio-azide a tripla concentrazione rispettivamente con
ml 250 del campione. Incubare a 37 C (Piu' o Meno) 1 per 48h (Piu'
o Meno) 2h. Le beute positive (intorbidamento del terreno) debbono
essere sottoposte alle prove di conferma mediante striscio in agar
bile esculina-azide. Inbubare a 44 C (Piu' o Meno) 0,5 per 44h
(Piu' o Meno) 4h. Considerare positive le colonie nere catalasi nega-
tive.
B) Metodo con membrane filtranti. Filtrare due aliquote di 250 ml
ciascuna del campione attraverso membrane filtranti. Porre le due
membrane, rispettivamente, su due piastre di "KF streptococcus agar"
da incubare a 37 C (Piu' o Meno) 1 per 44h (Piu' o Meno) 4h.
Sottoporre le colonie sospette, rosse o rosa, alle prove di conferma
come per il metodo in terreno liquido.
4) Spore di clostridi solfito-riduttori in 50 ml.
Riscaldare ml 50 del campione a 80 C per 10 minuti. Raffreddare
rapidamente e filtrare per membrana. Porre la membrana su agar SPS
ricoprendo con altri 10 ml di SPS a 45 C. Incubare a 37 C (Piu' o
Meno) 1 per 24h (Piu' o Meno) 1h in giare per anaerobiosi. La prova
viene considerata positiva quando si sviluppano colonie nere.
Identificazione presuntiva di Cl. perfrigens.
Prelevare le colonie sospette (nere) e seminarle in tubi contenenti
brodo tioglicollato previamente riscaldato a 100 C per 10 minuti e
rapidamente raffreddato. Incubare a 37 C (Piu' o Meno) 1 per 24h
(Piu' o Meno) 2h ed eseguire subcolture in:
agar nutritivo a becco di clarino, da incubare a 37 C (Piu' o
Meno) 1 per 24h (Piu' o Meno) 2h in giare per anaerobiosi, per
verificare la negativita' della catalisi;
provetta di latte tornasolato ricoperto con ml 2 di vaselina, da
incubare a 37 C (Piu' o Meno) 1 per 24-48h, per verificare
l'acidificazione e la formazione di coagulo frammentato.
5) Pseudomonas aeruginosa in 250 ml.
Filtrare ml 250 del campione e porre la membrana su agar-cetrimide.
Incubare a 37 C (Piu' o Meno) 1 per 48h (Piu' o Meno) 2h. Prelevare
le colonie sospette (verdi-bluastre e/o fluorescenti agli UV) e
trasferirle su nutrient agar a becco di clarino. Incubare a 42 C
(Piu' o Meno) 0,5 per 48h (Piu' o Meno) 2h. Dalla patina procedere:
alla verifica della positivita' della ossidasi su cartine alla
bimetil-p-fenilendiamina;
alla identificazione mediante "galleria" di test biochimici (API
20 NE o equivalenti).
Nei casi dubbi eseguire anche:
l'evidenziazione della produzione di piocianina a 30 C in terreno
di King A;
la prova di crescita in Nutrient broth in b.m. a 42 C (ripetuta
tre volte);
il test di ossidazione del glucosio a 37 C (Terreno al blu di
bromotimolo).
6) Staphilococcus aureus in 250 ml.
Filtrare ml 250 del campione e porre la membrana su Baird-Parker
agar. Incubare a 37 C (Piu' o Meno) 1 per 24h (Piu' o Meno) 2h.
Prelevare le colonie sospette (nere, generalmente con alone) e
seminarle in Brain-Heart infusion broth. Incubare a 37 C (Piu' o
Meno) 1 per 24h (Piu' o Meno) 2h. Dalla brodocoltura eseguire:
preparato microscopico previa colorazione di Gram;
semina in profondita' in provetta di agar di Mossel e Martin per
evidenziare il tipo respiratorio;
test della coagulasi.